Summary
Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle alerjik iltihabı düzenlemek için doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını aktive mikrobiyal maddeler içerir. Burada sunulan protokol HDM alerjenlerinde dsRNA türlerinin tanımlanmasını ve eozinofilik akciğer iltihabının modüle edilmesinde immünojenik faaliyetlerinin karakterizasyonunu göstermektedir.
Abstract
Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle anormal tip 2 yanıtları sürücü alerjik proteinler ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtları neden mikrobiyal maddeler hem içeren karmaşık formlarda bulunmaktadır. Bu alerjen ilişkili mikrobiyal bileşenler, alerjik astım gibi tip 2 inflamatuar koşulların gelişimini düzenleyen önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, altta yatan mekanizmalar büyük ölçüde tanımsız kalır. Burada sunulan protokol, alerjenilişkili immünsülatör RNA'nın yapısal özelliklerini ve in vivo aktivitesini belirler. Özellikle, ortak alerjenler akciğerlerde IFN yanıtlarını uyarabilir ve HDM kaynaklı alerjik astım bir fare modelinde şiddetli akciğer eozinofili gelişimini dizginlemek çift iplikli RNA (dsRNA) türlerinin varlığı için incelenir. Burada, aşağıdaki üç tahlilleri dahil ettik: HDM türleri de dahil olmak üzere alerjenlerden izole toplam RNA dsRNA yapıları göstermek için nokta leke, RT-qPCR interferon uyarıcı genlerde HDM RNA faaliyetlerini ölçmek için (ISGs) fare akciğerlerve FACS analizinde HDM RNA etkilerini belirlemek için BAL ve akciğer, sırasıyla.
Introduction
Hijyen hipotezi başlangıçta Strachantarafındanönerilen 1 , endotoksin gibi çevresel mikrobiyal faktörlere erken çocukluk maruz kalma alerjik bozuklukların gelişimine karşı koruyabilirsiniz2,3. Mikrobiyal enfeksiyonlar sırasında, örneğin, viral enfeksiyonlar, yabancı nükleik asitlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti (RNA / DNA) konak savunma yanıtlarıtetikler 4,5,6. Ancak, ev tozu akarları (HDM) veya diğer böcek alerjenlerinde uzun çift iplikli RNA (dsRNA) türleri gibi immünojenik nükleik asitlerin varlığı ve yaygınlığı bilinmemektedir. Bu protokol, HDM veya böcek ve böcek dışı alerjenlerin bir fare modelinde şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı gelişimini etkisiz hale getirmek için koruyucu bir bağışıklık yanıtını aktive edebilen uzun dsRNA türleri içerip içermediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Burada, alerjen kaynaklı eozinofilik akciğer iltihabını düzenlemek için gerekli olan HDM toplam RNA yapısal belirleyicileri değerlendirmek için üç basit ve hızlı yöntem sağlar.
Mukozal bağışıklık sistemi vücuttaki en büyük bağışıklık organıdır ve hem mikrobiyal enfeksiyonlara hem de alerjik hakaretlere karşı ev sahibi savunmanın ilk satırı olarak hizmet vermektedir7,8. Uzun dsRNA, birçok virüsün replikasyon ara, bir patojen ilişkili moleküler desen olarak işlev bilinmektedir (PAMP) güçlü reseptör gibi Toll aracılığıyla doğuştan gelen tepkileri uyarmak için 3 (TLR3) interferon uyarılmış genlerin ekspresyonu ikna etmek için (ISGs)9,10,11,12,13,14. Son zamanlarda HDM toplam RNA dsRNA yapıları içerdiğini göstermiştir, Hangi ISGs ekspresyonu upregulated ve HDM özleri tarafından indüklenen alerjik astım bir murine modelinde intratrakeal instillasyon yoluyla uygulandığında şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı azaltılmış15. Akciğer iltihaplarının şiddeti, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer dokusunda kantisat hücre tiplerinin akış sitometrisi16,17,18,,19,20ile analiz edilerek belirlenir.
Bu protokol üç tahlil içerir: 1) rna nokta lekeli dsRNA yapılarının hızlı bir şekilde saptanması, özellikle dsRNA'ya (≥40bp) diziden bağımsız bir şekilde bağlanan bir fare monoklonal antikor J2 kullanarak; 2) RT-qPCR kullanarak ISG'lerin indüksiyonölçerek fare akciğerlerinde immünsülatör RNA in vivo etkileri için hızlı değerlendirilmesi; 3) hdm kaynaklı akciğer iltihabı bağlamında BAL ve akciğer eozinofiller doğru nicel akış sitometri analizi kullanarak.
Yukarıdaki tahliller sadece alerjik akciğer hastalıkları, aynı zamanda solunum bakteriyel ve viral enfeksiyonları incelemek için kullanılabilir. Örneğin, dsRNA spesifik J2 antikor da immünaffinity kromatografi, immünohistokimya, enzim ekine bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ve immünostaining21,,22,23gibi diğer uygulamalarda kullanılabilir. Buna ek olarak, BAL sıvı toplama nın alt akışında, ELISA kullanarak sitokinler ve kemokinler gibi çözünür içeriğin ölçülmesi ve hava yollarında hücrelerin transkripsiyonel profilinin (örn. alveoler makrofajlar) ölçülmesi için çeşitli uygulamalar kullanılabilir. Literatürde akciğer koşullarını değerlendirmek için çeşitli protokoller bulunmasına rağmen, bu protokollerin çoğu genellikle hedef doğrulamaya odaklanır. Burada açıklanan prosedürler alerjik hastalıkların gelişimini düzenleyen önemli olan çevresel alerjenlerde bileşenleri belirlemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan deneysel prosedürler Texas Üniversitesi Sağlık San Antonio Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. HDM toplam RNA dsRNA yapıların varlığını göstermek için nokta leke
- Alerjenlerden, böceklerden ve böcek dışı alerjenlerden toplam RNA izolasyonu
- HDM, böcekler veya böcek olmayan hayvanlar canlı toplanan veya ticari olarak elde 50 mL tüpler içine koyun ve hızlı bir şekilde sıvı-N2ile dondurun. Daha sonra toplam RNA izolasyonu için -70 °C'de saklayın.
NOT: Bu deneyde, HDM, böcek ve böcek olmayan hayvanlar alerjenlerin ortak kaynakları olarak bilindiği için seçilmiştir. Ayrıca, rna bir immünstimülans fonksiyonu belirsizliğini koruyor. - -70 °C'de saklanan HDM, böcekler veya böcek olmayan hayvanların uygun bir miktarını (hacim olarak 100°L veya daha az) boncuk (1,4 mm seramik küreler) içeren 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpleri ~10 dakika boyunca sıvı-N2 kabında dondurun.
- Toplam RNA izolasyonu için, her tüpe 1 mL guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA izolasyonreaktifi 24 ekleyin, sonra 45 s ve buz üzerinde soğuk maksimum hızda yüksek enerjili hücre bozucu ile böcek ve böcek olmayan küçük hayvanlar kırmak. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Çözeltiyi adım 1.1.3'ten yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve her tüp ve girdap için 200 μL kloroform ekleyin. 4 °C'de 14 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj tüpler.
- Santrifüj tamamlandıktan sonra, üst sulu fazı (200 μL) RNA peletini çökeltmek için 500 μL izopropanol içeren yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. İnterfazı rahatsız etmeyin. Üst fazın izopropanol karşı önerilen hacim oranı 1:2.5 oranıdır.
- 4 °C'de 14 dakika boyunca 14.000 x g'de hafif girdap, sonra santrifüj tüpleri ile karıştırın.
- Supernatant'ı dikkatli bir şekilde aspire edin ve RNA peletini %75 etanol ve santrifüj ile yıkayın 7.500 x g'de 4 °C'de 10 dakika. Tüm sıvıyı dikkatli bir şekilde çıkarın, peleti havayla kurutun ve RNA peletini 20-50 μL RNase içermeyen H2O ile eritin.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak RNA konsantrasyonu bir spektrofotometre ile ölçün:
- İlişkili yazılımı açın ve ölçmek için nükleik asit türünü seçin. Örnek türünü RNA olarak değiştirin.
- Boş ölçümü RNase içermeyen H 2 O.'nun RNase içermeyen H2O'sunu1-2μL ile gerçekleştirin. Şimdi, alet ölçüm için hazır.
- RNA numunesinin 1-2 μL'sini yükleyin ve RNA konsantrasyonu (μg/μL) ölçün.
NOT: Absorbans oranı 260 ve 280 nm (A260/280) ~ 2.0 (1.9-2.2) genellikle RNA için "saf" olarak kabul edilir. Hemen işlenmezse, RNA örneklerini -70 °C'de saklayın ve RNA'yı bozulmadan tutmak için donma-çözülme döngülerinden kaçının.
- HDM, böcekler veya böcek olmayan hayvanlar canlı toplanan veya ticari olarak elde 50 mL tüpler içine koyun ve hızlı bir şekilde sıvı-N2ile dondurun. Daha sonra toplam RNA izolasyonu için -70 °C'de saklayın.
- DSRNA spesifik J2 antikor kullanılarak toplam RNA'daki dsRNA yapısının saptanması
- İki adet 20 μL RNA numunesi (200 ng/μL) hazırlayın. Biri RNase-III tedavisi (1 μL için 1 μL, 37 °C'de 60 dakika kuluçka) ve diğeri rnase-III tedavisi olmadan.
NOT: RNase III burada özellikle dsRNA'yı düşürmek için kullanılır, ancak tek iplikli RNA25değildir. - RNA örneklerinin membranüzerinde lekeli olacağı ızgaraları çizmek için bir kalem kullanın.
- RNA örneğinin 200 ng/μL'sinin pozitif yüklü naylon membranüzerine nokta 2 μL'si.
- 1.200 microjoule x 100 uv crosslinker örnekleri membrana çapraz bağla. Örnek nokta yerinde 1.2.3 ve 1.2.4 adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Bu, leke başına toplam 0,8 μg sonuçlanır.
NOT: Membranda bir seferde 2 μL'den fazla RNA örneğini tespit etmeyin. - Oda sıcaklığında sallayarak 1 saat tbs-T% 5 süt ile spesifik olmayan bağlama blok. Blokaj çözeltisini adım 1.2.5'ten çıkarın ve TBS-T'de %1 sütte 1:1.000 seyreltme de anti-dsRNA J2 antikorekleyin ve gece boyunca 4 °C'de sallayarak tüplü olarak yerleştirin.
- Membranı 5 dakika TBS-T ile yıkayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. İkincil antikor (Alkalin fosfataz konjuge Anti-Mouse IgG% 1 süt 1:5,000 seyreltilmiş) ekleyin ve oda sıcaklığında bir shaker üzerinde 1 saat kuluçka. Membranı 5 dakika TBS-T ile yıkayın ve bu adımı 3x boyunca tekrarlayın.
- İstediğiniz sinyal görünene kadar substrat (BCIP/NBT) ekleyin ve 5-15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Membranı ddH2O ile durulayarak reaksiyonu durdurun.
- Membranı doku kağıtları üzerinde kurutun ve akıllı telefon kullanarak fotoğraf çekin (temsili bir sonuç Şekil 1'degösterilmiştir).
- İki adet 20 μL RNA numunesi (200 ng/μL) hazırlayın. Biri RNase-III tedavisi (1 μL için 1 μL, 37 °C'de 60 dakika kuluçka) ve diğeri rnase-III tedavisi olmadan.
2. RT-qPCR akciğer ISGs ekspresyonu uyarıcı HDM toplam RNA yeteneğini ölçmek için
- Farelerin akciğer dokularından RNA izolasyonu
NOT: Fareler (dişi, 8-12 haftalık, C57BL/6J) spesifik patojensiz koşullarda muhafaza edildi.- Kısaca hayvanı isoflurane ile uyuşdurun ve RNase III ile veya rnase III ile veya olmadan tedavi edilen HDM RNA'ların 5 g (80 μL PBS'de seyreltilmiş) ile intratrakeal instillasyon yoluyla uygulayın.
- 16-18 saat sonrası HDM RNA tedavisinden sonra fareyi CO2 soluma ile birkaç dakika feda edin. Daha sonra fareyi bir platforma yerleştirin ve uzuvları iğnelerle sabitle.
- Fareyi %70 etanol ile dezenfekte edin ve karından başlayarak boynuna kadar olan deriyi sterilize edilmiş bir makasla kesin.
- İğneler ile deri düzeltmek ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburga kesti. Tüm akciğerleri çıkarın ve soğuk PBS ile yıkayın. Akciğerleri doku kağıtlarına yerleştirin ve her akciğer-lobunun küçük bir parçasını boncuk içeren 2 mL'lik bir tüpe (hacim olarak 200-300 μL, 1,4 mm seramik küreler) boşaltın.
NOT: Seramik boncuk kullanmanın amacı tüm akciğer dokularını öğütmektir. - ~10 dk için bir sıvı-N2 konteyner içine tüpler yerleştirerek akciğer örnekleri dondurun.
- Her tüpe 500 μL guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA izolasyon reaktifi ekleyin ve her adım arasında 45 s. Chill buz üzerinde bir homogenizer ile akciğer dokuları kırmak. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Akciğer RNA izolasyonu için 1.1.4- 1.1.7 adımlarını takip edin.
- Peleti hava kurutun ve RNA peletini uygun miktarda RNase içermeyen H2O (~20-30 μL) ile çözün.
- Adım 1.1.8'de açıklandığı gibi RNA konsantrasyonu ölçün.
- RT-qPCR akciğer gen ekspresyonunu uyaran HDM RNA yeteneğini belirlemek için.
- Şablon olarak akciğer dokularından çıkarılan 100 ng/μL RNA kullanarak, başvurulan protokol26'yagöre cDNA sentezini gerçekleştirin.
- Yukarıda üretilen cDNA ve genlere özgü astar çiftlerini kullanarak 384 kuyulu bir plaka için 10 μL/iyi bir RT-qPCR reaksiyonu ayarlayın(Tablo 1 ve Tablo 2).
- Kuyuları şeffaf bir yapışkan filmle sıkıca kapatın ve plakayı 30 s. Kuyuların alt kısmında numune toplamak için 30 s'de 1.000 x g'de çevirin.
- Plakayı bir RT-qPCR makinesine yükleyin ve termal döngü protokolünü kullanarak RT-qPCR reaksiyonu çalıştırmaya başlayın(Tablo 3).
- Sonuçları bir elektronik tablo dosyasına dışa aktarın veya program tamamlandıktan sonra üretim tarafından sağlanan yazılımı kullanarak verileri analiz edin (temsili sonuç Şekil 2'degösterilir).
3. HDM RNA'nın BAL ve akciğerde eozinofil infiltrasyonu üzerine etkilerini belirlemek için FACS analizi
- FACS analizi için BAL sıvı toplama
- HDM alerjen ekstreleri (Şekil 3B'degösterilen deneysel tasarıma göre) CO2 inhalasyonu ile tedavi edilen ötenazi fareleri (dişi, 8-12 haftalık, C57BL/6J).
- Fareyi bir platforma yerleştirin ve uzuvları iğnelerle sabitle.
- Fareyi %70 etanol ile dezenfekte edin. Boynun üst kısmından deri kesmek için makas kullanın.
- Yavaşça, tükürük bezleri ve sternohyoid kas dikkatle ayrı trakea ortaya çıkarmak için forceps kullanarak çekin. Forceps kullanarak nefes borusu altında bir naylon dize (~ 10 cm) yerleştirin.
- Trakeada bir kesi yapın (gırtlak altında ~2 mm) sadece bir kanül eklemek için yeterli. Nefes borusunu kesmeyin. Trakea ve kanül etrafındaki ipi düğümle.
- Şırıngayı 1 mL PBS+EDTA ile yükleyin ve kanülün ucuna takın. Akciğere 1 mL PBS+EDTA enjekte edin ve çözeltiyi tamamen aspire edin. Şırıngayı kanülden dikkatlice ayırın ve çözeltiyi buz üzerinde 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Şırıngayı taze PBS+EDTA ile yeniden yükleyin ve bu adımı 2kat tekrarlayın.
- 3.1.7 adımda elde edilen havuzlu BAL'ı içeren tüpü, 4 °C'de 7 dk için 500 x g'de hücreleri peletlemek için santrifüj edin. BAL sıvısının hacmini kaydedin ve peleti bozmadan süpernatantı iki 1,5 mL tüpe aktarın.
NOT: BAL'ın süpernatant'ı ileride analiz için -70 °C'de saklanabilir. - Ağır akciğer iltihabı nedeniyle peletmevcut rBC'ler varsa, supernatant çıkardıktan sonra, 500 μL RBC lysis tampon ekleyin ve resuspension ile iyice karıştırın. 4 °C'de 500 x g hızla 7 dk'ya yeni bir 1,5 mL tüp ve santrifüj içine çözeltiyi aktarın.
- Supernatant çıkarın ve FACS tampon 150 μL pelet resuspend.
- Resuspended numunesinin 150 μL'sini 96 kuyulu plakaya aktarın ve plakayı 4 °C'de 500 x g hızda 7 dakika santrifüj edin.
- Hızlı bir şekilde, kuyuların dibinde bulunan hücreleri toplamak için doku kağıtları üzerinde plaka ters.
- 2.4G2 bloke antikor (2.5 μg / 100 μL) varlığında FACS tampon antikorları ile hücreleri leke. Karanlık bir yerde 30 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka.
- Boyama sonra, 4 °C'de 7 dakika için 500 x g hücreleri pelet plaka santrifüj.
- Kağıt mendil üzerinde plaka ters çevirerek boyama çözeltisi çıkarın ve 100° L FACS tamponu ile yeniden sususpend ederek yıkayın. Daha sonra, 4 °C'de 7 dakika için 500 x g'de plakayı tekrar santrifüj edin ve plakayı kağıt mendil inverting ederek FACS tampon kaldırın.
- Numuneleri 150 μL FACS tamponuna yeniden askıya alın ve numuneleri 350 μL FACS tamponu içeren FACS tüplere aktarın. Her örneğe 25 μL sayma boncuk ekleyin. Numuneler akış sitometri analizi için hazır.
NOT: BAL sıvısındaki çeşitli hücre tipleri belirtildiği gibi antikorlarla etiketlendi. Sayma boncukları FACS çalışmadan önce eklendi. Akış sitometri verileri ticari olarak kullanılabilen bir yazılım kullanılarak analiz edildi. Gating stratejisi için Şekil 3 ve Tablo 4'e bakın.
- FACS analizi için akciğer dokusu sindirimi
- 3.1.1 - 3.1.3 adımlarını izleyin.
- Sterilize bir makas ile karın dan boyun başlayan deri kesin. İğneler ile deri düzeltmek ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburga kesti.
- Tüm akciğerleri çıkarın ve soğuk PBS ile yıkayın. 50 μL akciğer sindirim çözeltisi içeren 1,5 mL tüpe numune yerleştirin.
- Kavisli bir makas ile küçük parçalar halinde akciğer dokuları kıyma. Akciğer dokularını 6 kuyulu bir tabağa aktarın, ardından 8 mL akciğer sindirim çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 °C inkübatörde 45 dakika çalkalayıcıüzerine yerleştirin.
- Kuluçkadan sonra, akciğer dokularını öğütmek için 1,5 mL tüpüst kullanın. Yeni bir 6-well plaka üzerine 70 μm süzgeç yerleştirin ve 0,22 μm filtre ile örnek uygulayın.
- Filtrelenmiş çözeltiyi 15 mL'lik bir tüpe aktarın, ardından tüpleri 500 x g'de 4 °C'de 7 dk'ya santrifüj edin. Supernatant aspire ve RBC lysis tampon 1 mL pelet resuspend ve 3 dakika buz üzerinde bırakın.
- Numuneyi 1,5 mL tüp ve santrifüje 500 x g'de 7 dk 4 °C'ye aktarın. Tekrar 2x
- Akciğer hücrelerini 1 mL FACS tamponu ile 2 x yıkayın. Supernatant aspire ve FACS tampon 1 mL pelet resuspend, ve sonra 96 kuyu plaka içine örnek 100 μL aktarın.
- Plakayı 4 °C'de 500 x g hızda 7 dk santrifüj edin. Sindirilmiş akciğer dokusu örneklerinin hücrelerini lekelemek için FACS analizi (3.1.13-3.1.16) için BAL sıvı toplamada açıklanan adımları uygulayın.
NOT: Akciğerlerdeki eozinofiller belirtildiği gibi antikorlarla etiketlendi, daha sonra daha fazla FACS analizi için sayma boncukları ile karıştırıldı. Akış sitometri verileri ilişkili yazılım kullanılarak analiz edildi. HDM RNA kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için Şekil 3'e bakın.
4. İstatistiksel analiz
- Ticari olarak kullanılabilen bir yazılım kullanarak istatistiksel analiz yapın.
- İki grubun karşılaştırılması için p değerlerini eşleşmemiş iki kuyruklu Öğrenci t testi ile belirleyin.
- Formülü kullanarak referans boncuklara (üst panel) dayalı eozinofillerin mutlak sayılarını hesaplama
- İkiden fazla grubun karşılaştırılması için p değerlerini iki yönlü ANOVA ve Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi ile belirleyin.
- 0,05'ten küçük bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün. P değerleri parsellerde *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ve ****p<0.0001 olarak gösterilir.
NOT: Tüm tampon tarifleri Tablo 5'teverilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HDM, böcekler ve böcek olmayan küçük hayvanlarda uzun dsRNA yapılarının varlığı dsRNA'ya özgü fare monoklonal antikor J2 (≥ 40bp) kullanılarak nokta lekesi ile incelendi. RNase III, DSRNA'yı 12-15 bp dsRNA parçalarıhalinde sindirmek için kullanıldı ve bunlar J2 tarafından saptanamadı (Şekil 1).
HDM total RNA'nın fare akciğerlerinde doğuştan gelen bir immün yanıtı doza bağımlı bir şekilde uyarabilme yeteneği RT-qPCR(Şekil 2, üst) ile analiz edildi. RNase III tedavisi HDM total RNA immünstimülan aktivitesini ortadan kaldırarak, HDM total RNA'daki dsRNA yapılarının akciğerlerdeki doğuştan gelen immün aktivite için gerekli olduğunu belirterek(Şekil 2, daha düşük).
HDM total RNA'nın ciddi tip 2 akciğer inflamasyonu nun gelişimi üzerindeki inhibitör etkileri FACS analizi ile değerlendirildi(Şekil 3A). Bu çalışmada, eozinofilik akciğer iltihabı HDM ekstreleri tarafından indüklendi, hangi veya rNase III olmadan deneysel tasarımda tasvir edildi(Şekil 3B). RNase III tedavisi HDM özlerinden uzun dsRNA türlerini çıkarmak için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, uzun dsRNA türlerinin bozulması BAL ve akciğerlerde artan eozinofil sayıları yansıyan şiddetli tip 2 akciğer iltihabı ile sonuçlandı. Özellikle, HDM toplam RNA ile tedavi edilen gruptaki eozinofil sayısı, uzun dsRNA türlerini endojen olarak içeren orijinal HDM ekstresi ile tedavi edilen grupla karşılaştırılabilir(Şekil 3B).
Şekil 1: HDM RNA'larda dsRNA yapılarının nokta blot kullanılarak dsRNA spesifik J2 Ab ile saptanması. Dermatophagoides farinae (D.f.) ve Dermatophagoides pteronysinus (D.p.) dahil olmak üzere farklı aeroaajenlerin toplam RNA dsRNA tespiti için bir naylon membran üzerinde lekeli oldu (sol panel). HDM (D.f. ve D.p.) RNA tedavi edilmezse (-), RNase III (dsRNA'ya özgü nükleaz) ve RNase T1 (ssRNA'ya özgü nükleaz)(sağ panel)ile tedavi edildi. Bu rakam O ve ark.15'tenyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HDM'den (D.f.) toplam RNA ile ISG mRNA ekspresyonu indüksiyonu RT-PCR ile ölçüldü. Fare akciğerlerine teslim edildiğinde, HDM RNA doza bağlı bir şekilde ISG'lerin ekspresyonunu uyarmayı başardı(üst panel). RNase III tedavisi HDM RNA bağışıklık uyarıcı aktivitesini ortadan kaldırdı (alt panel). Bu rakam O ve ark.15'tenyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Solunum yollarında belirli hücre tiplerinin karakterizasyonu ve BAL sıvısı ve akciğer eozinofillerin değerlendirilmesi. (A) BAL sıvısından elde edilen hücreleri tanımlamak için kullanılan gating stratejisi, belirtildiği gibi hücre yüzey ilerleçleri için boyandı. (B) HDM (D.f.) RNA'nın 5 μg/fare (mavi çubuk) ile kontrol faresi akciğer RNA (kırmızı çubuk) uygulaması. HDM (D.f.) RNA ancak dsRNA-tükenmiş HDM ekstresi HDM ekstresi ile tedavi hayvanların hem hava yolları hem de akciğerlerde eozinofil sayısını azalttı. Bu rakam O ve ark.15'tenyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Fare Astarları | Sıra (İleri-Geri, 5'→3') | |
| RPL19 | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| IL1β | TCTATACCTGTCCTGTGTAATG; GCTTGTGCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT |
|
| İsG15 | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTCTTT |
|
| Mx1 | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 | GGATGCCTGGGAGAGAATCG; TCGCCTGCTCTTCGAAACTG |
|
| TNFα | CCTCCCTCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tablo 1: RT-qPCR Astarları.
| Reaktif | Hacim (10 μl) | |
| Evrensel SYBR Yeşil supermix (2x) | 5 μl | |
| İleri ve geri astarlar (5°M) | 1 μl | |
| cDNA şablonu | 0,4 μl | |
| DNase- ve RNase-free H2O | 3,6 μl | |
Tablo 2: RT-qPCR için ana karışım kurulumu.
| Adım -ları | Sıcaklık | Saat |
| Adım 1 | 95 oC | 3 dakika |
| Adım 2 | 95 oC | 10 saniye |
| Adım 3 | 55 oC | 30 saniye |
| Adım 4 | Adım 2'ye git, (39 döngü için tekrar 2-3) | |
| Adım 5 (Erime Eğrisi) | 55 oC - 95 oC | 0.5 oC, artışlar (bekleme süresi 5 saniyedir) |
Tablo 3: RT-qPCR çalıştırmak için program.
| 1. İleri (FSC) ve yan dağılımdan (SSC) oluşan bir çizim oluşturun. |
| 2. Boncuksayma için küçük bir arsa oluşturun (FSC düşük, FITC yüksek). |
| 3. BV510 boya kullanarak ölü hücreleri hariç ise sadece canlı hücreler için kapı için bir arsa oluşturun. |
| 4. Canlı hücreler daha sonra CD11c yüksek ve CD11c düşük popülasyonları ayrılabilir. |
| 5. Makrofajlar (SiglecF yüksek MHCII düşük) ve DCs (SiglecF düşük, MHCII yüksek) için CD11c yüksek nüfus kapısı itibaren. |
| 6. T hücreleri için CD11c düşük kapı (CD3/19 yüksek, MHCII düşük) ve B hücreleri (CD3/19 yüksek, MHCII yüksek). |
| 7. CD11c düşük CD3/19null hücre popülasyonundan, nötrofiller için kapı (CD11b yüksek, Ly-6G yüksek) ve Eozinofiller (CD11b yüksek, Ly-6G düşük, SiglecF yüksek). |
| 8. Akciğer dokularında Eozinofiller gating stratejisi için, BV510 boya (CD45, SiglecF, CD11C) kullanarak ölü hücreleri hariç bu belirteçleri aftere kullanın. |
Tablo 4: FACS çalışıyor
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl |
| pH 7.5 |
| TBS-T: |
| TBS'de %0,05'lik Bir Ikin-20 |
| Arabelleği Engelleme |
| TBS-T'de seyreltilmiş %5 yağsız süt |
| Antikor seyreltme Tampon |
| TBS-T'de seyreltilmiş %1 yağsız süt |
| PBS+EDTA |
| 1x PBS + 0.1 mM EDTA |
| FACS arabelleği |
| 1x PBS'de %2 Fetal Baldır Serumu (FCS) |
| Toplam hücre orta |
| RPMI 1640, 1X Glutamax, 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoetanol ve Penisilin-Streptomisin. |
| Akciğer sindirim çözümü |
| Toplam hücre orta artı Liberaz (50 g/ml) ve DNase I (1 μg/ml) |
Tablo 5: Arabellek ve çözüm için tarifler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol, alerjik astım bir fare modelinde alerjen ilişkili mikrobiyal RNA immünsiyonlaştırıcı özellikleri ve eozinofilik akciğer iltihabı gelişimi üzerindeki etkileri nasıl değerlendirilecektir açıklar. Uzun dsRNA'lar memeli hücrelerinde interferon yanıtlarını etkinhale getirebilen birçok virüsün replikasyon araları olarak bilinse de, HDM alerjenlerindeki varlıkları son çalışmamıza kadar bilinmemektedir15. Bu el yazmasında sunulan RNA nokta lekesi, RT-qPCR ve FACS analizinin birleşimi, alerjenkaynaklı eozinofilik inflamasyonun düzenlenmesinde kritik rol oynayan çevresel alerjenlerdeki dsRNA türleri gibi doğuştan gelen bileşenlerin incelenmesiiçin iyi bir örnek olabilir.
Bu protokolde, rna nokta lekesi, doğal alerjenlerde dsRNA yapılarının varlığını özellikle diziden bağımsız olarak dsRNA 'ya (≥40bp) bağlanan fare monoklonal antikor J2 kullanarak tespit etmek için kullanılmıştır. J2 antikor hala RNase T1 (tek iplikçikli RNA özgü ensonazazazan) ile önişlemyapılan dsRNA örneklerini tanıyabilir, ancak RNa III (dsRNA'ya özgü ensonazazaz) ile önişlenmiş örnekleri tanıyamadığından, bu yöntem son derece güvenilirdir. Ancak, yaygın olarak kullanılan sentetik analog dsRNA, Polyinosinic:polisikitik asit [Poly(I:C)], tercihen başka bir anti-dsRNA monoklonal antikor K1 bağlamak bildirilmiştir işaret etmek gerekir, yerine J221,22,23. Bu nedenle, Poli(I:C) tespiti için J2 antikor kullanımı tavsiye edilmez.
BAL veya akciğer dokularından alınan örnekler üzerinde hücre tipi analizi alerjik akciğer iltihabı ilerlemesini değerlendirmek için yararlıdır. BAL prosedürü yaygın bir teknik olmasına rağmen, sonuçlar araştırma laboratuvarları arasında farklılık gösterebilir. Toplanan bronkoalveoler lavaj miktarı gibi çok sayıda faktör bu varyasyonlara neden olabilir. 8-12 haftalık farelerden elde edilen BAL'ın ideal hacmi ~3 ml19'dur. Tekrarlanabilirlik eksikliğine katkıda bulunabilecek bir diğer faktör de kateterin trakeaya ne kadar derin takılması gerektiğidir (~0.5 cm optimaldir) çünkü kateterlerin daha derin takılması trakeaya zarar verebilir. Buna ek olarak, araştırmacılar da bu faktörler büyük ölçüde deney sonuçları27,28,,29etkileyebilir gibi farelerin yaş, gerginlik ve cinsiyet gibi diğer faktörleri düşünmelisiniz.
Burada, HDM RNA in vitro ve in vivo'nun immünomodülatör etkilerini karakterize etmek için rna nokta lekesi, RT-qPCR ve BAL ve akciğer dokularının FACS analizini kullanarak teknik bir protokol sağlıyorduk. Uygun uygulamalar, bu teknikleri gerçekleştirirken elde edilen sonuçların başarılı bir şekilde tekrarlanabilirliğini sağlayabilir. Örneğin, RNA nokta lekesi yaparken RNa'ların kontaminasyonunu önlemeye çalışın. Ayrıca, gereksiz yüksek santrifüj hızı hücre canlılığını tehlikeye atabileceğinden santrifüj hızı düzgün bir şekilde ayarlanmalıdır. Son olarak, AYNı gün analiz edilmezse, FACS çözümlemesi için kullanılan hücreler düzeltilmelidir.
Doğuştan gelen bağışıklık ev sahibi savunma ve inflamasyon önemli bir rol oynadığından2,3, Bu yazıda açıklanan teknik ler ve yöntemler tip 2 inflamasyon gelişiminde doğal alerjenlerde mikrobiyal DNA gibi diğer doğuştan gelen bağışıklık bileşenlerinin immünomodülatör rolünü incelemek için çok yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Acknowledgments
Bayan Karla Gorena'ya akış sitometrisinde teknik yardım için teşekkür ederiz. L.S. Çin Burs Konseyi ve Hunan İl İnovasyon Vakfı Lisansüstü (CX201713068) tarafından desteklenir. H.H.A. Klinik Laboratuvar Bilimleri Bölümü, Uygulamalı Tıp Bilimleri Koleji, Jouf Üniversitesi, Sakaka, Suudi Arabistan tarafından desteklenmiştir. X.D.L. UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund ve Max ve Minnei Voelcker Fund tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
- ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
- IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
