Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61476
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Colorado Center for Reproductive Medicine

Summary

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

Abstract

زرع الإنسان، والرضا والالتصاق على سطح الرحم epithelia والغزو اللاحق للبلاستيس في decidua الأم، هو حدث البيولوجية الحرجة ولكن ملغز التي كانت تاريخيا صعوبة في الدراسة بسبب القيود التقنية والأخلاقية. يتم البدء في عملية الزرع عن طريق تطوير التروبكتوميرم إلى الأرومية المبكرة والتمايز اللاحق إلى خطوط فرعية متمايزة. قد يؤدي التمايز التروبيبلاستي المبكر المُنحرف إلى فشل الزرع وأمراض المشيمة وتشوهات الجنين والإجهاض. وقد تم مؤخراً تطوير طرق تسمح للأجنة البشرية بالنمو حتى اليوم الثالث عشر بعد الإخصاب في المختبر في غياب أنسجة الأمومة، وهي فترة زمنية تشمل فترة الزرع في البشر. وقد أعطى هذا الباحثين الفرصة للتحقيق في زرع الإنسان واختصار ديناميات التمايز trophoblast خلال هذه الفترة الحرجة دون الخلط بين التأثيرات الأم وتجنب العقبات الكامنة في دراسة الأحداث المبكرة لتمايز الأجنة في الجسم الحي. لتوصيف مختلف الطانيف الفرعية trophoblast أثناء الزرع، اعتمدنا القائمة ثنائية الأبعاد (2D) أساليب الثقافة الموسعة ووضعنا إجراء لهضم وعزل الأنزيمية أنواع مختلفة من الخلايا trophoblast لمقايسات المصب. الأجنة المستزرعة في ظروف ثنائية الأبعاد لديها مورفولوجيا مسطّحة نسبيًا وقد تكون دون المستوى الأمثل في النمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. ومع ذلك، يبدو أن التمايز الأرومية أقل تأثرا كما يتضح من التغيرات المتوقعة في المورفولوجيا والتعبير الجيني على مدى الثقافة الممتدة. يمكن فصل مختلف التوروفوبلاست sublineageages، بما في ذلك cytotrophoblast، syncytiotrophoblast وتوروفوبلاست المهاجرة حسب الحجم، والموقع، والظهور الزمني، واستخدامها لمزيد من التوصيف أو التجريب. قد يكون فحص هذه الخلايا الأرومية المبكرة مفيدًا في فهم زرع الإنسان ، وعلاج أمراض المشيمة الشائعة ، وتخفيف حدوث فقدان الحمل.

Introduction

من الصعب تاريخياً التحقيق في زرع الإنسان وظهور المشيمة المبكرة ولا يزالان مجهولين إلى حد كبير لأن الأنسجة البشرية لا يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التي لا يمكن فيها اكتشاف الحمل سريرياً. النماذج الحيوانية غير كافية، حيث أن المشيمة البشرية لها ميزاتها الفريدة مقارنة بالثدييات الأوروبية الأخرى. على سبيل المثال ، تغزو المشيمة البشرية بعمق في decidua مع بعض الخلايا الأرومية التي تصل على الأقل إلى الثلث الداخلي من ميوميتوميوم الرحم بينما تعيد الخلايا الأخرى تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية. حتى أسلافنا التطورية الأقرب، الرئيسيات غير البشرية، تظهر الاختلافات في مورفولوجيا المشيمة والتفاعلات الأرومية مع الأنسجة الوَرَقِية الأمومية1،2،3. الحصول على ما قبل زرع الأجنة البشرية في المختبر لم يكن ممكنا حتى في عام 1980 عندما بدأ الإخصاب البشري السريري في المختبر (IVF) كممارسة روتينية لعلاج العقم4. الآن، يمكن زراعة الكيسات البشرية في المختبر للسماح باختيار أجنة أكثر قابلية للحياة لنقلها، فضلا عن تمكين الاختبارات الجينية الآمنة. وقد أدى التحسن في تقنيات زراعة الأجنة، فضلا عن زيادة استخدام التلقيح الاصطناعي العديد من البلاستوسيستات الفائضة التي لا تزال بعد الانتهاء من دورات علاج المريض. مع موافقة المريض، موافقة IRB، ومع بعض القيود، يمكن استخدام هذه البلاستوسيست للدراسات البحثية. لقد أصبحت موردا لا يقدر بثمن التي كانت تستخدم لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية5, فهم انتقال كتلة الخلايا الداخلية إلى الخلايا الجذعية الجنينية6,7, ومؤخرا, وقد تم استزراع بنجاح حتى يوم (D) 13 لإعادة تشكيل زرع الإنسان8,9. من خلال الاستفادة من النهج التي وضعت مؤخرا أوميكس خلية واحدة، والوصول إلى هذه الزرع في مرحلة أنسجة الأجنة البشرية قد عرضت فرصا فريدة لوصف الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية تمايز الخلايا ديناميكية للغاية، والتي كان من المستحيل في السابق لاستكشاف10،11،12،13.

هنا، نحن وصف الأساليب المستخدمة في نشرتنا الأخيرة التي تميز ديناميات التمايز trophoblast أثناء زرع الإنسان12. ويشمل هذا البروتوكول ارتفاع درجة حرارة الخلايا البلاستية vitrified، وتربية الجنين الموسعة تصل إلى D12 بعد التلقيح الاصطناعي، والهضم الأنزيمي للجنين في خلايا واحدة، وجمع الخلايا للمصب المقايسات(الشكل 1). هذا النظام ثقافة موسعة تدعم مرحلة ما قبل زرع تطور الجنين البشري دون مدخلات الأم وتلخص التمايز trophoblast التي تظهر متسقة مع الملاحظات التي أجريت من العينات النسيجية منذ سنوات عديدة14,15,16,17. أثناء الزرع، يتكون عدد الخلايا الدودة التورفوبلاستية من نوعين على الأقل من الخلايا: الخلايا ذات الأصل الأحادي النوى الشبيهة بالسيلوتروبوفبلاست (CTB) والـ متزامنة متعددة النوى (STB) متمايزة بشكل ميؤوس من شفائها. عند هضم التربسين ، فإن CTB هي خلايا صغيرة مستديرة لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن أنساب الخلايا الأخرى (الشكل 2A، اللوحة اليسرى). فصل CTB من أنساب الخلايا الأخرى، مثل الغموض و endoderm البدائية، يمكن تحقيقه من خلال ملفاتهم الشخصية المستنسخة المتميزة التي كشفت عنها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يمكن التعرف بسهولة على خلايا Syncytiotrophoblast على أنها هياكل غير منتظمة الشكل أكبر بكثير من أنواع الخلايا الأخرى وتقع بشكل رئيسي في محيط الجنين(الشكل 2A، اللوحة الوسطى ؛ الشكل 2B، لوحة اليسار). الخلايا التروبيبلاستية المهاجرة (MTB) هي آخر الترومبوست sublineage وجدت خلال نموت الجنين وتمدد ويمكن التعرف على أنها تتحرك على ما يبدو بعيدا عن الجسم الرئيسي للجنين(الشكل 2A، لوحة الحق ، الشكل 2B، لوحة الحق). الترود الأروميست المهاجر ، على الرغم من التعبير عن العديد من العلامات نفسها مثل trophoblast (EVT) ، لا ينبغي أن يشار إليه باسم EVT ، لأن الهياكل التافهة في المشيمة لم تظهر في هذه المرحلة المبكرة من التطور.

تجريبيا، كنا قادرين على جمع CTB صغيرة وكبيرة STB التي يمكن تمييزها بسهولة بعد يتم هضم الأجنة في خلايا واحدة في D8، D10، وD12(الشكل 2A، B). تنشأ التروبيبلاستات المهاجرة في المراحل اللاحقة من زراعة الجنين الممتدة ويمكن جمعها عند D12 قبل الهضم الأنزيمي للجنين بأكمله(الشكل 2A, B). عن طريق فصل ظاهري هذه الثلاثة الفواصل الفرعية trophoblast قبل تحليل خلية واحدة، يمكننا تحديد علامات النسخ محددة وتحديد الدور البيولوجي لكل نوع خلية. Cytotrophoblast هي الانتشارية للغاية وتعمل كخلايا السلف في توريد STB وMTB ينساب متباينة10,11,12,13. Syncytiotrophoblast تشارك في انتاج هرمونات المشيمة للحفاظ على الحمل ، ويمكن أيضا أن تكون مسؤولة عن الأجنة التجشؤ في بطانة الرحم10،11،12،13. التربوبلاست المهاجرة لديها ميزات أقوى من النمط الظاهري الغازية، و المهاجرة ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن أعمق وأكثر اتساعا استعمار بطانة الرحم10,11,12,13. بعد تعريف التوقيع النسخي لكل نوع خلية، كشفت تحليلات التجميع أيضاً عن مجموعتين فرعيتين إضافيتين من الخلايا التي لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن CTB وكان لها نسخ مع ميزات STB وMTB، على التوالي12. ومن المرجح أن تكون هذه الخلايا المتوسطة في مرحلة التمييز من CTB إلى المستويات الفرعية MTB أو STB، وكان سيتم تجاهلها إذا تم هضم الأجنة بشكل أعمى وفصل الخلايا عن طريق النسخ وحدها.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D) وقد لا يكون الأمثل لدعم التنمية الهيكلية ثلاثية الأبعاد ( 3D ) ، كما اقترح منشور حديث يصف نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد تم تطويره حديثًا13. ومع ذلك، في هذا النظام 2D التمايز من trophoblast في وقت مبكر يبدو أن تتفق مع الملاحظات التي أجريت من العينات في vivo14،15،16،17. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسهولة تكييفها للاستخدام في نظام الثقافة 3D وصفها مؤخرا13 مع الحد الأدنى من التغييرات. يتم تنفيذ جميع الخطوات مع ماصة micromanipulation المحمولة مع نصائح المتاح تجاريا المتاح أو ماصة الفم من ماصة الزجاج سحبت ناعما تعلق على أنابيب المطاط، وتصفية، وبوق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم التبرع بجميع الأجنة البشرية بموافقة لاستخدامها في البحوث. وقد وافق المجلس الغربي لمراجعة المؤسسات (دراسة رقم 1179872) على بروتوكولات لثقافة الأجنة البشرية الموسعة، وتتبع المبادئ التوجيهية الدولية. يجب مراجعة أي استخدام للأجنة البشرية من قبل الأخلاقيات المناسبة ومجالس الإدارة المرتبطة بالمؤسسة البحثية التي تستخدم هذا البروتوكول.

1- الإعداد

  1. إعداد وسائل الإعلام ولوحات الاسترداد يوم واحد قبل احترار الجنين في غطاء تدفق معقم.
    1. إعداد 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الكيسات (BM) مع 10٪ v / v المصل البروتين بديل (SPS).
      ملاحظة: وسائط ثقافة Blastocyst قد أو قد لا تحتوي على بروتين المضافة. هنا، استخدمنا وسيلة التي يجب أن تستكمل مع 10٪ من البروتين الألبومين المشار إليها. تحقق من إرشادات الشركة المصنعة للتنويع في هذا المكملات. يجب أن يتم تصفية جميع الوسائط باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر معقمة مرفقة بحقنة معقمة قبل التوازن.
    2. ملء اثنين من مركز جيدا الجهاز ثقافة غسل الأطباق مع 500 ميكرولتر من BM مع 10٪ v / v SPS مغطاة 500 ميكرولتر من زيت الصف ثقافة الجنين.
    3. في طبق ثقافة الأنسجة 60 ملم، طبقة 8 مل من زيت ثقافة الجنين ومن ثم مرساة 20 ميكرولتر قطرات من BM مع 10٪ V / v SPS إلى الجزء السفلي من لوحة الثقافة. جعل 1 قطرة لكل جنين الدفء.
      ملاحظة: قد يتم إجراء المزيد من الأطباق، والأطباق المُسَرَكة، والغسيل حسب الحاجة. ويمكن أيضا أن تضاف قطرات إلى الطبق قبل الطبقات النفط. سوف ترسو قطرات تحت النفط تساعد على الحد من التبخر وأي تغييرات لاحقة في osmolality.
    4. اكويريبرات BM مع 10٪ v / v SPS غسل الأطباق وطبقة الانتعاش في حاضنة في 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، 5٪ O2 على الأقل 4 ح.
    5. ذوبان قارورة واحدة من الخطوة الأولى من وسائل الإعلام ثقافة موسعة (IVC1) في 4 درجة مئوية أو على أعلى مقاعد البدلاء.
    6. إعداد طبق واحد من غسل 500 ميكرولتر من IVC1 مع عدم وجود تراكب النفط. Aliquot ما يقرب من 4 مل من IVC1 في أنبوب سقف المفاجئة 5 مل.
    7. اكويريبرات IVC1 غسل طبق وصغيرة المفاجئة أنبوب الغطاء من IVC1 في 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، والغلاف الجوي O2 على الأقل 4 ح.
  2. إعداد لوحات الثقافة الموسعة يوم واحد قبل احترار الجنين في غطاء تدفق معقم laminar.
    1. تخفيف الليفي من مصل الإنسان في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) إلى 30 ميكروغرام / مل. 250 ميكرولتر من 30 ميكروغرام/مل سوف تكون هناك حاجة إلى الليفي لكل جنين لمعطف الغرف.
    2. فتح 8 جيدا غطاء غطاء حزمة تحت غطاء محرك السيارة مع الحرص على عدم لمس الآبار. بلطف ماصة 250 ميكرولتر من 30 ميكروغرام / مل فيبرومينكتين في كل بئر.
    3. العودة الغطاء إلى غطاء الغرف ومكان في 4 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
  3. إعداد لوحة الثقافة الموسعة في صباح ارتفاع حرارة الجنين.
    1. استرداد غطاء الغرف مع fibronectin ومكان في غطاء تدفق اللامينار. إزالة خليط fibronectin مع ماصة 1 مل والتخلص منها في حاوية النفايات.
    2. استرداد الدافئة، وسائل الإعلام IVC1 توازنها من أنبوب صغير غطاء المفاجئة 5 مل.
    3. Pipette 300 μL من IVC1 توازنها في كل بئر. يجب الحرص على عدم السماح لأي سائل تلمس الغطاء لأن هذا سيزيد من خطر التلوث.
    4. العودة غطاء الغرف مع IVC1 لاحتضان في 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، والغلاف الجوي O2 حتى إزالة pellucida زونا في الخطوة 4.

2. ارتفاع درجة حرارة الأجنة البشرية D5

ملاحظة: قد يكون لدى الشركات المصنعة الأخرى بروتوكولات مختلفة قليلاً وفقاً لتكنولوجيا التزجيج الخاصة بها. راجع إرشادات الشركة المصنعة للاستخدام عند الانطباق.

  1. دافئ 3.0 مل من محلول الذوبان (TS) في طبق 35 مم إلى 37 درجة مئوية. جلب 300 ميكرولتر من محلول التخفيف (DS) واثنين من الآبار من 300 ميكرولتر من محلول الغسيل (WS) في 6 صحن إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. باستخدام ملقط، قم بإزالة كم جهاز التبريد بعناية مع التأكد من أن الجنين vitrified يبقى دائما تحت النيتروجين السائل.
  3. بسرعة نقل جهاز cryo من النيتروجين السائل ويغرق غيض من جهاز التبريد في TS في 37 درجة مئوية. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 1 دقيقة والحفاظ على جهاز التبريد المغمورة حتى ينفصل الجنين في TS.
    ملاحظة: أجنة دافئة واحدة في كل مرة لتتبع هويات الأجنة لأنها قد تتعلق بالمعلومات الديموغرافية المريضة في تحليل المصب.
  4. خلال فترة الحضانة 1 دقيقة في TS، قم بإزالة جهاز التبريد بعناية والتقط الجنين بلطف والانتقال إلى الجانب الآخر من طبق TS.
    ملاحظة: إذا كان زراعة أجنة متعددة، يجب أن يكون مجتهداً لإبقاء الأجنة منفصلة لضمان الحفاظ على الهويات الصحيحة.
  5. بعد 1 دقيقة، التقط بلطف الجنين مع كمية صغيرة من TS، حوالي 2 ميكرولتر. نقل الجنين إلى الجزء السفلي من 300 ميكرولتر DS جيدا في حين تغطي الجنين في طبقة رقيقة من TS من ماصة. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 3 دقائق ووضع لوحة 6-جيدا على أعلى مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد 3 دقائق، التقط الجنين بكمية صغيرة من الـ DS، حوالي 2 ميكرولتر، ثم حرك الجنين إلى أسفل البئر التالي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من WS. مرة أخرى، طبقة بلطف كمية صغيرة من DS من ماصة على الجنين. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 5 دقائق والعودة إلى أعلى مقاعد البدلاء.
  7. بعد 5 دقائق، التقط الجنين مع الحد الأدنى من حجم WS والانتقال إلى أعلى البئر النهائي من 300 ميكرولتر WS. سوف الجنين ببطء تسقط وتغسل من خلال WS إلى القاع. طرد أي WS محتفظ بها من الماصات إلى بئر فارغة.
  8. التقط الجنين بأقل حجم وارجع إلى أعلى نفس بئر WS الذي 300 ميكرولتر. سوف يسقط الجنين مرة أخرى إلى قاع البئر. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 1 دقيقة والعودة لوحة 6-جيدا إلى أعلى مقاعد البدلاء.

3- استعادة الأجنة الدافئة

  1. واحد في وقت واحد، ونقل الأجنة الدافئة في طبق أنسجة الجهاز مركز جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من BM توازنها مع 10٪ v / v SPS تحت 500 ميكرولتر من زيت الصف ثقافة الجنين اختلال.
  2. غسل الأجنة عن طريق التقاط كل جنين ونقلها حولها إلى عدة مناطق في الطبق في حين تهب وسائل الإعلام القديمة بين التحركات. التقط الجنين ونقله إلى قطرة ثقافة 20 ميكرولتر من BM المُزالة بـ 10% v/v SPS تحت الزيت.
  3. اسمحوا الأجنة الدافئة استرداد ل 2 ح في ح ح في ح ح 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، 5٪ O2.

4. Zona إزالة

  1. بعد الشفاء 2 ساعة، وتقييم الأجنة لإعادة التوسع، واتخاذ صور لكل جنين.
  2. نقل الأجنة بشكل فردي في 500 ميكرولتر من 3-(N-morpholino)-حمض البروبانسيلفونيك (MOPS) - مؤقتا التعامل مع المتوسطة مع 5٪ (الخامس / الخامس) مصل عجل الجنين (FCS) قبل العلاج مع حل تيرود الحمضية.
  3. حرك جنينًا واحدًا بسرعة من خلال 300 ميكرولتر من محلول تيرود الحمضية الدافئة أثناء المشاهدة النشطة من خلال المجهر. سوف تبدأ زونا pellucida بصريا في حل. هذا سوف يستغرق حوالي 5 s.
  4. نقل على الفور الجنين مع حل زونا في 300 ميكرولتر من MOPS الدافئة المخزنة المتوسطة لإخماد محلول تيرود الحمضية.
  5. نقل الجنين مع الحد الأدنى من حجم MOPS المخزنة المتوسطة في مركز جيدا الجهاز طبق الأنسجة التي تحتوي على 500 ميكرولتر من BM توازن مع 10٪ v / v SPS تحت 500 ميكرولتر من زيت الصف زراعة الجنين لغسيل.
  6. ارجع الجنين إلى إسقاط الاسترداد 20 ميكرولتر من الخطوة 3.2.
    ملاحظة: عند الفحص البصري بعد إزالة زونا، يمكن معالجة أي أجنة مع pellucidae زونا الاحتفاظ بها كذلك مع حل تيرود الحمضية إذا لزم الأمر، عن طريق تكرار الخطوات 4.2-4.6. من المرغوب فيه تقليل التعرض إلى حل التيرود.

5. Blastocyst ثقافة موسعة

  1. نقل الأجنة بشكل فردي إلى طبق الغسيل مع وسائل الإعلام IVC1 من الخطوة 1.1.6. نقل بعناية واحد الجنين إلى بئر واحدة من غطاء الغرف مع IVC1 توازنها والحفاظ على تحديد الجنين.
    ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم الانتهاء بأسرع وقت ممكن لتقليل التبخر المتوسط.
  2. عودة غطاء الغرف إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، الغلاف الجوي O2 لمدة 2 أيام.
    ملاحظة: تأكد من ذوبان وتكذيب وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية، 6٪ CO2، O الغلاف الجويللوسائط تبادل 4 ساعة مقدما.
  3. عند النمو التدريجي D2 (D7 بعد الإخصاب)، قم بفحص ارتباط الأجنة تحت المجهر بعناية وقم بإجراء تبادل الوسائط.
    1. لاحظ أي جنين يتم إرفاقه بالطبق قبل تبادل الوسائط. اضغط بلطف على اللوحة وتفحص ما إذا كان الجنين قد تعلق بشكل آمن على اللوحة تحت المجهر.
    2. إزالة الغطاء وإزالة بعناية 150 ميكرولتر من IVC1 وتجاهل في حين لا يزعج الجنين المرفقة. إذا لم يكن الجنين قد تعلق بعد على لوحة، لا تبادل وسائل الإعلام، كما المصل في IVC1 سوف تساعد في مرفق الجنين.
    3. Pipette 150 μL من وسائل الإعلام الثقافة الموسعة الموازنة ، IVC2 ، ببطء في كل بئر والعودة الغطاء إلى غطاء الغرف.
      ملاحظة: تأكد من تقليل إزالة الغطاء من غطاء الأغطية المحاط بحجرة إلى أدنى حد لتجنب التبخر المتوسط.
  4. أعد بعناية غطاء الأغطية المُرفَر إلى الحاضنة دون رش أي وسائط على الغطاء. كرر تبادل وسائل الإعلام وتعلق تحقق كل يوم من ثقافة ممتدة حتى الأجنة جاهزة لل التثبيت أو هضم خلية واحدة.

6. مجموعة اختيارية من وسائل الإعلام المستهلكة

  1. اختياريا، وجمع وسائل الإعلام المستهلكة أثناء تبادل وسائل الإعلام الثقافية بعد D7 أو أي يوم بعد ذلك. أثناء الخطوة 5.3.2، بدلاً من تجاهل المحاذاة المتوسطة تجميد 150 ميكرولتر من IVC1 إزالتها في أنبوب معقم، منخفض الربط 0.5 مل للتحليل في المستقبل.

7. تثبيت اختياري للflufluorescence

  1. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لغسل الأجنة مع 1/2 تبادل وسائل الإعلام من برنامج تلفزيوني لمدة 3x قبل التثبيت لإزالة أي حطام خارج الخلية. غسل الحطام الزائد والبروتين سيساعد على تحسين الوضوح والحد من الخلفية في الصور التي تم الحصول عليها مع المناعة.
  2. إزالة جميع وسائل الإعلام وإضافة ببطء 200 ميكرولتر من 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى البئر. سوف يرغب الجنين في التمسك بسطح السائل. متعددة 150 μL يغسل مع 4٪ PFA قبل إزالة كل السوائل سوف تساعد على تقليل أي ضرر للجنين.
  3. احتضان الأجنة في PFA 4% لمدة 20 دقيقة لتثبيت.
  4. غسل الأجنة 3x لمدة 10 دقيقة لكل غسل مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ v/ v بوليسوربات 20 في برنامج تلفزيوني جديد.
  5. تخزين الأجنة الثابتة في 0.1٪ v/v polysorbate 20 في PBS عند 4 درجة مئوية قبل المضي قدما في بروتوكول المناعةfluorescence.

8. هضم الخلية واحدة مع تريبسين

ملاحظة: الأجنة الطازجة (غير الثابتة) تستخدم في عملية هضم الخلايا المفردة.

  1. اغسل الجنين مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من محلول التربسين لكل بئر. العودة أغطية الغرف إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة غطاء الغرف من الحاضنة وفحص الأجنة تحت منظار مجسم. سوف تبدأ الخلايا على أطراف الجنين في التراجع وينبغي أن يكون MTB لا يزال تعلق على لوحة حيث يتم في مكان بعيد من الجنين.
  3. استخدام ماصة صغيرة أو ماصة الفم سحبت ناعما لالتقاط MTB الفردية قبل كسر بعيدا الجنين كله. تجاوز إلى الأمام إلى الخطوة 9.1 لحفظ MTB والعودة إلى الخطوة 8.4 بعد الخطوة 9.3.
  4. استخدام ماصة micromanipipulation المحمولة أو ماصة الفم لتم فصل بلطف الجنين عن طريق التعرق صعودا وهبوطا.
  5. ستبدأ الخلايا في الانفصال عن الجنين بأكمله. الاستمرار في التبخر الجنين بلطف وبشكل متكرر باستخدام طرف الماصات قطرها أصغر أو ماصة الفم حتى تم احتضان الجنين لما مجموعه 10 دقيقة في التربسين.

9. اختيار خلية واحدة وجمع عينة

  1. مع الحد الأدنى من التربسين، نقل الخلايا المتفككة من خلال ثلاث قطرات غسل من 20 ميكرولتر PBS + 0.1٪ بولي فينيلبيروليدون (PVP) تحت زيت ثقافة الجنين مع الحرص على عدم فقدان أي خلايا.
  2. بعد غسل الخلايا، استخدم ماصة زجاجية تم سحبها بدقة لتحديد خلية واحدة. بعناية ماصة الخلية الواحدة في أنبوب معقمة 0.2 مل منخفضة الربط مع الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني + 0.1٪ PVP.
  3. المفاجئة تجميد الخلايا المفردة في النيتروجين السائل (LN2)،وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها(الشكل 2B). بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتتفكك (الشكل 2C). من تجربتنا، تم إرفاق ما يقرب من 75٪ من الأجنة إلى الجزء السفلي من طبق ليفي المغلفة في 48 ساعة، وزاد المرفق إلى ما يقرب من 90٪ من 72 ح في الثقافة. قد يتأثر نجاح مرفق الجنين إلى حد كبير بالجودة الأولية للبلاستوسيست. الأجنة غير المرفقة من قبل 72 ساعة من المرجح أن لا البقاء على قيد الحياة.

في D8 بعد الإخصاب (D3 من ثقافة موسعة)، كانت معظم الخلايا في الأجنة CTB التي كانت إيجابية لعلامة trophoblast GATA3(الشكل 3A). وقد بدأت Cytotrophoblasts بالفعل للتمييز في STB متعددة النوى على محيط الجنين(الشكل 2B، لوحة اليسار ، خط منقط). وكان لهذه STB مظهر ورقة مثل وكانت ملطخة إيجابية للgonadotropin المشيمية الإنسان بيتا (hCGB; الشكل 3A، لوحة مركز). نمت الأجنة بسرعة، بين D8 و D10، مما يشير إلى انتشار الخلايا السريعة من CTB خلال هذه الفترة. في D10، كان تشكيل CGB MTB إيجابية في الحد الأقصى، والتي يمكن تأكيدها من خلال ارتفاع إنتاج HCG في هذا الوقت (الشكل 3B). كما بدأت الأرومية المهاجرة في الظهور وهاجرت بعيداً عن جسم الجنين وكانت ملطخة بإيجابية لعلامة EVT، HLA-G(الشكل 3A، اللوحة اليمنى). من D12، كان التمايز STB في انخفاض وإنتاج MTB أصبح أكثر بروزا، مما يشير إلى تحول التركيز من إنتاج الهرمونات على D10 إلى هجرة الخلايا على D12. وقد لوحظت هذه التغييرات من قبل الفيديو الفاصل الزمني التي تم الحصول عليها خلال هذه الفترة شبه زرع(الفيلم 1). كما عكست بيانات تسلسل خلية واحدة RNA هذه التغيرات الديناميكية في وظيفة الخلية. معا، تشير هذه البيانات إلى التمايز التروفوبلاست المبكر وظهور المشيمة المبكرة هو عملية ديناميكية، خلالها يمكن للجنين إعطاء الأولوية لوظائف الخلايا المتخصصة للغاية في نقاط زمنية محددة للغاية لتحقيق زرع ناجح.

Figure 1
الشكل 1: التخطيط الإجرائية من البيانات الموروثة الموسعة وجمع عينة خلية واحدة.
سير العمل من أجنة vitrified الاحترار، زونا pellucida إزالة، ثقافة الجنين الموسعة، والهضم الأنزيمي، وعزل cytotrophoblast (CTB)، syncytiotrophoblast (STB)، وتوروفوبلاست المهاجرة (MTB). وقد تم تعديل هذا الرقم من الغرب وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المورفورولوجيا من الخلايا الأرومية الأرومية والأجنة خلال فترة الاستزراع الموسعة.
(أ) صور تمثيلية لأنواع الخلايا التروفوبلاست المختلفة بعد الهضم الأنزيمي مع التربسين. CTB صغيرة على اليسار، STB كبيرة في الوسط، و MTB على اليمين. (B) صور تمثيلية للأجنة السليمة في D8 (يسار) و D10 (وسط) و D12 (يمين). خطوط متقطعة في مخطط اللوحة اليسرى يفترض أن سكان CTB التكاثري في حين أن الخط المنقط يحدد STB المسطوطة. الدوائر الوردية في اللوحة اليمنى مخطط MTB التي كانت موجودة عن بعد من الجنين. (C) صور تمثيلية لأجنة غير طبيعية تبدأ في التراجع والتفكك عند D8 (يسار) وD10 (في الوسط) وD12 (يمين). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. وقد تم تكييف بعض الصور من الغرب وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية للتعبير عن علامة الترومبوست وإنتاج HCG أثناء الثقافة الممتدة.
(A) صور المناعة التمثيلية للأجنة التي تظهر تعبيرًا عن علامة CTB GATA3 عند D10 (يسار) وعلامة STB CGB عند D10 (في الوسط) وعلامة MTB HLA-G عند D12 (يمين). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (B) تركيز HCG التمثيلي (mIU/mL) على مدار الثقافة الممتدة من D8 إلى D12 (متوسط ± SEM، n = 3). تم إجراء التحليل الإحصائي مع ANOVA في اتجاه واحد تلاه اختبار توكي (P < 0.05). وقد تم تكييف هذه الصور من الغرب وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: فيديو الفاصل الزمني لجنين بشري في ثقافة ممتدة من D8 إلى D12. يوضح الفيديو انهيار المكورة، وتشكيل STB (المشار إليها من قبل الدوائر الخضراء)، ومن ثم التمايز في نهاية المطاف وهجرة MTB (المشار إليها من قبل الدوائر البرتقالية). وقد تم تكييف هذا من الغرب وآخرون12. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد سمح تطوير بروتوكول لزراعة الأجنة البشرية من خلال زرع العلماء لاستكشاف وقت مجهول سابقا في التنمية8,9. هنا، نستخدم نظام ثقافة ممتد لثقافة الأجنة البشرية وندرس التمايز الأرومية المبكر قبل تشكيل المشيمة الزهية. تسمح لنا الطرق الموصوفة هنا بجمع خطوط فرعية مختلفة من السل لاستخدامها في تحليل الخلايا المفردة في المصب. هذا العمل يتيح للمجتمع العلمي فرصة لفهم هذه الفترة الحرجة والغموض في التنمية البشرية، وقد يفتح فرصا جديدة للعلاجات العلاجية للإجهاض أو أمراض المشيمة الأخرى مثل مقدمات الارتعاج، فضلا عن تقديم رؤى جديدة حول التنمية البشرية في وقت مبكر.

يتطلب هذا البروتوكول مهارات في التلاعب بسرعة بالأجنة أثناء احترار الأجنة ، وإزالة زونا والطلاء لتقليل إجهاد الجنين قبل التمدد في الاستزراع. التقليل من تبخر وسائل الإعلام وبالتالي زيادة في osmolality المتوسطة عن طريق الحد من وقت التعرض أثناء تبادل وسائل الإعلام أمر ضروري. إن الحرص على استخدام تقنية معقمة مناسبة عند تبادل الأطباق المتوسطة والمتحركة سيساعد على تقليل التلوث. استقرار الطبق عند استخدامه لتقليل أي اضطراب ميكانيكي بمجرد تركيب الأجنة أمر مهم أيضًا. الأجنة التي تصبح وشدد ستبدأ في انحسار توقعاتها التزامني وتبدأ في المبرمج. ومن الأهمية بمكان أيضا تجنب السماح للغضروف المفصلي لوسائل الإعلام الثقافة للمس سطح الجنين، وتقليل أي زيت في الآبار. قد يؤدي أي من هذه السيناريوهات إلى تدمير الجنين.

زراعة الأجنة البشرية وراء مرحلة الكيسة الأرمستية هو حقل يتطور بسرعة. أظهرت دراسة حديثة13 أن نظام الثقافة الجديدة الذي يحتوي على 10٪ من خليط بروتين المصفوفة خارج الخلية ووسيط مع مكملات إضافية من بيروفات الصوديوم، اللاكتات، ومثبط البروتين المساعد (روك) مفيد في نمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد في الجسم الحي، وأسفرت عن أجنة أكثر قابلية للحياة بشكل ملحوظ في مرحلة لاحقة من الثقافة الممتدة مقارنة بنظام الثقافة الممتد الموصوف هنا. وسيقتضي الأمر التحقق من صحة هذا النظام الجديد لإثبات إمكانية استنساخه. ونحن نعتقد أن الإجراءات المذكورة هنا يمكن تكييفها مع هذا النظام 3D الجديد مع تغييرات طفيفة، وبالتالي، قد تستفيد من التقدم في المنهجية في هذا المجال.

قد يتم أيضاً تكييف هذا البروتوكول للسماح بالتحقيق في تحسين وسائل الإعلام ثقافة التلقيح الاصطناعي. لقد أظهرنا مؤخرا أن في الماوس، وتطور الجنين خلال فترة طويلة من الثقافة قد التنبؤ بنجاح نمو الجنين بعد نقل الجنين18. يمكن أن تكون مثقفات الزغوت البشرية المخصبة والمتخلصة بشكل غير طبيعي مع 3 pronuclei (PN) إلى البلاستوسيست على D5 في ظروف مختلفة قد تؤثر بعد ذلك على تنميتها أثناء الثقافة الممتدة. قد تكون تبرعت D5 blastocysts الإنسان مثقف لمدة 48 ساعة في ظروف جديدة قبل أن توضع في نظام الثقافة الموسعة لتقييم الأداء. وقد سمحت القياسات الروتينية لعدد الخلايا الظهارية، والعدد الإجمالي للخلية، ومنطقة النمو، وHCG لمختبرنا بفهم أفضل لكيفية أن تدعم ظروف وسائل الإعلام الثقافية المختلفة تطور الأجنة قبل الزرع البشري بشكل أفضل وتؤثر على نجاحها بعد الزرع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نعترف بالعديد من المرضى في مركز كولورادو للطب التناسلي (CCRM) الذين تبرعوا بكرم أجنةهم للأبحاث. نود أيضا أن نشكر كارين Maruniak والمختبر السريري في CCRM لمساعدتهم في معالجة عينات hCG، وكذلك سو ماكورميك وفريقها السريري IVF علم الأجنة في CCRM لمساعدتهم في جمع الأجنة، وتخزين، وتتبع، وتبرع. وقد قدم التمويل داخلياً من جانب اللجنة المعنية باتفاقية مكافحة التصحر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NORM JECT Luer Lock sterile syringe VWR 53548-019 Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 160، الإنسان، الجنين، شبه زرع، الخلايا الأرموستة، الثقافة الممتدة، هضم الخلايا المفردة
مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Logsdon, D. M., Kile, R. A.,… More

Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter