Summary
Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevatten vaak microbiële stoffen die aangeboren immuunreacties activeren om allergische ontstekingen te reguleren. Het hier gepresenteerde protocol toont de identificatie aan van dsRNA-soorten in HDM-allergenen en karakterisering van hun immunogene activiteiten bij het moduleren van eosinofiele longontsteking.
Abstract
Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevinden zich vaak in complexe vormen die zowel allergische eiwitten bevatten die afwijkende reacties van type 2 en microbiële stoffen stimuleren die aangeboren immuunreacties veroorzaken. Deze allergeen-geassocieerde microbiële componenten spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de ontwikkeling van type 2 ontstekingsaandoeningen zoals allergische astma. De onderliggende mechanismen blijven echter grotendeels ongedefinieerd. Het hier gepresenteerde protocol bepaalt de structurele kenmerken en in vivo activiteit van allergeen-geassocieerd immunostimulatorium RNA. Specifiek, gemeenschappelijke allergenen worden onderzocht op de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten die IFN reacties in de longen kan stimuleren en de ontwikkeling van ernstige longeosinofilie in een muismodel van HDM-geïnduceerde allergische astma kunnen beperken. Hier hebben we de volgende drie tests opgenomen: Dot blot om de dsRNA-structuren in totale RNA-structuren te tonen die geïsoleerd zijn van allergenen, waaronder HDM-soorten, RT-qPCR om de activiteiten van HDM RNA in interferontimulerende genen (ISG's) expressie in muislongen en FACS-analyse te meten om de effecten van HDM RNA op het aantal eosinofielen in BAL en long te bepalen, respectievelijk.
Introduction
Op basis van de hygiënehypothese die Strachan1oorspronkelijk voorstelde , kan blootstelling aan milieumicrobiële factoren zoals endotoxine beschermen tegen de ontwikkeling van allergische aandoeningen2,3. Tijdens microbiële infecties, bijvoorbeeld virale infecties, activeert de aangeboren immuundetectie van vreemde nucleïnezuren (RNA/DNA) hostverdedigingsreacties4,5,6. Het bestaan en de prevalentie van immunogene nucleïnezuren zoals lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten in huisstofmijt (HDM) of andere insectenallergenen blijven echter onbekend. Dit protocol is ontworpen om te bepalen of HDM of insecten- en niet-insectenallergenen lange dsRNA-soorten bevatten die een beschermende immuunrespons kunnen activeren om de ontwikkeling van ernstige eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma tegen te gaan. Hier bieden we drie eenvoudige en snelle methoden om de structurele determinanten in HDM totaal RNA te evalueren die nodig zijn voor het reguleren van allergeen-geïnduceerde eosinofiele longontsteking.
Het slijmvlies immuunsysteem is het grootste immuunsysteem orgaan in het lichaam en dient als de eerste lijn van gastheer verdediging tegen zowel microbiële infecties en allergische beledigingen7,8. De lange dsRNA, de replicatie tussenliggende van vele virussen, staat bekend om te functioneren als een pathogen-geassocieerd moleculair patroon (PAMP) om krachtig te stimuleren aangeboren reacties via Toll like receptor 3 (TLR3) om de expressie van interferon gestimuleerd genen (ISG's)9,10,11,12,13,14induceren . We hebben onlangs aangetoond dat HDM totale RNA bevatte dsRNA structuren, die upregulated de expressie van ISG's en verminderde ernstige eosinofiele longontsteking wanneer toegediend via de intratracheale instillatie in een murine model van allergische astma geïnduceerd door HDM extracten15. De ernst van longontstekingen wordt bepaald door het analyseren van de immuunceltypen in bronchoalveolaire lavage (BAL) en longweefsel via flow cytometrie16,17,18,19,20.
Dit protocol bevat drie tests: 1) snelle detectie van dsRNA-structuren met RNA-puntvlek met behulp van een monoklonale antilichaam J2 van de muis, dat specifiek op een sequentieonafhankelijke manier aan het dsRNA (≥40bp) bindt; 2) snelle evaluatie van in vivo effecten van immunostimulatorium RNA in muislongen door het meten van de inductie van ISG's met behulp van RT-qPCR; 3) nauwkeurige kwantificering van eosinofielen in BAL en long in de context van HDM-geïnduceerde longontsteking met behulp van flow cytometrie analyse.
De bovenstaande testen kunnen worden gebruikt om niet alleen allergische longziekten te bestuderen, maar ook respiratoire bacteriële en virale infecties. Zo kan het dsRNA-specifieke J2-antilichaam ook worden gebruikt in andere toepassingen zoals immunoaffiniteitschromatografie, immunohistochemie, enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en immunostaining21,22,23. Bovendien kunnen verschillende toepassingen stroomafwaarts van BAL-vloeistofverzameling worden gebruikt voor het kwantificeren van oplosbare inhoud, zoals cytokines en chemokines met behulp van ELISA, en transcriptieprofilering van cellen in de luchtwegen (bijvoorbeeld alveolaire macrofagen). Hoewel er een verscheidenheid van protocollen beschikbaar in de literatuur om longaandoeningen te evalueren, de meeste van deze protocollen richten zich vaak op de doelvalidatie. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast om componenten in milieuallergenen te identificeren die belangrijk zijn voor het reguleren van de ontwikkeling van allergische ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures hier beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas Health San Antonio.
1. Dot blot om de aanwezigheid van dsRNA structuren in HDM totale RNA aan te tonen
- Totale RNA-isolatie van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen
- Zet HDM, insecten, of niet-insecten dieren levend verzameld of commercieel verkregen in 50 mL buizen, en snel bevriezen met vloeistof-N2. Bewaar vervolgens bij -70 °C voor de daaropvolgende totale RNA-isolatie.
OPMERKING: In dit experiment werden HDM-, insecten- en niet-insectendieren geselecteerd omdat ze bekend staan als veel voorkomende bronnen van allergenen. Verder blijft een immunostimulaatfunctie van hun RNA's onduidelijk. - Breng een behoorlijke hoeveelheid (gelijk aan 100 μL in volume of minder) HDM, insecten of niet-insecten dieren opgeslagen bij -70 °C over in een buis van 2 mL met kralen (1,4 mm keramische bollen) en vries buizen in een vloeibare-N2-container voor ~ 10 min.
- Voeg voor de totale RNA-isolatie 1 mL guanidinium thiocyanaat-gebaseerde RNA-isolatiereagens24 toe aan elke buis en breek vervolgens de kleine insecten en niet-insecten met een hoogenergetische celverstoorder met de maximale snelheid van 45 s en koel op ijs. Herhaal deze stap twee keer.
- Breng de oplossing van stap 1.1.3 over in een nieuwe buis van 1,5 mL en voeg 200 μL chloroform toe aan elke buis en vortex. Centrifugebuizen bij 14.000 x g gedurende 14 min bij 4 °C.
- Zodra de centrifugatie is voltooid, breng je de bovenste waterige fase (200 μL) over in een nieuwe 1,5 mL buis met 500 μL isopropanol om RNA-pellet neer te zetten. Verstoor de interfase niet. De aanbevolen volumeverhouding van de bovenste fase versus isopropanol is 1:2,5 verhouding.
- Meng door zachte vortexing, dan centrifuge buizen op 14.000 x g gedurende 14 min bij 4 °C.
- Spoel de supernatant voorzichtig aan en was vervolgens de RNA-pellet met 500 μL van 75% ethanol en centrifuge bij 7.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder alle vloeistof voorzichtig, droog de pellet aan de lucht en los de RNA-pellet op met 20-50 μL RNase-vrije H2O.
- Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer met behulp van de volgende parameters:
- Open de bijbehorende software en selecteer het type nucleïnezuren om te meten. Wijzig het voorbeeldtype in RNA.
- Voer de blanco meting uit met 1-2 μL RNase-vrij H2O. Veeg de RNase-vrije H2O af. Nu is het instrument klaar voor de meting.
- Laad 1-2 μL van het RNA-monster en meet de RNA-concentratie (μg/μL).
OPMERKING: De verhouding van de absorptie op 260 en 280 nm (A260/280) bij ~2.0 (1.9-2.2) wordt algemeen aanvaard als "zuiver" voor RNA. Als u niet onmiddellijk wordt verwerkt, slaat u RNA-monsters op -70 °C op en vermijdt u de vriesdooicycli om het RNA intact te houden.
- Zet HDM, insecten, of niet-insecten dieren levend verzameld of commercieel verkregen in 50 mL buizen, en snel bevriezen met vloeistof-N2. Bewaar vervolgens bij -70 °C voor de daaropvolgende totale RNA-isolatie.
- Detectie van dsRNA-structuur in het totale RNA met dsRNA-specifieke J2-antilichamen
- Bereid twee 20 μL RNA-monsters (200 ng/μL) voor. Een met RNase-III behandeling (1 μL voor 1 μg RNA, incubaat bij 37 °C gedurende 60 minuten), en de andere zonder RNase-III behandeling.
OPMERKING: RNase III wordt hier gebruikt om dsRNA specifiek te degraderen, maar niet enkelstrengsRNA 25. - Gebruik een potlood om rasters te tekenen waar RNA-monsters op het membraan worden uitgewist.
- Spot 2 μL van de 200 ng/μL van het RNA monster op het positief geladen nylon membraan.
- Crosslink de monsters aan het membraan bij 1.200 microjoule x 100 in een UV-crosslinker. Herhaal stap 1.2.3 en 1.2.4 nog twee keer op de plek van het monster. Dit resulteert in een totaal van 0,8 μg per vlek.
OPMERKING: Spot niet meer dan 2 μL RNA-monster op het membraan tegelijk. - Blokkeer niet-specifieke binding met 5% melk in TBS-T voor 1 uur met schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende oplossing uit stap 1.2.5 en voeg het anti-dsRNA J2-antilichaam toe bij de verdunning van 1:1.000 in 1% melk in TBS-T en incubbate 's nachts met schudden bij 4 °C.
- Was het membraan met TBS-T gedurende 5 minuten en herhaal deze stap 3 keer. Voeg het secundaire antilichaam (Alkaline fosphatase-conjugated Anti-Mouse IgG verdund in 1% melk 1:5.000) en incubeer gedurende 1 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Was het membraan met TBS-T gedurende 5 minuten en herhaal deze stap voor 3x.
- Voeg het substraat (BCIP/NBT) toe en broed gedurende 5-15 min tot een gewenst signaal zichtbaar is.
- Stop de reactie door het membraan te spoelen met ddH2O.
- Droog het membraan op tissuepapieren en maak een foto met een smartphone (een representatief resultaat wordt weergegeven in figuur 1).
- Bereid twee 20 μL RNA-monsters (200 ng/μL) voor. Een met RNase-III behandeling (1 μL voor 1 μg RNA, incubaat bij 37 °C gedurende 60 minuten), en de andere zonder RNase-III behandeling.
2. RT-qPCR om het vermogen van HDM totaal RNA te meten bij het stimuleren van de long-ISGs-expressie
- RNA isolatie van muizen longweefsels
OPMERKING: Muizen (vrouw, 8-12 weken oud, C57BL/6J) werden gehandhaafd onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden.- Verdoven het dier kort met isofluraan en toedien via de intratracheale instillatie met 5 μg (verdund in 80 μL PBS) HDM RNAs behandeld met of zonder RNase III.
- Na 16-18 uur na hdm RNA behandeling, offer de muis door CO2 inademing voor een paar minuten. Plaats vervolgens de muis op een platform en speld ledematen met naalden.
- Desinfecteer de muis met 70% ethanol en snijd de huid vanaf de buik naar de nek met een gesteriliseerde schaar.
- Bevestig de huid met naalden en snijd de ribben om de longen bloot te leggen. Verwijder de hele longen en was ze met koude PBS. Plaats de longen op tissuepapier en verdeel een klein stukje van elke longkwab in een buis van 2 mL met kralen (200-300 μL in volume, 1,4 mm keramische bollen).
OPMERKING: Het doel van het gebruik van keramische kralen is het malen van hele longweefsels - Vries de longmonsters door het plaatsen van buizen in een vloeistof-N2 container voor ~ 10 min.
- Voeg 500 μL guanidinium thiocyanaatgebaseerd RNA-isolatiereagens toe aan elke buis en breek de longweefsels met een homogenisator voor 45 s. Chill tussen elke stap op ijs. Herhaal deze stap twee keer.
- Volg de stappen 1.1.4- 1.1.7 voor longRNA isolatie.
- Droog de pellet aan en los de RNA-pellet op met de juiste hoeveelheid RNase-vrije H2O (~20-30 μL).
- Meet de RNA-concentratie zoals beschreven in stap 1.1.8.
- RT-qPCR om het vermogen van HDM RNA te bepalen bij het stimuleren van longgenexpressie.
- Met behulp van 100 ng/μL RNA uit longweefsels als sjabloon voert u de cDNA-synthese uit volgens het genoemde protocol26.
- Stel een RT-qPCR-reactie op 10 μL/put voor een 384-put plaat met behulp van cDNA gegenereerd boven en de gen-specifieke primer paren (Tabel 1 en Tabel 2).
- Sluit de putten goed af met een transparante kleeffolie en draai de plaat voor 30 s. Draai de plaat op 1.000 x g voor 30 s om monsters te verzamelen aan de onderkant van de putten.
- Laad de plaat op een RT-qPCR-machine en begin met het uitvoeren van de RT-qPCR-reactie met behulp van het thermische cycler-protocol(tabel 3).
- Exporteer de resultaten in een spreadsheetbestand of analyseer de gegevens met behulp van de software die door de productie wordt geleverd nadat het programma is voltooid (een representatief resultaat wordt weergegeven in figuur 2).
3. FACS-analyse om de effecten van HDM RNA op de infiltratie van eosinofielen in BAL en longen te bepalen
- BAL vloeistofopvang voor FACS-analyse
- Euthanaseer muizen (vrouwelijk, 8-12 weken oud, C57BL/6J) die werden behandeld met HDM allergeen extracten (volgens het experimentele ontwerp getoond in figuur 3B) door CO2 inademing.
- Plaats de muis op een platform en speld ledematen met naalden.
- Desinfecteer de muis met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de huid te snijden van het bovenste gebied van de buik naar de nek.
- Voorzichtig, trek de speekselklieren en de sternohyoid spier zorgvuldig uit elkaar met behulp van de tangen om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats een nylon string (~ 10 cm) onder de luchtpijp met behulp van tangen.
- Maak een incisie in de luchtpijp (~ 2 mm onder het strottenhoofd) net genoeg om een canule in te voegen. Snij niet door de luchtpijp. Knoop de string rond luchtpijp en canule.
- Laad de spuit met 1 mL PBS+EDTA en bevestig deze aan het einde van de canule. Injecteer 1 mL PBS+EDTA in de long en draag de oplossing volledig aan. Maak de spuit voorzichtig los van de canule en breng de oplossing over in een buis van 15 mL op ijs.
- Herlaad de spuit met de verse PBS+EDTA en herhaal deze stap 2x.
- Centrifugeren de buis met de gepoolde BAL verkregen in stap 3.1.7 om de cellen op 500 x g gedurende 7 min bij 4 °C te pelleteren. Neem het volume bal-vloeistof op en breng de supernatant over naar twee 1,5 mL-buizen zonder de pellet te storen.
OPMERKING: De supernatant van BAL kan worden opgeslagen bij -70 °C voor toekomstige analyse, bijvoorbeeld ELISA. - In het geval dat er RBC's aanwezig zijn in de pellet als gevolg van ernstige longontsteking, voeg na het verwijderen van de supernatant 500 μL RBC lyse buffer toe en meng goed door resuspensie. Breng de oplossing over in een nieuwe buis van 1,5 mL en centrifuge gedurende 7 minuten met een snelheid van 500 x g bij 4 °C.
- Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 150 μL facs buffer.
- Breng de 150 μL van het opnieuw opgetrokken monster in 96-putplaat en centrifuge de plaat gedurende 7 minuten met een snelheid van 500 x g bij 4 °C.
- Snel, omkeren van de plaat op weefselpapier om de cellen die zich op de bodem van de putten te verzamelen.
- Bevlek de cellen met antilichamen in FACS-buffer in aanwezigheid van 2,4G2-blokkerend antilichaam (2,5 μg / 100 μL). Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een donkere plaats.
- Na het bevlekken, centrifugeren de plaat om de cellen pellet op 500 x g gedurende 7 min bij 4 °C.
- Verwijder de kleuroplossing door de plaat op tissuepapier om te keren en vervolgens te wassen door opnieuw uit te geven met 100 μL FACS-buffer. Vervolgens u de plaat opnieuw centrifugeren op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C en de FACS-buffer verwijderen door de plaat op tissuepapier om te keren.
- Resuspend monsters in 150 μL facs buffer en breng monsters naar de FACS buizen met 350 μL FACS buffer. Voeg 25 μL telkralen toe aan elk monster. Monsters zijn nu klaar voor flow cytometrie analyse.
OPMERKING: Verschillende celtypen in BAL-vloeistof werden aangeduid met antilichamen. Telkralen zijn toegevoegd voordat de FACS werd uitgevoerd. Flow cytometriegegevens werden geanalyseerd met behulp van een commercieel beschikbare software. Zie figuur 3 en tabel 4 voor de gatingstrategie.
- Spijsvertering van longweefsel voor de FACS-analyse
- Volg de stappen 3.1.1 - 3.1.3.
- Snijd de huid vanaf de buik naar de nek met een gesteriliseerde schaar. Bevestig de huid met naalden en snijd de ribben om de longen bloot te leggen.
- Verwijder de hele longen en was ze met koude PBS. Plaats monsters in de 1,5 mL buis met 50 μL longverteringsoplossing.
- Hak de longweefsels in kleine stukjes met een gebogen schaar. Breng de longweefsels in een 6-well plaat, voeg dan 8 mL long spijsvertering oplossing. Leg de plaat 45 minuten op een shaker in een couveuse van 37 °C.
- Gebruik na incubatie de bovenkant van 1,5 mL buis om de longweefsels te malen. Plaats een 70 μm strainers op een nieuwe 6-well plaat en breng het monster aan via een filter van 0,22 μm.
- Breng de gefilterde oplossing in een buis van 15 mL en centrifugeer de buizen vervolgens op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Aspirate de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van RBC lysis buffer en laat het op ijs voor 3 min.
- Breng het monster in een buis van 1,5 mL en centrifuge op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Herhaal 2x
- Was de longcellen 2x met 1 mL FACS buffer. Aspirate de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van FACS buffer, en vervolgens overdracht 100 μL van het monster in 96 put plaat.
- Centrifugeren de plaat gedurende 7 minuten bij een snelheid van 500 x g bij 4 °C. Volg de stappen beschreven in BAL vloeistofverzameling voor FACS-analyse (3.1.13 tot 3.1.16) om de cellen van verteerde longweefselmonsters te bevlekken.
OPMERKING: Eosinofielen in de longen werden gelabeld met antilichamen zoals aangegeven, vervolgens gemengd met het tellen van kralen voor verdere FACS-analyse. Flow cytometrie gegevens werden geanalyseerd met behulp van bijbehorende software. Raadpleeg figuur 3 voor de evaluatie van HDM RNA-geïnduceerde immuunreacties.
4. Statistische analyse
- Statistische analyses uitvoeren met behulp van een commercieel beschikbare software.
- Bepaal de p-waarden op onbetaalde tweestaartstudenten t-toets voor de vergelijking van twee groepen.
- Bereken de absolute aantallen eosinofielen op basis van referentiekralen (bovenste paneel) met behulp van de formule
- Bepaal de p-waarden aan de hand van tweerichtings-ANOVA- en Sidak-test voor de vergelijking van meer dan twee groepen.
- Beschouw een p-waarde kleiner dan 0,05 als statistisch significant. De p-waarden worden aangegeven op percelen als *p <0,05, **p<0.01, ***p<0,001 en ****p<0,0001.
LET OP: Alle bufferrecepten zijn opgenomen in tabel 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De aanwezigheid van lange dsRNA-structuren in HDM, insecten en niet-insect kleine dieren werd onderzocht door dot vlek met behulp van een dsRNA-specifieke muis monoklonale antilichaam J2 (≥ 40bp). RNase III werd gebruikt om dsRNA te verteren tot 12-15 bp dsRNA-fragmenten, die niet op te sporen waren door J2 (figuur 1).
Het vermogen van HDM total RNA om een aangeboren immuunrespons in muislongen op een dosisafhankelijke manier te stimuleren, werd geanalyseerd door RT-qPCR(figuur 2, boven). De RNase III-behandeling schafte de immunostimulerende activiteit van HDM total RNA af, wat aangeeft dat dsRNA-structuren in hdm-totaal RNA essentieel zijn voor aangeboren immuunactiviteit in de longen(figuur 2, lager).
De remmende effecten van HDM total RNA op de ontwikkeling van een ernstige type 2 longontsteking werden geëvalueerd met de FACS-analyse(figuur 3A). In deze studie werd de eosinofiele longontsteking veroorzaakt door HDM-extracten, die werden behandeld met of zonder RNase III zoals afgebeeld in het experimentele ontwerp(figuur 3B). RNase III behandeling werd gebruikt om lange dsRNA soorten te verwijderen uit HDM extracten. Zoals verwacht, de afbraak van lange dsRNA soorten resulteerde in ernstige type 2 longontsteking weerspiegeld door de verhoogde eosinofielen nummers in BAL en longen. Met name het aantal eosinofielen in de totale RNA-behandelde groep van HDM is vergelijkbaar met de groep die wordt behandeld met het oorspronkelijke HDM-extract dat endogene de lange dsRNA-soort bevat (figuur 3B).
Figuur 1: Detectie van de dsRNA-structuren in HDM RNAs door dsRNA-specifieke J2 Ab met behulp van dot blot. Total RNA uit verschillende aeroallergens waaronder Dermatophagoides farinae (D.f.) en Dermatophagoides pteronyssinus (D.p.) werd uitgewist op een nylon membraan voor de detectie van dsRNA(linkerpaneel). HDM (D.f. en D.p.) RNA bleef onbehandeld (-), behandeld met RNase III (dsRNA-specifieke nuclease) en RNase T1 (ssRNA-specifieke nuclease)(rechterpaneel). Dit cijfer is herdrukt uit She et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Inductie van ISG mRNA-expressie door totaal RNA van HDM (D.f.) werd gemeten door RT-PCR. Bij levering in muislongen kon HDM RNA de expressie van ISG's op een dosisafhankelijke manier stimuleren(bovenste paneel). RNase III behandeling elimineerde de immuunstimulerende activiteit van HDM RNA(lager paneel). Dit cijfer is herdrukt uit She et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van specifieke celtypen in de luchtwegen en evaluatie van BAL-vloeistof en longeosinofielen. (A) Gating-strategie die wordt gebruikt om cellen te identificeren die zijn teruggevonden uit BAL-vloeistof, werden gekleurd voor celoppervlakmarkers, zoals aangegeven. (B) Toediening van HDM (D.f.) RNA bij 5 μg/muis (blauwe staaf) versus controlemuislongRNA (rode balk). HDM (D.f.) RNA maar niet dsRNA-uitgeput HDM-extract verminderde het aantal eosinofielen in zowel luchtwegen als longen van dieren die met HDM-extract werden behandeld. Dit cijfer is herdrukt uit She et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Muis Primers | Volgorde (Vooruit-Achteruit, 5'→3') | |
| RPL19 RPL19 | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| IL1β | TCTATACCTGTCCTGTGTG; GCTTGTGCTCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT |
|
| ISG15 ISG15 | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTCTT |
|
| Mx1 Mx1 | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 OASL2 | GGATGCCTGGGAGAGAATCG; TCGCCTGCTCTTCGAAACTG |
|
| TNFα TNFα | CCTCCCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tabel 1: RT-qPCR Primers.
| Reagentia | Volume (10 μl) | |
| Universele SYBR Groene supermix (2x) | 5 μl | |
| Voorwaartse en omgekeerde primers (5 μM) | 1 μl | |
| cDNA-sjabloon | 0,4 μl | |
| DNase- en RNase-vrije H2O | 3,6 μl | |
Tabel 2: Master mix setup voor RT-qPCR.
| Stappen | Temperatuur | Tijd |
| Stap 1 | 95 oC | 3 minuten |
| Stap 2 | 95 oC | 10 seconden |
| Stap 3 | 55 oC | 30 seconden |
| Stap 4 | Ga naar stap 2(Herhaal 2-3 voor 39 cycli) | |
| Stap 5 (Smeltcurve) | 55 oC tot 95 oC | 0,5 oC, stappen (wachttijd is 5 seconden) |
Tabel 3: Programma voor het uitvoeren van de RT-qPCR.
| 1. Maak een plot bestaande uit voorwaartse (FSC) en side scatter (SSC). |
| 2. Maak een klein perceel voor het tellen van kralen (FSC laag, FITC hoog). |
| 3. Maak een plot om alleen poort voor levende cellen, terwijl met uitzondering van dode cellen met behulp van BV510 kleurstof. |
| 4. Live cellen kunnen dan worden gescheiden in CD11c hoge en CD11c lage populaties. |
| 5. Van CD11c hoge bevolking poort voor macrofagen (SiglecF hoge MHCII laag) en DC's (SiglecF laag, MHCII hoog). |
| 6. Van CD11c lage poort voor T-cellen (CD3/19 hoog, MHCII laag), en B-cellen (CD3/19 hoog, MHCII hoog). |
| 7. Van CD11c lage CD3/19null celbevolking, poort voor neutrophils (CD11b hoog, Ly-6G hoog) en Eosinophils (CD11b hoog, Ly-6G laag, Hoog SiglecF). |
| 8. Voor gating strategie van Eosinofielen in de longweefsels, gebruik deze markers aftere met uitzondering van dode cellen met behulp van BV510 kleurstof (CD45, SiglecF, CD11C). |
Tabel 4: FACS uitgevoerd
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl |
| pH 7.5 |
| TBS-T: |
| 0,05% Tween-20 in TBS |
| Buffer blokkeren |
| 5% vetvrije melk verdund in TBS-T |
| Antilichaamverdunningsbuffer |
| 1% vetvrije melk verdund in TBS-T |
| PBS+EDTA |
| 1x PBS + 0,1 mM EDTA |
| FACS-buffer |
| 2% Foetale Kalf serum (FCS) in 1x PBS |
| Totaal celmedium |
| RPMI 1640, 1X Glutamax, 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol en Penicilline-Streptomycine. |
| Oplossing voor de spijsvertering van de longen |
| Totaal celmedium plus Liberase (50 μg/ml) en DNase I (1 μg/ml) |
Tabel 5: Recepten voor buffers en oplossing
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft hoe de immunostimulerende eigenschappen van allergeen-geassocieerd microbiële RNA en hun effecten op de ontwikkeling van eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma te evalueren. Hoewel lange dsRNAs bekend staan als de replicatie tussenproducten van vele virussen die krachtig interferonreacties in zoogdiercellen kunnen activeren, zijn hun aanwezigheid in HDM-allergenen onbekend tot ons recente werk15. De combinatie van RNA dot blot, RT-qPCR en FACS analyse gepresenteerd in dit manuscript kan een goed voorbeeld zijn om aangeboren componenten te ontleden, zoals de dsRNA soorten in milieuallergenen die kritisch betrokken zijn bij het reguleren van allergeen-geïnduceerde eosinofiele ontsteking.
In dit protocol is de RNA dot bvel gebruikt om de aanwezigheid van dsRNA-structuren in natuurlijke allergenen te detecteren met behulp van een monoklonal antilichaam J2 van de muis, dat zich specifiek bindt aan het dsRNA (≥40bp) onafhankelijk van de sequentie. Deze methode is zeer betrouwbaar omdat J2-antilichaam nog steeds dsRNA-monsters kan herkennen die met RNase T1 zijn behandeld (enkelstrengs RNA-specifieke endonuclease), maar geen monsters die voorbehandeld zijn met RNase III (een dsRNA-specifieke endonuclease). Het is echter de moeite waard erop te wijzen dat een veelgebruikt synthetisch analoog van dsRNA, Polyinosinic:polycytidylic zuur [Poly(I:C)], is gemeld te binden aan een ander anti-dsRNA monoklonale antilichaam K1, in plaats van J221,22,23. Daarom wordt het gebruik van J2-antilichaam voor de detectie van Poly(I:C) niet aanbevolen.
Celtypeanalyse op monsters verzameld uit BAL of longweefsels is nuttig voor het beoordelen van de progressie van allergische longontsteking. Hoewel bal-procedure een veel voorkomende techniek is, kunnen de resultaten verschillen tussen onderzoekslaboratoria. Tal van factoren kunnen leiden tot deze variaties, zoals de hoeveelheid bronchoalveolaire lavage verzameld. Het ideale volume bal hersteld van een 8-12 weken oude muizen is ~3 ml19. Een andere factor die kan bijdragen aan het gebrek aan reproduceerbaarheid is hoe diep de katheter moet worden ingebracht in de luchtpijp (~ 0,5 cm is optimaal), omdat een diepere invoeging van de katheters schade aan de luchtpijp kan veroorzaken. Daarnaast moeten onderzoekers ook rekening houden met andere factoren zoals de leeftijd, stam en het geslacht van de muizen, omdat deze factoren een grote invloed kunnen hebben op de resultaten van het experiment27,28,29.
Hier bieden we een technisch protocol om immunomodulatorische effecten van HDM RNA in vitro en in vivo te karakteriseren met RNA dot blot, RT-qPCR en FACS analyse van BAL en longweefsels. Goede praktijken kunnen zorgen voor een succesvolle reproduceerbaarheid van de resultaten verkregen bij het uitvoeren van deze technieken. Probeer bijvoorbeeld de besmetting van RNases te voorkomen bij het uitvoeren van RNA dot blot. Ook moet de centrifugatiesnelheid goed worden aangepast, omdat de onnodige hogere centrifugatiesnelheid de levensvatbaarheid van cellen in gevaar kan brengen. Ten slotte moeten cellen die worden gebruikt voor de FACS-analyse worden vastgesteld als ze niet op dezelfde dag worden geanalyseerd.
Aangezien aangeboren immuniteit een cruciale rol speelt bij de afweer en ontsteking2,3,zullen de in dit document beschreven technieken en methoden zeer nuttig zijn voor het bestuderen van de immunomodulatory rol van andere aangeboren immuuncomponenten zoals microbiële DNA in natuurlijke allergenen in de ontwikkeling van type 2-ontsteking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw Karla Gorena voor technische bijstand bij stroomcytometrie. L.S. wordt ondersteund door de China Scholarship Council en Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. wordt ondersteund door de afdeling Klinische Laboratoriumwetenschappen, Hogeschool voor Toegepaste Medische Wetenschappen, Jouf University, Sakaka, Saoedi-Arabië. X.D.L. wordt ondersteund door het UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund en het Max en Minnei Voelcker Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
- ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
- IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
