Summary
Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo contienen sustancias microbianas que activan las respuestas inmunitarias innatas para regular la inflamación alérgica. El protocolo presentado aquí demuestra la identificación de especies de dsRNA en los alérgenos de HDM y la caracterización de sus actividades inmunogénicas en la modulación de la inflamación pulmonar eosinofílica.
Abstract
Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo se encuentran en formas complejas que contienen tanto proteínas alérgicas que impulsan respuestas aberrantes de tipo 2 como sustancias microbianas que inducen respuestas inmunitarias innatas. Estos componentes microbianos asociados a alérgenos desempeñan un papel importante en la regulación del desarrollo de condiciones inflamatorias de tipo 2 como el asma alérgica. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo en gran medida indefinidos. El protocolo presentado aquí determina las características estructurales y la actividad in vivo del ARN inmunoestimulante asociado al alérgeno. Específicamente, se examinan alérgenos comunes para detectar la presencia de especies de ARN de doble cadena (dsRNA) que pueden estimular las respuestas de IFN en los pulmones y restringir el desarrollo de eosinofilia pulmonar grave en un modelo de ratón de asma alérgica inducida por HDM. Aquí, hemos incluido los siguientes tres ensayos: Punto blot para mostrar las estructuras dsRNA en el ARN total aislado de alérgenos incluyendo las especies de HDM, RT-qPCR para medir las actividades de ARN HDM en genes estimulantes del interferón (ISG) expresión en los pulmones de ratón y análisis FACS para determinar los efectos del ARN HDM en el número de eosinófilos en BAL y pulmón, respectivamente.
Introduction
Sobre la base de la hipótesis de higiene propuesta originalmente por Strachan1, la exposición en la primera infancia a factores microbianos ambientales como la endotoxina puede proteger contra el desarrollo de trastornos alérgicos2,,3. Durante las infecciones microbianas, por ejemplo, infecciones virales, la detección inmunitaria innata de ácidos nucleicos extraños (ARN/ADN) desencadena las respuestas de defensa del huésped4,,5,,6. Sin embargo, la existencia y prevalencia de ácidos nucleicos inmunogénicos como especies de ARN de doble cadena (dsRNA) en los ácaros del polvo de la casa (HDM) u otros alérgenos de insectos siguen siendo desconocidas. Este protocolo fue diseñado para determinar si el HDM o los alérgenos de insectos y no insectos contienen especies de dsRNA largos que pueden activar una respuesta inmune protectora para contrarrestar el desarrollo de inflamación pulmonar eosinofílica grave en un modelo de ratón de asma alérgica. Aquí, proporcionamos tres métodos simples y rápidos para evaluar los determinantes estructurales en el ARN total de HDM que se requieren para regular la inflamación pulmonar eosinofílica inducida por alérgenos.
El sistema inmunitario mucoso es el órgano inmune más grande del cuerpo y sirve como primera línea de defensa del huésped contra infecciones microbianas e insultos alérgicos7,,8. El dsRNA largo, el intermedio de replicación de muchos virus, se sabe que funciona como un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) para estimular poderosamente las respuestas innatas a través de Toll como el receptor 3 (TLR3) para inducir la expresión de genes estimulados por interferón (ISG)9,,10,,11,12,,13,,14. Recientemente hemos demostrado que el ARN total del HDM contenía estructuras de ARNm, que regulaban la expresión de ISG y reducían la inflamación pulmonar eosinofílica grave cuando se administraban a través de la instilación intratraqueal en un modelo murino de asma alérgica inducida por extractos de HDM15. La gravedad de las inflamaciones pulmonares se determina mediante el análisis de los tipos de células inmunitarias en lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar a través de la citometría de flujo16,17,18,19,20.
Este protocolo incluye tres ensayos: 1) detección rápida de estructuras de dsRNA con mancha de puntos de ARN utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón J2 que se une específicamente al dsRNA (40bp) de una manera independiente de la secuencia; 2) evaluación rápida de los efectos in vivo del ARN inmunoestimulador en los pulmones de ratón midiendo la inducción de ISG utilizando RT-qPCR; 3) cuantificación precisa de eosinófilos en BAL y pulmón en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por HDM utilizando análisis de citometría de flujo.
Los ensayos anteriores se pueden utilizar para estudiar no sólo las enfermedades pulmonares alérgicas, sino también las infecciones bacterianas y virales respiratorias. Por ejemplo, el anticuerpo J2 específico de dsRNA también se puede utilizar en otras aplicaciones como cromatografía inmunoafinada, inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) e inmunosuración21,,22,,23. Además, se pueden utilizar varias aplicaciones aguas abajo de la recolección de fluidos BAL para cuantificar contenidos solubles como citoquinas y quimioquinas utilizando ELISA, y el perfilado transcripcional de células en las vías respiratorias (por ejemplo, macrófagos alveolares). Aunque hay una variedad de protocolos disponibles en la literatura para evaluar las condiciones pulmonares, la mayoría de estos protocolos a menudo se centran en la validación de destino. Los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar para identificar componentes en alérgenos ambientales que son importantes para regular el desarrollo de enfermedades alérgicas.
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Protocol
Los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas Health San Antonio.
1. Punto blot para mostrar la presencia de estructuras dsRNA en el ARN total hdM
- Aislamiento total de ARN de alérgenos, insectos y alérgenos no insectos
- Poner HDM, insectos o animales no insectos recogidos vivos u obtenidos comercialmente en tubos de 50 ml, y congelar rápidamente con líquido-N2. A continuación, conservar a -70 oC para el posterior aislamiento total de ARN.
NOTA: En este experimento, se seleccionaron HDM, insectos y animales no insectos porque se sabe que son fuentes comunes de alérgenos. Además, una función inmunoestimulador de sus ARN sigue sin estar clara. - Transfiera una cantidad adecuada (equivalente a 100 ml en volumen o menos) de HDM, insectos o animales no insectos almacenados a -70 oC en un tubo de 2 ml que contenga perlas (esferas cerámicas de 1,4 mm), luego congele los tubos en un recipiente líquido-N2 durante 10 minutos.
- Para el aislamiento total de ARN, agregue 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN basado en tiocianato de guanidinio24 a cada tubo, luego rompa el insecto y los animales pequeños no insectos con un disruptor celular de alta energía a la velocidad máxima durante 45 s y escalofríos en hielo. Repita este paso dos veces.
- Transfiera la solución del paso 1.1.3 a un nuevo tubo de 1,5 ml y añada 200 l de cloroformo a cada tubo y vórtice. Tubos centrífugos a 14.000 x g durante 14 min a 4oC.
- Una vez completada la centrifugación, transfiera la fase acuosa superior (200 l) a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 500 ml de isopropanol para precipitar el pellet de ARN. No moleste la interfase. La relación de volumen recomendada de la fase superior frente al isopropanol es de 1:2.5.
- Mezclar por vórtice suave, luego centrifugar tubos a 14.000 x g durante 14 min a 4 oC.
- Aspirar el sobrenadante con precaución y luego lavar el pellet de ARN con 500 ml de etanol al 75% y centrífuga a 7.500 x g durante 10 min a 4 oC. Retire todo el líquido con precaución, seque al aire el pellet y disuelva el pellet de ARN con 20-50 l de H2O libre de RNase.
- Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro utilizando los siguientes parámetros:
- Abra el software asociado y seleccione el tipo de ácidos nucleicos a medir. Cambie el tipo de muestra a ARN.
- Realice la medición en blanco con 1-2 l de H2O. Limpie el H2O libre de RNase. Ahora, el instrumento está listo para la medición.
- Cargue 1-2 l de la muestra de ARN y mida la concentración de ARN (g/L).
NOTA: La relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280) a 2,0 (1,9-2,2) se acepta generalmente como "pura" para el ARN. Si no se procesa inmediatamente, almacene las muestras de ARN a -70 oC y evite los ciclos de congelación y descongelación para mantener el ARN intacto.
- Poner HDM, insectos o animales no insectos recogidos vivos u obtenidos comercialmente en tubos de 50 ml, y congelar rápidamente con líquido-N2. A continuación, conservar a -70 oC para el posterior aislamiento total de ARN.
- Detección de la estructura de dsRNA en el ARN total utilizando anticuerpoS J2 específicos de dsRNA
- Preparar dos muestras de ARN de 200 ml (200 ng/L). Uno con tratamiento RNase-III (1 ml para 1 g de ARN, incubar a 37 oC durante 60 min) y el otro sin tratamiento con RNase-III.
NOTA: RNase III se utiliza aquí para degradar específicamente el dsRNA, pero no el ARN de una sola cadena25. - Utilice un lápiz para dibujar rejillas donde las muestras de ARN se borrarán en la membrana.
- Detecte 2 l de la muestra de 200 ng/L de la muestra de ARN sobre la membrana de nylon cargada positivamente.
- Entrecruza las muestras a la membrana a 1.200 microjulios x 100 en un reticulante UV. Repita los pasos 1.2.3 y 1.2.4 dos veces más en el lugar del punto de muestra. Esto dará como resultado un total de 0,8 g por mancha.
NOTA: No detecte más de 2 ml de muestra de ARN en la membrana a la vez. - Bloquee la unión no específica con 5% de leche en TBS-T durante 1 h con agitación a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo del paso 1.2.5 y añada el anticuerpo anti-dsRNA J2 a la dilución 1:1.000 en 1% de leche en TBS-T e incubar durante la noche con temblor a 4oC.
- Lave la membrana con TBS-T durante 5 minutos y repita este paso durante 3 veces. Añadir el anticuerpo secundario (IgG antifasa conjugada con fosfatasa alcalina diluida en 1% de leche 1:5.000) e incubar durante 1 h en una coctelera a temperatura ambiente. Lave la membrana con TBS-T durante 5 min y repita este paso durante 3x.
- Añadir el sustrato (BCIP/NBT) e incubar durante 5-15 min hasta que la señal deseada sea visible.
- Detenga la reacción enjuagando la membrana con ddH2O.
- Seque la membrana en papeles tisú y tome una fotografía con un teléfono inteligente (se muestra un resultado representativo en la Figura 1).
- Preparar dos muestras de ARN de 200 ml (200 ng/L). Uno con tratamiento RNase-III (1 ml para 1 g de ARN, incubar a 37 oC durante 60 min) y el otro sin tratamiento con RNase-III.
2. RT-qPCR para medir la capacidad del ARN total de HDM en la estimulación de la expresión de ISGs pulmonares
- Aislamiento de ARN de los tejidos pulmonares de ratones
NOTA: Los ratones (hembras, 8-12 semanas de edad, C57BL/6J) se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos.- Anestesar brevemente al animal con isoflurano y administrar a través de la instilación intratraqueal con 5 g (diluido en 80 l de PBS) de ARN HDM tratados con o sin RNase III.
- Después de 16-18 h después del tratamiento con ARN HDM, sacrifique el ratón por inhalación deCO2 durante unos minutos. A continuación, coloque el ratón sobre una plataforma y alfiler las extremidades con agujas.
- Desinfectar el ratón con 70% de etanol y luego cortar la piel a partir del abdomen al cuello con una tijera esterilizada.
- Fije la piel con agujas y corte las costillas para exponer los pulmones. Retire los pulmones enteros y lávelos con PBS frío. Coloque los pulmones sobre papeles tisú e especiale una pequeña pieza de cada lóbulo pulmonar en un tubo de 2 ml que contenga perlas (200-300 ml en volumen, esferas cerámicas de 1,4 mm).
NOTA: El propósito de usar cuentas de cerámica es moler tejidos pulmonares enteros - Congele las muestras de pulmón2 colocando los tubos en un recipiente líquido-N2 durante 10 min.
- Añadir 500 l de reactivo de aislamiento de ARN a base de tiocianato de guanidinio a cada tubo y romper los tejidos pulmonares con un homogeneizador durante 45 s. Enfriar sobre hielo entre cada paso. Repita este paso dos veces.
- Siga los pasos 1.1.4- 1.1.7 para el aislamiento de ARN pulmonar.
- Secar al aire el pellet y disolver el pellet de ARN con la cantidad adecuada de H2O libre de RNase (20-30 l).
- Mida la concentración de ARN como se describe en el paso 1.1.8.
- RT-qPCR para determinar la capacidad del ARN HDM para estimular la expresión génica pulmonar.
- Utilizando 100 ng/L de ARN extraído de los tejidos pulmonares como plantilla, realice la síntesis de ADNc de acuerdo con el protocolo26al que se hace referencia.
- Configure una reacción RT-qPCR a 10 l/pozo para una placa de 384 pocillos utilizando cDNA generado anteriormente y los pares de imprimación específicos del gen(Tabla 1 y Tabla 2).
- Sellar los pozos firmemente con una película adhesiva transparente y vórtice la placa durante 30 s. Gire la placa a 1.000 x g durante 30 s para recoger muestras en la parte inferior de los pozos.
- Cargue la placa en una máquina RT-qPCR y comience a ejecutar la reacción RT-qPCR utilizando el protocolo termólocista(Tabla 3).
- Exporte los resultados a un archivo de hoja de cálculo o analice los datos utilizando el software proporcionado por la fabricación una vez completado el programa (se muestra un resultado representativo en la Figura 2).
3. Análisis FACS para determinar los efectos del ARN HDM en la infiltración de eosinófilos en BAL y pulmón
- Colección de fluidos BAL para análisis FACS
- Ratones de eutanasia (hembra, 8-12 semanas de edad, C57BL/6J) que fueron tratados con extractos de alérgenos HDM (según el diseño experimental mostrado en la Figura 3B)por inhalación de CO2.
- Coloque el ratón sobre una plataforma y alfiler las extremidades con agujas.
- Desinfectar el ratón con 70% de etanol. Usa tijeras para cortar la piel desde la zona superior del abdomen hasta el cuello.
- Suavemente, tire de las glándulas salivales y el músculo esternoide cuidadosamente aparte usando los fórceps para exponer la tráquea. Coloque una cuerda de nylon (10 cm) debajo de la tráquea usando fórceps.
- Haga una incisión en la tráquea (2 mm debajo de la laringe) lo suficiente como para insertar una cánula. No corte a través de la tráquea. Con nudo de la cuerda alrededor de la tráquea y la cánula.
- Cargue la jeringa con 1 ml de PBS+EDTA y adjúntela al extremo de la cánula. Inyecte 1 ml de PBS+EDTA en el pulmón y aspire completamente la solución. Separe la jeringa de la cánula cuidadosamente y transfiera la solución a un tubo de 15 ml sobre hielo.
- Vuelva a cargar la jeringa con el PBS+EDTA fresco y repita este paso 2x.
- Centrifugar el tubo que contiene el BAL agrupado obtenido en el paso 3.1.7 para peletizar las células a 500 x g durante 7 min a 4 oC. Registre el volumen de líquido BAL y transfiera el sobrenadante a dos tubos de 1,5 ml sin alterar el pellet.
NOTA: El sobrenadante de BAL se puede almacenar a -70 oC para análisis futuros, por ejemplo, ELISA. - En caso de que haya glóbulos rojos presentes en el pellet debido a una inflamación pulmonar grave, después de retirar el sobrenadante, añadir 500 l de tampón de lylisis RBC y mezclar bien por resuspensión. Transfiera la solución a un nuevo tubo de 1,5 ml y centrífuga durante 7 minutos a una velocidad de 500 x g a 4 oC.
- Retire el sobrenadante y resuspender el pellet en 150 l de tampón FACS.
- Transfiera los 150 l de la muestra resuspendida a una placa de 96 pocillos y centrifuga la placa durante 7 minutos a una velocidad de 500 x g a 4 oC.
- Rápidamente, invierta la placa en papeles tisú para recoger las células que residen en la parte inferior de los pozos.
- Manchar las células con anticuerpos en el tampón FACS en presencia de 2,4G2 de anticuerpos de bloqueo (2,5 g / 100 l). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en un lugar oscuro.
- Después de la tinción, centrifugar la placa para peletizar las células a 500 x g durante 7 min a 4 oC.
- Retire la solución de tinción invirtiendo la placa en papel tisú y luego lave mediante resuspending con 100 l de tampón FACS. A continuación, centrifugar la placa de nuevo a 500 x g durante 7 min a 4 oC y retire el tampón FACS invirtiendo la placa sobre papel tisú.
- Resuspender muestras en 150 ml de tampón FACS y transferir muestras a los tubos FACS que contienen 350 l de búfer FACS. Agregue 25 ml de cuentantes de cuentas a cada muestra. Las muestras ya están listas para el análisis de citometría de flujo.
NOTA: Varios tipos de células en el líquido BAL fueron etiquetados con anticuerpos como se indica. Se añadieron cuentas de conteo antes de la ejecución del FACS. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando un software disponible comercialmente. Refiera al cuadro 3 y al cuadro 4 para la estrategia del gating.
- Digestión del tejido pulmonar para el análisis FACS
- Siga los pasos 3.1.1 - 3.1.3.
- Cortar la piel a partir del abdomen hasta el cuello con una tijera esterilizada. Fije la piel con agujas y corte las costillas para exponer los pulmones.
- Retire los pulmones enteros y lávelos con PBS frío. Colocar muestras en el tubo de 1,5 ml que contenga 50 ml de solución de digestión pulmonar.
- Picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños con una tijera curva. Transfiera los tejidos pulmonares a una placa de 6 pozos, luego agregue 8 ml de solución de digestión pulmonar. Colocar la placa sobre una coctelera en una incubadora de 37oC durante 45 min.
- Después de la incubación, utilice la parte superior del tubo de 1,5 ml para moler los tejidos pulmonares. Coloque un colador de 70 m en una nueva placa de 6 pocillos y aplique la muestra a través de un filtro de 0,22 m.
- Transfiera la solución filtrada a un tubo de 15 ml y, a continuación, centrifuga los tubos a 500 x g durante 7 min a 4 oC. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de lílisis RBC y dejarlo en hielo durante 3 min.
- Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 ml y centrífuga a 500 x g durante 7 min a 4oC. Repetir 2x
- Lavar las células pulmonares 2x con 1 ml de tampón FACS. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón FACS, y luego transferir 100 l de la muestra en una placa de 96 pozos.
- Centrifugar la placa durante 7 min a una velocidad de 500 x g a 4oC. Siga los pasos descritos en la recolección de fluidos BAL para el análisis de FACS (3.1.13 a 3.1.16) para manchar las células de las muestras de tejido pulmonar digerido.
NOTA: Los eosinófilos en los pulmones fueron etiquetados con anticuerpos como se indica, luego mezclados con cuentantes para un análisis adicional de FACS. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando software asociado. Consulte la Figura 3 para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por ARN HDM.
4. Análisis estadístico
- Realice análisis estadísticos utilizando un software disponible comercialmente.
- Determine los valores p mediante la prueba t de estudiante de dos colas sin pares para la comparación de dos grupos.
- Calcular los números absolutos de eosinófilos basados en cuentas de referencia (panel superior) utilizando la fórmula
- Determine los valores p por ANOVA bidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para la comparación de más de dos grupos.
- Considere un valor p menor que 0.05 como estadísticamente significativo. Los valores p se indican en parcelas como *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.001 y ****p<0.0001.
NOTA: Todas las recetas de búfer se proporcionan en la Tabla 5.
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Representative Results
La presencia de estructuras largas de dsRNA en HDM, insectos y animales pequeños no insectos fue examinada por punto btil utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón específico de dsRNA J2 (40bp). RNase III se utilizó para digerir el ARN en fragmentos de dsRNA de 12-15 bp, que eran indetectables por J2 (Figura 1).
La capacidad del ARN total del HDM para estimular una respuesta inmunitaria innata en los pulmones del ratón de una manera dependiente de la dosis fue analizada por RT-qPCR (Figura 2, superior). El tratamiento con RNase III abolió la actividad inmunoestimulante del ARN total del HDM, lo que indica que las estructuras de ARNm en el ARN total del HDM son esenciales para la actividad inmune innata en los pulmones(Figura 2, inferior).
Con el análisis FACS se evaluaron los efectos inhibitorios del ARN total del HDM en el desarrollo de una inflamación pulmonar grave de tipo 2 (Figura 3A). En este estudio, la inflamación pulmonar eosinofílica fue inducida por extractos de HDM, que fueron tratados con o sin RNase III como se muestra en el diseño experimental (Figura 3B). El tratamiento con RNase III se utilizó para eliminar especies de dsRNA largos de extractos de HDM. Como era de esperar, la degradación de las especies de dsRNA largos dio lugar a una inflamación pulmonar grave de tipo 2 reflejada por el aumento del número de eosinófilos en BAL y pulmones. En particular, el número de eosinófilos en el grupo total tratado con ARN HDM es comparable al grupo tratado con el extracto de HDM original que contiene endógenamente la especie dsRNA larga (Figura 3B).
Figura 1: Detección de las estructuras dsRNA en ARN HDM por DsRNA específico J2 Ab utilizando punto blot. El ARN total de diferentes aeroalérgenos, incluyendo Dermatophagoides farinae (D.f.) y Dermatophagoides pteronyssinus (D.p.) fue borrado en una membrana de nylon para la detección de dsRNA(panel izquierdo). HDM (D.f. y D.p.) El ARN no se trató (-), se trató con RNase III (nucleasa específica de ARN) y RNase T1 (nucleasa específica de ARN)(panel derecho). Esta figura se reimprime de She et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: RT-PCR midió la inducción de la expresión de ARNm ISG por ARN total de HDM (D.f.). Cuando se entrega en los pulmones del ratón, el ARN HDM fue capaz de estimular la expresión de ISGs de una manera dependiente de la dosis (panel superior). El tratamiento con RNase III eliminó la actividad estimulante inmune del ARN de HDM(panel inferior). Esta figura se reimprime de She et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de tipos celulares específicos en las vías respiratorias y evaluación de fluidos BAL y eosinófilos pulmonares. (A) La estrategia de gating utilizada para identificar las células recuperadas del fluido BAL se tiñeron para los marcadores de superficie celular como se indica. (B) Administración de ARN de HDM (D.f.) a 5 g/ratón (barra azul) frente al control de ARN pulmonar del ratón (barra roja). El ARN HDM (D.f.) pero no el extracto de HDM agotado por el ARN disminuyó el número de eosinófilos tanto en las vías respiratorias como en los pulmones de los animales tratados con extracto de HDM. Esta figura se reimprime de She et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ratón Primers | Secuencia (Retroceso directo, 5'-3') | |
| RPL19 | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| IL1 | TCTATACCTGTCCTGTGTAATG; GCTTGTGCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT |
|
| ISG15 | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTTTTT |
|
| Mx1 | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 | GGATGCCTGGGAGAATCG; TCGCCTGCTCTTCGAAACTG |
|
| Tnfα | CCTCCCTCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tabla 1: Rt-qPCR Primers.
| Reactivos | Volumen (10 l) | |
| Supermezcla universal SYBR verde (2x) | 5 l | |
| Imprimaciones hacia delante y hacia atrás (5 m) | 1 l | |
| Plantilla de ADNc | 0,4 l | |
| H2O libre de DNase y RNase | 3.6 l | |
Tabla 2: Configuración de la mezcla maestra para RT-qPCR.
| Pasos | Temperatura | Hora |
| Paso 1 | 95 oC | 3 minutos |
| Paso 2 | 95 oC | 10 segundos |
| Paso 3 | 55 oC | 30 segundos |
| Paso 4 | Vaya al paso 2 , (Repetir 2-3 para 39 ciclos) | |
| Paso 5 (Curva de fusión) | 55 oC a 95 oC | 0,5 oC, incrementos (el tiempo de espera es de 5 segundos) |
Tabla 3: Programa para ejecutar el RT-qPCR.
| 1. Cree una gráfica compuesta de dispersión hacia delante (FSC) y lateral (SSC). |
| 2. Cree una pequeña parcela para contar cuentas (FSC bajo, FITC alto). |
| 3. Cree una gráfica para solo puerta para células vivas mientras excluye las células muertas usando el tinte BV510. |
| 4. Las células vivas se pueden separar en poblaciones altas de CD11c y CD11c bajas. |
| 5. Desde la puerta de alta población CD11c para macrófagos (SiglecF alto MHCII bajo) y DCs (SiglecF bajo, MHCII alto). |
| 6. De la puerta baja CD11c para las células T (CD3/19 alto, MHCII bajo), y las células B (CD3/19 alto, MHCII alto). |
| 7. De la población de células CD3/19null CD11c bajas, puerta para neutrófilos (CD11b alto, Ly-6G alto) y eosinófilos (CD11b alto, Ly-6G bajo, SiglecF alto). |
| 8. Para la estrategia de gating de eosinófilos en los tejidos pulmonares, utilice estos marcadores después de excluir las células muertas que utilizan el tinte BV510 (CD45, SiglecF, CD11C). |
Tabla 4: FACS en ejecución
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl |
| pH 7,5 |
| TBS-T: |
| 0.05% Tween-20 en TBS |
| Bloqueo del búfer |
| 5% leche sin grasa diluida en TBS-T |
| Búfer de dilución de anticuerpos |
| 1% leche sin grasa diluida en TBS-T |
| PBS+EDTA |
| 1x PBS + 0,1 mM EDTA |
| Búfer FACS |
| 2% Suero de Becerro Fetal (FCS) en 1x PBS |
| Medio celular total |
| RPMI 1640, 1X Glutamax, 10% FCS, 50 m 2-mercaptoetanol y penicilina-estreptomicina. |
| Solución para la digestión pulmonar |
| Medio celular total más Liberase (50 g/ml) y DNase I (1 g/ml) |
Tabla 5: Recetas para tampones y solución
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Discussion
El protocolo actual describe cómo evaluar las propiedades inmunoestimuladoras del ARN microbiano asociado al alérgeno y sus impactos en el desarrollo de la inflamación pulmonar eosinofílica en un modelo de ratón de asma alérgica. Aunque los dsRNAs largos se conocen como los intermedios de replicación de muchos virus que pueden activar poderosamente las respuestas de interferón en las células de los mamíferos, sus presencias en los alérgenos HDM se han desconocido hasta nuestro trabajo reciente15. La combinación de análisis de puntos de ARN, RT-qPCR y FACS presentados en este manuscrito puede proporcionar un buen ejemplo para diseccionar componentes innatos como las especies de dsRNA en alérgenos ambientales que están involucrados críticamente en la regulación de la inflamación eosinofílica inducida por alérgenos.
En este protocolo, se ha empleado la mancha de puntos de ARN para detectar la presencia de estructuras de dsRNA en alérgenos naturales utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón J2, que se une específicamente al dsRNA (40bp) independiente de la secuencia. Este método es altamente fiable porque el anticuerpo J2 todavía puede reconocer muestras de dsRNA pretratadas con RNase T1 (endonucleasa específica de ARN de una sola cadena), pero no muestras pretratadas con RNase III (una endonucleasa específica de dsRNA). Sin embargo, vale la pena señalar que se ha informado de que un análogo sintético ampliamente utilizado de dsRNA, Polyinosinic:polycytidylic acid [Poly(I:C)], se ha informado de que se une preferentemente a otro anticuerpo monoclonal anti-dsRNA K1, en lugar de J221,22,23. Por lo tanto, no se recomienda el uso de anticuerpos J2 para la detección de Poly(I:C).
El análisis del tipo de célula en muestras recogidas de BAL o tejidos pulmonares es útil para evaluar la progresión de la inflamación pulmonar alérgica. Aunque el procedimiento BAL es una técnica común, los resultados pueden variar entre los laboratorios de investigación. Numerosos factores pueden causar estas variaciones como la cantidad de lavado broncoalveolar recogido. El volumen ideal de BAL recuperado de un 8-12 semanas de edad ratones de edad es de 3 ml19. Otro factor que puede contribuir a la falta de reproducibilidad es la profundidad con la que se debe insertar el catéter en la tráquea (0,5 cm es óptimo) porque la inserción más profunda de los catéteres puede causar daños en la tráquea. Además, los investigadores también deben tener en cuenta otros factores como la edad, la tensión y el sexo de los ratones, ya que estos factores pueden afectar en gran medida los resultados del experimento27,,28,,29.
Aquí, proporcionamos un protocolo técnico para caracterizar los efectos inmunomoduladores del ARN HDM in vitro e in vivo utilizando el análisis de puntos de ARN, RT-qPCR y FACS de BAL y tejidos pulmonares. Las prácticas adecuadas pueden garantizar la reproducibilidad exitosa de los resultados obtenidos al realizar estas técnicas. Por ejemplo, trate de evitar la contaminación de las RNases al realizar la mancha de puntos de ARN. Además, la velocidad de centrifugación debe ajustarse correctamente, ya que la velocidad de centrifugación innecesariamente mayor puede comprometer la viabilidad celular. Finalmente, las células utilizadas para el análisis FACS deben ser fijadas si no se analizan el mismo día.
Dado que la inmunidad innata desempeña un papel fundamental en la defensa del huésped y la inflamación2,3, las técnicas y métodos descritos en este documento serán muy útiles para estudiar el papel inmunomodulador de otros componentes inmunes innatos como el ADN microbiano en alérgenos naturales en el desarrollo de la inflamación de tipo 2.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Karla Gorena por la asistencia técnica en citometría de flujo. L.S. cuenta con el apoyo del Consejo de Becas de China y la Fundación Provincial de Innovación de Hunan para El Posgrado (CX201713068). H.H.A. cuenta con el apoyo del Departamento de Ciencias de Laboratorio Clínico, Facultad de Ciencias Médicas Aplicadas, Universidad Jouf, Sakaka, Arabia Saudita. X.D.L. cuenta con el apoyo del Fondo de Inicio de la Escuela de Medicina de UT Health San Antonio y el Fondo Max y Minnei Voelcker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
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