Summary
Miljøallergener som husstøvmidd (HDM) inneholder ofte mikrobielle stoffer som aktiverer medfødte immunresponser for å regulere allergisk betennelse. Protokollen som presenteres her viser identifisering av dsRNA arter i HDM allergener og karakterisering av deres immunogene aktiviteter i modulerende eosinofillungebetennelse.
Abstract
Miljøallergener som husstøvmidd (HDM) er ofte i komplekse former som inneholder både allergiske proteiner som driver avvikende type 2-responser og mikrobielle stoffer som induserer medfødte immunresponser. Disse allergenrelaterte mikrobielle komponentene spiller en viktig rolle i å regulere utviklingen av type 2 inflammatoriske tilstander som allergisk astma. De underliggende mekanismene forblir imidlertid i stor grad udefinerte. Protokollen som presenteres her bestemmer de strukturelle egenskapene og in vivo-aktiviteten til allergenassoserende immunostimulerende RNA. Spesielt undersøkes vanlige allergener for tilstedeværelse av dobbelttrådet RNA (dsRNA) arter som kan stimulere IFN-responser i lungene og begrense utviklingen av alvorlig lungeeosinofili i en musemodell av HDM-indusert allergisk astma. Her har vi inkludert følgende tre analyser: Dot blot for å vise dsRNA-strukturene totalt RNA isolert fra allergener, inkludert HDM-arter, RT-qPCR for å måle aktivitetene til HDM RNA i interferon stimulerende gener (ISGs) uttrykk i muslunger og FACS-analyse for å bestemme effekten av HDM RNA på antall eosinofiler i BAL og lunge, henholdsvis.
Introduction
Basert på hygienehypotesen som opprinnelig ble foreslått av Strachan1, kan eksponering for miljømikriale faktorer som endotoxin beskytte mot utvikling av allergiske lidelser2,3. Under mikrobielle infeksjoner, for eksempel virusinfeksjoner, utløser den medfødte immundeteksjonen av fremmede nukleinsyrer (RNA/DNA) vertsforsvarsresponser4,,5,,6. Imidlertid forblir eksistensen og forekomsten av immunogene nukleinsyrer som lange dobbelttrådete RNA (dsRNA) arter i husstøvmidd (HDM) eller andre insektallergener ukjente. Denne protokollen ble designet for å avgjøre om HDM eller insekt og ikke-insektallergener inneholder lange dsRNA-arter som kan aktivere en beskyttende immunrespons for å motvirke utviklingen av alvorlig eosinofillungebetennelse i en musemodell av allergisk astma. Her gir vi tre enkle og raske metoder for å evaluere de strukturelle determinantene i HDM total RNA som kreves for å regulere allergenindusert eosinofillungebetennelse.
Slimhinne immunsystemet er det største immunorganet i kroppen og fungerer som den første linjen av vertsforsvar mot både mikrobielle infeksjoner og allergiske fornærmelser7,8. Den lange dsRNA, replikering mellomliggende av mange virus, er kjent for å fungere som et patogen-assosiert molekylært mønster (PAMP) for å stimulere medfødte responser via Toll som reseptor 3 (TLR3) for å indusere uttrykket av interferon stimulerte gener (ISGs)9,10,11,12,13,14. Vi har nylig vist at HDM total RNA inneholdt dsRNA strukturer, som upregulerte uttrykket av ISGs og redusert alvorlig eosinofil lungebetennelse når det administreres via intratrakeal instillasjon i en murin modell av allergisk astma indusert av HDM ekstrakter15. Alvorlighetsgraden av lungebetennelse bestemmes ved å analysere immuncelletyper i bronkoalveolære lavage (BAL) og lungevev via strømningscytometri16,17,18,19,20.
Denne protokollen inneholder tre analyser: 1) rask påvisning av dsRNA-strukturer med RNA dot blot ved hjelp av en mus monoklonalt antistoff J2 som spesifikt binder seg til dsRNA (≥40bp) på en sekvensuavhengig måte; 2) rask evaluering for in vivo effekter av immunostimulerende RNA i muselunger ved å måle induksjon av ISGs ved hjelp av RT-qPCR; 3) nøyaktig kvantifisering av eosinofiler i BAL og lunge i sammenheng med HDM-indusert lungebetennelse ved hjelp av flow cytometrianalyse.
Ovennevnte analyser kan brukes til å studere ikke bare allergiske lungesykdommer, men også respiratoriske bakterielle og virusinfeksjoner. For eksempel kan dsRNA-spesifikke J2-antistoff også brukes i andre applikasjoner som immunoaffinitetkromatografi, immunohistokjemi, enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunstoppnåelse21,22,23. I tillegg kan flere applikasjoner nedstrøms balvæskeoppsamling benyttes for å kvantifisere løselig innhold som cytokiner og kjemikere ved hjelp av ELISA, og transkripsjonsprofilering av celler i luftveiene (f.eks. alveolær makrofager). Selv om det finnes en rekke protokoller tilgjengelig i litteraturen for å evaluere lungeforhold, fokuserer de fleste av disse protokollene ofte på målvalideringen. Prosedyrene som er beskrevet her, kan brukes til å identifisere komponenter i miljøallergener som er viktige for å regulere utviklingen av allergiske sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of University of Texas Health San Antonio.
1. Dot blot for å vise tilstedeværelsen av dsRNA strukturer i HDM totalt RNA
- Total RNA-isolasjon fra allergener, insekter og ikke-insektallergener
- Sett HDM, insekter eller ikke-insektdyr samlet levende eller oppnådd kommersielt i 50 ml rør, og frys raskt med væske-N2. Oppbevar deretter ved -70 °C for påfølgende total RNA-isolasjon.
MERK: I dette eksperimentet ble HDM, insekt og ikke-insektsdyr valgt fordi de er kjent for å være vanlige kilder til allergener. Videre er en immunostimulerende funksjon av deres RNA-er fortsatt uklar. - Overfør en riktig mengde (tilsvarende 100 μL i volum eller mindre) av HDM, insekter eller ikke-insektsdyr lagret ved -70 °C til et 2 ml rør som inneholder perler (1,4 mm keramiske kuler), og frys deretter rør i en væske-N2-beholder i ~10 min.
- For den totale RNA-isolasjonen, tilsett 1 ml guanidiniumthiocyanatbasert RNA-isolasjonsreaksage24 til hvert rør, og bryt deretter insektet og ikke-insekt små dyr med en høyenergicelleforstyrr ved maksimal hastighet for 45 s og chill på is. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Overfør løsningen fra trinn 1.1.3 til et nytt 1,5 ml rør og tilsett 200 μL kloroform til hvert rør og vortex. Sentrifugerør ved 14 000 x g i 14 min ved 4 °C.
- Når sentrifugeringen er fullført, overfør den øvre vandige fasen (200 μL) til et nytt 1,5 ml rør som inneholder 500 μL isopropanol for å utløse RNA-pellet. Ikke forstyrr interfasen. Det anbefalte volumforholdet i den øvre fasen versus isopropanol er 1:2.5-forhold.
- Bland med skånsom vortexing, deretter sentrifuger rør på 14,000 x g i 14 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten med forsiktighet og vask RNA-pelleten med 500 μL på 75 % etanol og sentrifuger ved 7500 x g i 10 min ved 4 °C. Fjern all væske med forsiktighet, lufttørk pelleten og oppløs RNA-pelleten med 20-50 μL RNase-fri H2O.
- Mål RNA-konsentrasjonen med et spektrofotometer ved hjelp av følgende parametere:
- Åpne den tilknyttede programvaren og velg hvilken type nukleinsyrer du vil måle. Endre eksempeltypen til RNA.
- Utfør den tomme målingen med 1-2 μL RNase-fri H2O. Tørk av RNase-fri H2O. Nå er instrumentet klart for målingen.
- Last 1-2 μL av RNA-prøven og mål RNA-konsentrasjonen (μg/μL).
MERK: Forholdet mellom absorbansen ved 260 og 280 nm (A260/280) på ~2,0 (1,9-2,2) aksepteres vanligvis som "ren" for RNA. Hvis det ikke behandles umiddelbart, oppbevarer du RNA-prøver ved -70 °C og unngår frysetoppringingssyklusene for å holde RNA intakt.
- Sett HDM, insekter eller ikke-insektdyr samlet levende eller oppnådd kommersielt i 50 ml rør, og frys raskt med væske-N2. Oppbevar deretter ved -70 °C for påfølgende total RNA-isolasjon.
- Påvisning av dsRNA-struktur i total RNA ved bruk av dsRNA-spesifikt J2-antistoff
- Forbered to 20 μL RNA-prøver (200 ng/μL). En med RNase-III behandling (1 μL for 1 μg RNA, inkuber ved 37 °C i 60 min), og den andre uten RNase-III behandling.
MERK: RNase III brukes her til å spesifikt degradere dsRNA, men ikke enkelttrådet RNA25. - Bruk en blyant til å tegne rutenett der RNA-prøver vil bli blotted på membranen.
- Punkt 2 μL av 200 ng/μL av RNA-prøven på den positivt ladede nylonmembranen.
- Kryssprøvene til membranen på 1200 mikrojoule x 100 i en UV-krysskobling. Gjenta trinn 1.2.3 og 1.2.4 to ganger til på prøvestedet. Dette vil resultere i totalt 0,8 μg per blot.
MERK: Ikke plasser mer enn 2 μL RNA-prøve på membranen om gangen. - Blokker ikke-spesifikk binding med 5 % melk i TBS-T i 1 timer ved risting ved romtemperatur. Fjern blokkeringsoppløsningen fra trinn 1.2.5 og tilsett anti-dsRNA J2-antistoffet ved 1:1000-fortynningen i 1 % melk i TBS-T og inkuber over natten med risting ved 4 °C.
- Vask membranen med TBS-T i 5 min og gjenta dette trinnet i 3 ganger. Tilsett det sekundære antistoffet (Alkalisk fosfatasekonjugert Anti-Mouse IgG fortynnet i 1% melk 1:5,000) og inkuber i 1 timer på en shaker ved romtemperatur. Vask membranen med TBS-T i 5 min og gjenta dette trinnet for 3x.
- Tilsett underlaget (BCIP/NBT) og inkuber i 5-15 min til ønsket signal er synlig.
- Stopp reaksjonen ved å skylle membranen med ddH2O.
- Tørk membranen på vevspapir og ta et bilde ved hjelp av en smarttelefon (et representativt resultat vises i figur 1).
- Forbered to 20 μL RNA-prøver (200 ng/μL). En med RNase-III behandling (1 μL for 1 μg RNA, inkuber ved 37 °C i 60 min), og den andre uten RNase-III behandling.
2. RT-qPCR for å måle evnen til HDM total RNA i stimulerende lunge ISGs uttrykk
- RNA isolasjon fra mus lungevev
MERK: Mus (hunn, 8-12 uker gammel, C57BL/6J) ble opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold.- Kort bedøve dyret med isofluran og administrer via intratrakeal instillasjon med 5 μg (fortynnet i 80 μL PBS) av HDM RNAs behandlet med eller uten RNase III.
- Etter 16-18 t post HDM RNA behandling, ofre musen ved CO2 innånding i noen minutter. Deretter plasserer du musen på en plattform og fester lemmer med nåler.
- Desinfiser musen med 70% etanol og kutt deretter huden fra magen til nakken med en sterilisert saks.
- Fest huden med nåler og kutt ribbeina for å eksponere lungene. Fjern hele lungene og vask dem med kald PBS. Plasser lungene på vevspapir og avgiftslegg ett lite stykke av hver lunge-lobe i et 2 ml rør som inneholder perler (200-300 μL i volum, 1,4 mm keramiske kuler).
MERK: Formålet med å bruke keramiske perler er å male hele lungevev - Frys lungeprøvene ved å plassere rør i en væske-N2-beholder i ca. 10 min.
- Tilsett 500 μL guanidiniumthiocyanat-basert RNA isolasjon reagens til hvert rør og bryte lungevevet med en homogenisator for 45 s. Chill på is mellom hvert trinn. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Følg trinnene 1.1.4- 1.1.7 for lunge RNA isolasjon.
- Lufttørk pelleten og oppløs RNA-pelleten med riktig mengde RNase-fri H2O (~20-30 μL).
- Mål RNA-konsentrasjonen som beskrevet i trinn 1.1.8.
- RT-qPCR for å bestemme evnen til HDM RNA i stimulerende lungegenuttrykk.
- Ved hjelp av 100 ng/μL RNA ekstrahert fra lungevev som mal, utfør cDNA syntese i henhold til den refererte protokollen26.
- Sett opp en RT-qPCR-reaksjon ved 10 μL/brønn for en 384-brønnplate ved hjelp av cDNA generert ovenfor og de genspesifikke primerparene(tabell 1 og tabell 2).
- Forsegle brønnene tett med en gjennomsiktig klebende film og virvle platen i 30 s. Spinn platen på 1000 x g i 30 s for å samle prøver på bunnen av brønnene.
- Legg platen på en RT-qPCR-maskin og begynn å kjøre RT-qPCR-reaksjonen ved hjelp av den termiske syklusprotokollen (tabell 3).
- Eksporter resultatene til en regnearkfil eller analyser dataene ved hjelp av programvaren som leveres av produksjonen etter at programmet er fullført (et representativt resultat vises i figur 2).
3. FACS-analyse for å bestemme effekten av HDM RNA på infiltrasjon av eosinofiler i BAL og lunge
- BAL væskeoppsamling for FACS-analyse
- Euthanize mus (hunn, 8-12 uker gammel, C57BL/6J) som ble behandlet med HDM allergen ekstrakter (i henhold til eksperimentell design vist i figur 3B) ved CO2 innånding.
- Plasser musen på en plattform og pin lemmer med nåler.
- Desinfiser musen med 70% etanol. Bruk saks til å kutte huden fra det øvre området av magen til nakken.
- Forsiktig, trekk spyttkjertlene og sternohyoid muskelen forsiktig fra hverandre ved hjelp av pinsettene for å utsette luftrøret. Plasser en nylonstreng (~10 cm) under luftrøret ved hjelp av tang.
- Lag et snitt i luftrøret (~ 2 mm under strupehodet) akkurat nok til å sette inn en kanyle. Ikke skjær gjennom luftrøret. Knute strengen rundt luftrør og kanyle.
- Legg sprøyten med 1 ml PBS+EDTA og fest den til enden av kanylen. Injiser 1 ml PBS+EDTA i lungene og aspirer oppløsningen helt. Løsne sprøyten forsiktig fra kanylen og overfør oppløsningen til et 15 ml rør på is.
- Sett sprøyten på nytt med den friske PBS+EDTA og gjenta dette trinnet 2x.
- Sentrifuger røret som inneholder den samlede BAL oppnådd i trinn 3.1.7 for å pellet cellene ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Noter volumet av BAL væske og overfør deretter supernatanten til to 1,5 ml rør uten å forstyrre pelleten.
MERK: Supernatanten av BAL kan oppbevares ved -70 °C for fremtidig analyse, for eksempel ELISA. - I tilfelle det er RBCs tilstede i pellet på grunn av alvorlig lungebetennelse, etter å ha fjernet supernatant, tilsett 500 μL RBC lysis buffer og bland godt ved resuspension. Overfør løsningen til en ny 1,5 ml rør og sentrifuge i 7 min med en hastighet på 500 x g ved 4 °C.
- Fjern den supernatant og resuspend pellet i 150 μL av FACS buffer.
- Overfør 150 μL av den resuspended prøven til 96-brønnplate og sentrifuger platen i 7 min med en hastighet på 500 x g ved 4 °C.
- Raskt, inverter platen på vevspapir for å samle cellene som bor på bunnen av brønnene.
- Flekk cellene med antistoffer i FACS-buffer i nærvær av 2.4G2 blokkerende antistoff (2,5 μg / 100 μL). Inkuber platen ved romtemperatur i 30 min på et mørkt sted.
- Etter farging, sentrifuger platen til pellet cellene ved 500 x g i 7 min ved 4 °C.
- Fjern fargeløsningen ved å invertere platen på silkepapir og vask deretter ved å bruke på nytt med 100 μL FACS-buffer. Deretter sentrifuger platen igjen ved 500 x g i 7 min ved 4 °C og fjern FACS-bufferen ved å invertere platen på papir.
- Resuspend prøver i 150 μL av FACS buffer og overføre prøver til FACS rør som inneholder 350 μL av FACS buffer. Tilsett 25 μL telleperler til hver prøve. Prøvene er nå klare for flow cytometrianalyse.
MERK: Ulike celletyper i BAL-væske ble merket med antistoffer som angitt. Telleperler ble lagt til før FACS-løpet. Flow cytometridata ble analysert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig programvare. Se figur 3 og tabell 4 for gating strategi.
- Lungevev fordøyelsen for FACS analyse
- Følg trinn 3.1.1 - 3.1.3.
- Skjær huden fra magen til nakken med en sterilisert saks. Fest huden med nåler og kutt ribbeina for å eksponere lungene.
- Fjern hele lungene og vask dem med kald PBS. Plasser prøver i 1,5 ml rør som inneholder 50 μL lungefordøyelsesløsning.
- Hakk lungevevet i små biter med en buet saks. Overfør lungevevet til en 6-brønns plate, og tilsett deretter 8 ml lungefordøyelsesløsning. Plasser platen på en shaker i 37 °C inkubator i 45 min.
- Etter inkubasjon, bruk toppen av 1,5 ml rør for å male lungevevet. Plasser en 70 μm siler på en ny 6-brønnplate og påfør prøven gjennom 0,22 μm filter.
- Overfør den filtrerte oppløsningen til et 15 ml rør, og sentrifuger deretter rørene ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Aspirer den supernatant og resuspend pellet i 1 ml RBC lysis buffer og la den stå på is i 3 min.
- Overfør prøven til 1,5 ml rør og sentrifuger ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Gjenta 2x
- Vask lungecellene 2x med 1 ml FACS-buffer. Aspirer den supernatant og resuspend pellet i 1 ml FACS buffer, og deretter overføre 100 μL av prøven til 96 brønnplate.
- Sentrifuger platen i 7 min med en hastighet på 500 x g ved 4 °C. Følg trinnene som er beskrevet i BAL væskeoppsamling for FACS-analyse (3.1.13 til 3.1.16) for å farge cellene i fordøyde lungevevsprøver.
MERK: Eosinofiler i lungene ble merket med antistoffer som indikert, deretter blandet med telleperler for videre FACS-analyse. Flow cytometridata ble analysert ved hjelp av tilknyttet programvare. Se figur 3 for evaluering av HDM RNA-induserte immunresponser.
4. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig programvare.
- Bestem p-verdiene ved å koble sammen student t-testen med tosidige for sammenligning av to grupper.
- Beregn de absolutte tallene for eosinofiler basert på referanseperler (topppanel) ved hjelp av formelen
- Bestem p-verdiene etter toveis ANOVA og Sidaks flere sammenligninger test for sammenligning av mer enn to grupper.
- Vurdere en p verdi mindre enn 0,05 som statistisk signifikant. P-verdiene angis på plott som *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001 og ****p<0,0001.
MERK: Alle bufferoppskrifter finnes i tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tilstedeværelsen av lange dsRNA-strukturer i HDM, insekter og ikke-insekt små dyr ble undersøkt av dot blot ved hjelp av en dsRNA-spesifikk mus monoklonalt antistoff J2 (≥ 40bp). RNase III ble brukt til å fordøye dsRNA i 12–15 bp dsRNA-fragmenter, som ikke kunne oppdages av J2 (figur 1).
Evnen til HDM total RNA å stimulere en medfødt immunrespons i muselunger på en doseavhengig måte ble analysert av RT-qPCR (figur 2, øvre). RNase III-behandlingen avskaffet immunostimulerende aktivitet av HDM total RNA, noe som indikerer at dsRNA-strukturer i HDM total RNA er avgjørende for medfødt immunaktivitet i lungene (figur 2, lavere).
De hemmende effektene av HDM total RNA på utviklingen av en alvorlig type 2 lungebetennelse ble evaluert med FACS-analysen (figur 3A). I denne studien ble den eosinofile lungebetennelsen indusert av HDM-ekstrakter, som ble behandlet med eller uten RNase III som avbildet i eksperimentell design (Figur 3B). RNase III behandling ble brukt til å fjerne lange dsRNA arter fra HDM ekstrakter. Som forventet resulterte nedbrytningen av lange dsRNA-arter i alvorlig type 2 lungebetennelse reflektert av de økte eosinofiltallene i BAL og lunger. Spesielt er antall eosinofiler i HDM total RNA-behandlet gruppe sammenlignbart med gruppen behandlet med det opprinnelige HDM-ekstraktet som endogene inneholder de lange dsRNA-artene (figur 3B).
Figur 1: Påvisning av dsRNA-strukturene i HDM RNAs ved dsRNA-spesifikk J2 Ab ved bruk av punktflekk. Total RNA fra forskjellige aeroallergener, inkludert Dermatophagoides farinae (D.f.) og Dermatophagoides pteronyssinus (D.p.) ble blotted på en nylonmembran for påvisning av dsRNA (venstre panel). HDM (D.f. og D.p.) RNA ble stående ubehandlet (-), behandlet med RNase III (dsRNA-spesifikke kjerner) og RNase T1 (ssRNA-spesifikk kjerne) (høyre panel). Dette tallet er gjengitt fra Hun et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Induksjon av ISG mRNA-uttrykk av total RNA fra HDM (D.f.) ble målt ved RT-PCR. Når levert i muselunger, HDM RNA var i stand til å stimulere uttrykket av ISGs på en doseavhengig måte (øvre panel). RNase III behandling eliminert immunstimulerende aktivitet av HDM RNA (nedre panel). Dette tallet er gjengitt fra Hun et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Karakterisering av spesifikke celletyper i luftveiene og evaluering av BAL-væske og lungeeosinofiler. (A) Gating strategi som brukes til å identifisere celler utvinnes fra BAL væske ble farget for celleoverflate markører som angitt. (B)Administrasjon av HDM (D.f.) RNA ved 5 μg/mus (blå linje) versus styremuslunge RNA (rød bar). HDM (D.f.) RNA, men ikke dsRNA-utarmet HDM-ekstrakt reduserte antall eosinofiler i både luftveier og lunger av dyr behandlet med HDM-ekstrakt. Dette tallet er gjengitt fra Hun et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mus Primere | Sekvens (forover-revers, 5'→3') | |
| RPL19 (andre) | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| Il1β (andre) | TCTATACCTGTCCTGTGTAATG; GCTTGTGCTCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 (andre) | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT (Nær CGCAAACTTGGCAAACTTGTCT) |
|
| Isg15 (andre) | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTCTT |
|
| Mx1 (andre) | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; Actctggtccccaatgacag |
|
| OASL2 (andre) | GGATGCCTGGGAGAGAATCG; TCGCCTGCTCTTCGAAACTG |
|
| TNFα (andre) | CCTCCCTCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tabell 1: RT-qPCR-primere.
| Reagenser | Volum (10 μl) | |
| Universell SYBR Grønn supermix (2x) | 5 μl | |
| Forover og bakover primere (5 μM) | 1 μl | |
| cDNA-mal | 0,4 μl | |
| DNase- og RNase-fri H2O | 3,6 μl | |
Tabell 2: Oppsett av hovedmiks for RT-qPCR.
| Trinn | Temperatur | Tid |
| Trinn 1 | 95 oC | 3 minutter |
| Trinn 2 | 95 oC | 10 sekunder |
| Trinn 3 | 55 oC | 30 sekunder |
| Trinn 4 | Gå til trinn 2 ( Gjenta 2-3 for 39 sykluser) | |
| Trinn 5 (Smeltekurve) | 55 oC til 95 oC | 0,5 oC, trinn (hold tid er 5 sekunder) |
Tabell 3: Program for kjøring av RT-qPCR.
| 1. Lag et plott bestående av fremover (FSC) og side scatter (SSC). |
| 2. Lag en liten tomt for å telle perler (FSC lav, FITC høy). |
| 3. Lag et plott til bare gate for levende celler mens unntatt døde celler ved hjelp av BV510 fargestoff. |
| 4. Levende celler kan deretter deles inn i CD11c høy og CD11c lave populasjoner. |
| 5. Fra CD11c høy populasjonsport for makrofager (SiglecF høy MHCII lav) og UTFORMINGS-er (SiglecF lav, MHCII høy). |
| 6. Fra CD11c lav port for T-celler (CD3/19 høy, MHCII lav), og B-celler (CD3/19 høy, MHCII høy). |
| 7. Fra CD11c lav CD3/19null celle populasjon, gate for nøytrofiler (CD11b høy, Ly-6G høy) og Eosinofiler (CD11b høy, Ly-6G lav, SiglecF høy). |
| 8. For gating strategi av Eosinophils i lungevev, bruk disse markørene etterfølgende unntatt døde celler ved hjelp av BV510 fargestoff (CD45, SiglecF, CD11C). |
Tabell 4: FACS kjører
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl (andre) |
| PH 7.5 (andre) |
| TBS-T: |
| 0,05 % Tween-20 i TBS |
| Blokkere buffer |
| 5% fettfri melk fortynnet i TBS-T |
| Buffer for fortynning av antistoff |
| 1% ikke-fett melk fortynnet i TBS-T |
| PBS+EDTA (ANDRE) |
| 1x PBS + 0,1 mM EDTA |
| FACS buffer |
| 2% Fetal Kalv Serum (FCS) i 1x PBS |
| Totalt cellemedium |
| RPMI 1640, 1X Glutamax, 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol og Penicillin-Streptomycin. |
| Lunge fordøyelsesoppløsning |
| Total cellemedium pluss Liberase (50 μg/ml) og DNase I (1 μg/ml) |
Tabell 5: Oppskrifter for buffere og løsning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver hvordan man evaluerer de immunostimulerende egenskapene til allergenassosiert mikrobiell RNA og deres virkninger på utviklingen av eosinofillungebetennelse i en musemodell av allergisk astma. Selv om lange dsRNAs er kjent som replikering mellomprodukter av mange virus som kan kraftig aktivere interferon svar i pattedyr celler, deres tilstedeværelse i HDM allergener har vært ukjent før vårt siste arbeid15. Kombinasjonen av RNA dot blot, RT-qPCR og FACS analyse presentert i dette manuskriptet kan gi et godt eksempel for å dissekere medfødte komponenter som dsRNA arter i miljøallergener som er kritisk involvert i å regulere allergen-indusert eosinofil betennelse.
I denne protokollen har RNA dot blot blitt brukt til å oppdage tilstedeværelsen av dsRNA-strukturer i naturlige allergener ved hjelp av et musemonoklonalt antistoff J2, som spesifikt binder seg til dsRNA (≥40bp) uavhengig av sekvens. Denne metoden er svært pålitelig fordi J2 antistoff kan fortsatt gjenkjenne dsRNA prøver forbehandlet med RNase T1 (enkelt strandet RNA-spesifikk endonuclease), men ikke prøver forut forhandlet med RNase III (en dsRNA-spesifikk endonuclease). Det er imidlertid verdt å påpeke at en mye brukt syntetisk analog av dsRNA, Polyinosinic:polycytidylic acid [Poly(I:C)], har blitt rapportert å fortrinnsvis binde til en annen anti-dsRNA monoklonalt antistoff K1, i stedet for J221,22,23. Derfor anbefales ikke bruk av J2 antistoff for påvisning av Poly(I:C).
Celletypeanalyse på prøver samlet inn fra BAL eller lungevev er nyttig for å vurdere utviklingen av allergisk lungebetennelse. Selv om BAL-prosedyren er en vanlig teknikk, kan resultatene variere mellom forskningslaboratorier. Mange faktorer kan forårsake disse variasjonene som mengden bronkoalveoler lavage samlet. Det ideelle volumet av BAL gjenvunnet fra en 8-12 uker gamle mus er ~ 3 ml19. En annen faktor som kan bidra til mangel på reproduserbarhet er hvor dypt kateteret skal settes inn i luftrøret (~ 0,5 cm er optimal) fordi dypere innsetting av katetrene kan forårsake skade på luftrøret. I tillegg bør forskerne også vurdere andre faktorer som alder, belastning og kjønn på musene, da disse faktorene i stor betydning kan påvirke eksperimentresultatene27,28,29.
Her gir vi en teknisk protokoll for å karakterisere immunmodulerende effekter av HDM RNA in vitro og in vivo ved hjelp av RNA dot blot, RT-qPCR og FACS analyse av BAL og lungevev. Riktig praksis kan sikre vellykket reproduserbarhet av resultater oppnådd når du utfører disse teknikkene. Prøv for eksempel å unngå kontaminering av RNases når du utfører RNA dot blot. Sentrifugeringshastigheten bør også justeres riktig, siden unødvendig høyere sentrifugeringshastighet kan kompromittere cellens levedyktighet. Til slutt bør celler som brukes til FACS-analysen, løses hvis de ikke analyseres samme dag.
Siden medfødt immunitet spiller en avgjørende rolle i vertsforsvar og betennelse2,3,vil teknikkene og metodene som er beskrevet i dette papiret være svært nyttige for å studere immunmodulerende rolle for andre medfødte immunkomponenter som mikrobiell DNA i naturlige allergener i utviklingen av type 2 betennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ms. Karla Gorena for teknisk assistanse i flow cytometri. L.S. støttes av China Scholarship Council og Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. støttes av Institutt for kliniske laboratorievitenskap, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudi-Arabia. X.D.L. støttes av UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund og Max og Minnei Voelcker Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
- ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
- IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
