Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.
Abstract
L’implantation humaine, l’apposition et l’adhérence à l’épithélie de surface utérine et l’invasion subséquente du blastocyste dans le decidua maternel, est un événement biologique critique mais énigmatique qui a été historiquement difficile à étudier en raison de limitations techniques et éthiques. L’implantation est initiée par le développement du trophectoderme au trophoblaste précoce et la différenciation ultérieure en sous-lignées trophoblastiques distinctes. La différenciation précoce aberrante de trophoblast peut mener à l’échec d’implantation, aux pathologies placentaires, aux anomalies foetales, et à la fausse couche. Récemment, des méthodes ont été développées pour permettre aux embryons humains de se développer jusqu’au jour 13 après la fécondation in vitro en l’absence de tissus maternels, une période qui englobe la période d’implantation chez l’homme. Cela a donné aux chercheurs l’occasion d’étudier l’implantation humaine et de récapituler la dynamique de la différenciation des trophoblastes au cours de cette période critique sans confondre les influences maternelles et éviter les obstacles inhérents à l’étude des événements précoces de différenciation des embryons in vivo. Pour caractériser différents sous-lignes trophoblastiques lors de l’implantation, nous avons adopté des méthodes de culture étendue bidimensionnelles (2D) existantes et développé une procédure pour digérer et isoler enzymatiquement différents types de cellules trophoblastiques pour les tests en aval. Les embryons cultivés dans des conditions 2D ont une morphologie relativement aplatie et peuvent être sous-optimaux dans la modélisation in vivo en trois dimensions (3D) architectures embryonnaires. Cependant, la différenciation des trophoblastes semble être moins affectée, comme en témoignent les changements prévus de morphologie et d’expression génique au cours de la culture étendue. Différents sous-lignes trophoblastiques, y compris le cytotrophoblaste, le syncytiotrophoblaste et le trophoblaste migrateur, peuvent être séparés par la taille, l’emplacement et l’émergence temporelle, et utilisés pour d’autres caractérisations ou expérimentations. L’étude de ces cellules trophoblastiques tôt peut être instrumentale dans la compréhension de l’implantation humaine, le traitement des pathologies placentaires communes, et l’atténuation de l’incidence de la perte de grossesse.
Introduction
L’implantation humaine et l’émergence du placenta précoce sont historiquement difficiles à étudier et restent largement inconnues parce que les tissus humains sont inaccessibles à ce stade où la grossesse est cliniquement indétectable. Les modèles animaux sont inadéquats, car la placentation humaine a ses propres caractéristiques uniques par rapport à d’autres mammifères euthériens. Par exemple, le placenta humain envahit profondément dans la decidua avec quelques cellules trophoblastiques atteignant au moins le tiers intérieur du myomètre utérin tandis que d’autres cellules remodelent les artères spirales utérines. Même nos ancêtres évolutionnaires les plus proches, les primates non humains, montrent des différences dans la morphologie placentaire et les interactions trophoblastiques avec les tissus décennals maternels1,2,3. L’obtention d’embryons humains préimplantation in vitro n’a été possible que dans les années 1980, lorsque la fécondation in vitro humaine clinique (FIV) a commencé comme une pratique courante pour le traitement de l’infertilité4. Maintenant, les blastocystes humains peuvent être cultivés in vitro pour permettre la sélection d’embryons plus viables pour le transfert, ainsi que permettre des tests génétiques sûrs. L’amélioration des techniques de culture d’embryon, ainsi que l’utilisation croissante de la FIV a donné lieu à de nombreux blastocystes excédentaires qui restent après les cycles de traitement du patient ont été achevés. Avec le consentement du patient, l’approbation de la CISR et certaines restrictions, ces blastocystes peuvent être utilisés pour des études de recherche. Ils sont devenus une ressource inestimable qui ont été utilisés pour la dérivation des cellules souches embryonnaires humaines5, comprendre la transition de la masse cellulaire interne aux cellules souches embryonnaires6,7, et plus récemment, ont été cultivés avec succès jusqu’au jour (D) 13 pour remodeler l’implantation humaine8,9. En utilisant des approches omiques unicellulaires récemment développées, l’accès à ces tissus embryonnaires humains au stade d’implantation a offert des occasions uniques de décrire les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus de différenciation cellulaire très dynamique, qui étaient auparavant impossibles à explorer10,11,12,13.
Ici, nous décrivons les méthodes utilisées dans notre publication récente caractérisant la dynamique de la différenciation trophoblastique lors de l’implantation humaine12. Ce protocole comprend le réchauffement des blastocystes vitrifiés, la culture embryonnaire étendue jusqu’à la D12 après la FIV, la digestion enzymatique de l’embryon en cellules individuelles et la collecte de cellules pour les tests en aval (figure 1). Ce système de culture étendue soutient le développement de l’embryon humain au stade péri-implantation sans apport maternel et récapitule la différenciation des trophoblastes qui semble compatible avec les observations faites à partir de spécimens histologiques il y a de nombreuses années14,15,16,17. Pendant l’implantation, la population de trophoblastes est composée d’au moins deux types de cellules : le cytotrophoblast mononucléé progéniteur(CTB) et le syncytiotrophoblaste multinucléé (STB) différencié en phase terminale. Lors de la digestion de la trypsine, le CTB sont de petites cellules rondes qui sont morphologiquement indiscernables des autres lignées cellulaires (figure 2A, panneau gauche). La séparation de CTB d’autres lignées cellulaires, telles que l’épiblaste et l’endoderme primitif, peut être réalisée par leurs profils transcriptomiques distincts révélés par séquençage de l’ARN unicellulaire. Les cellules syncytiotrophoblastiques peuvent être facilement identifiées comme des structures de forme irrégulière qui sont significativement plus grandes que les autres types de cellules et principalement situées à la périphérie de l’embryon (figure 2A, panneau intermédiaire; Figure 2B, panneau gauche). Les cellules trophoblastiques migratrices (TMB) sont un autre sous-lignée trophoblastique trouvée au cours de la culture élargie de l’embryon et peuvent être reconnues comme s’éloignant apparemment du corps principal de l’embryon (Figure 2A, panneau droit, figure 2B, panneau droit). Le trophoblaste migrateur, bien qu’exprimant beaucoup des mêmes marqueurs que le trophoblaste villous supplémentaire (EVT), ne devrait pas être appelé EVT, puisque les structures de villous dans le placenta n’ont pas émergé à ce stade très tôt de développement.
Expérimentalement, nous avons pu recueillir de petits CTB et de grands STB qui se distinguent facilement après que les embryons sont digérés en cellules simples à D8, D10 et D12 (Figure 2A,B). Les trophoblastes migrateurs apparaissent aux stades ultérieurs de la culture embryonnaire étendue et peuvent être recueillis à D12 avant la digestion enzymatique de l’embryon entier (Figure 2A,B). En séparant phénotypiquement ces trois sous-lignes trophoblastiques avant l’analyse des cellules uniques, nous pouvons identifier des marqueurs transcriptomiques spécifiques et définir le rôle biologique de chaque type de cellule. Cytotrophoblast sont très prolifératifs et agissent comme des cellules progénitrices dans l’approvisionnement des lignées différenciées STB et VTT10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sont impliqués dans la production d’hormones placentaires pour maintenir la grossesse et peuvent également être responsables des embryons enfouis dans l’endomètre10,11,12,13. Le trophoblaste migrateur présente des caractéristiques encore plus fortes d’un phénotype migrateur envahissant et est probablement responsable d’une colonisation plus profonde et plus étendue de l’endomètre utérin10,11,12,13. Après avoir défini la signature transcriptomique de chaque type de cellule, les analyses de regroupement ont également révélé deux sous-ensembles supplémentaires de cellules qui étaient morphologiquement indiscernables de CTB et avaient des transcriptomes avec des caractéristiques de STB et MTB, respectivement12. Ces cellules intermédiaires sont probablement en train de différencier de CTB aux sous-lignes MTB ou STB et auraient été négligées si les embryons avaient été digérés aveuglément et si les cellules avaient été séparées par le transcriptome seulement.
Le protocole décrit ici utilise un système de culture bidimensionnel (2D) et peut ne pas être optimal pour soutenir le développement structurel tridimensionnel (3D), comme suggéré par une publication récente décrivant un système de culture 3D nouvellement développé13. Néanmoins, dans ce système 2D, la différenciation du trophoblaste précoce semble être compatible avec les observations faites à partir de spécimens in vivo14,15,16,17. Ce protocole peut également être facilement adapté pour l’utilisation dans le système de culture 3D récemment décrit13 avec des changements minimes. Toutes les étapes sont effectuées avec une pipette de micromanipulation de poche avec des pointes jetables disponibles dans le commerce ou une pipette buccale d’une pipette en verre finement tirée attachée à des tubes en caoutchouc, un filtre et un embout buccal.
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Protocol
Tous les embryons humains ont été donnés avec le consentement pour une utilisation dans la recherche. Les protocoles relatifs à la culture élargie des embryons humains ont été approuvés par la Commission d’examen institutionnel de l’Ouest (étude no 1179872) et suivent les lignes directrices internationales. Toute utilisation d’embryons humains doit être examinée par les organes d’éthique et de gouvernance appropriés associés à l’établissement de recherche à l’aide de ce protocole.
1. Préparation
- Préparer des plaques de milieux et de récupération un jour avant le réchauffement de l’embryon dans une hotte stérile de flux laminaire.
- Préparer 2 mL de support de culture blastocyste (BM) avec 10% de substitut de protéine sérique v/v (SPS).
REMARQUE : Les milieuux de culture Blastocyst peuvent contenir ou non des protéines ajoutées. Ici, nous avons utilisé un support qui doit être complété par 10% de la protéine d’albumine indiquée. Vérifiez les conseils du fabricant pour la variation dans cette supplémentation. Tous les supports doivent être filtrés à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 μM fixé à une seringue stérile avant l’équilibre. - Remplissez deux plats de lavage de culture d’organe de puits centraux avec 500 μL de BM avec 10% de SPS v/v recouverts de 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire.
- Dans un plat de culture tissulaire de 60 mm, la couche 8 mL d’huile de culture embryonnaire, puis ancrer 20 gouttes de BM avec 10% v/v SPS au fond de la plaque de culture. Faire 1 goutte pour chaque embryon réchauffé.
REMARQUE : Plus de médias, de gouttes et de vaisselle peuvent être faites au besoin. Des gouttes peuvent également être ajoutées au plat avant que l’huile ne soit superposée. L’ancrage des gouttes sous l’huile aidera à réduire l’évaporation et les changements ultérieurs dans l’osmolalité. - Équilibrez BM avec 10% v/v SPS laver la vaisselle et plaque de récupération dans un incubateur à 37 °C, 6% CO2, 5% O2 pour au moins 4 h.
- Décongeler un flacon de la première étape des supports de culture étendu (IVC1) en 4 °C ou sur le dessus du banc.
- Préparer un plat de lavage de 500 μL d’IVC1 sans superposition d’huile. Aliquot environ 4 ml d’IVC1 dans un tube de 5 mL.
- Équilibre IVC1 et petit tube à bouchon d’IVC1 en 37 °C, 6 % de CO2 et O2 atmosphérique pour au moins 4 h.
- Préparer 2 mL de support de culture blastocyste (BM) avec 10% de substitut de protéine sérique v/v (SPS).
- Préparer des plaques de culture étendues un jour avant le réchauffement de l’embryon dans une hotte stérile de flux laminaire.
- Diluer la fibronectine du sérum humain dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à 30 μg/mL. 250 μL de fibronectine de 30 μg/mL par embryon seront nécessaires pour enrober les chambres.
- Ouvrez le paquet coverslip 8 bien chambré sous le capot tout en prenant soin de ne pas toucher les puits. Pipette doucement 250 μL de 30 μg/mL fibronectine dans chaque puits.
- Remettre le couvercle sur le couvercle chambrelé et placer à 4 °C pendant 20-24 h.
- Préparer une plaque de culture étendue le matin du réchauffement de l’embryon.
- Récupérer le couvercle chambrelé avec de la fibronectine et placer dans le capot d’écoulement laminaire. Retirer le mélange de fibronectine à l’aide d’une pipette de 1 mL et jeter dans le contenant de déchets.
- Récupérer les supports IVC1 réchauffés et équilibrés à partir d’un petit tube à bouchons de claquettes de 5 m L.
- Pipette 300 μL d’IVC1 équilibré dans chaque puits. Veillez à ne pas laisser de liquide toucher le couvercle, car cela augmentera le risque de contamination.
- Retournez le couvercle chambrelé avec IVC1 pour incuber à 37 °C, 6% DE CO2 et l’atmosphère O2 jusqu’à ce que l’enlèvement de la zona pellucida à l’étape 4.
2. Réchauffement vitrifié D5 embryons humains
REMARQUE : D’autres fabricants peuvent avoir des protocoles légèrement différents selon leur propre technologie de vitrification. Consultez les instructions d’utilisation du fabricant, le cas échéant.
- Chauffer 3,0 mL de solution de décongeler (TS) dans un plat de 35 mm à 37 °C. Apporter 300 μL de solution de dilution (DS) et deux puits de 300 μL de solution de lavage (WS) dans une plaque de 6 puits à température ambiante.
- À l’aide de forceps, retirez soigneusement le manchon du cryo périphérique tout en veillant à ce que l’embryon vitrifié reste toujours sous azote liquide.
- Déplacez rapidement le cryo périphérique de l’azote liquide et plongez la pointe du cryo périphérique en TS à 37 °C. Réglez une minuterie pendant 1 min et gardez le cryodémoteur submergé jusqu’à ce que l’embryon se détache dans le TS.
REMARQUE : Les embryons chauds un à la fois pour garder une trace de l’identité des embryons, car ils peuvent se rapporter à l’information démographique des patients dans l’analyse en aval. - Pendant l’incubation d’une minute en TS, retirez soigneusement le cryoposit et prenez doucement l’embryon et déplacez-vous du côté opposé du plat TS.
REMARQUE : Si vous cuisinez plusieurs embryons, faites preuve de diligence pour séparer les embryons afin de vous assurer que les identités appropriées sont maintenues. - Après 1 min, ramasser doucement l’embryon avec une petite quantité de TS, environ 2 μL. Déplacez l’embryon vers le fond du puits DS de 300 μL tout en couvrant l’embryon d’une fine couche de TS de la pipette. Réglez une minuterie pendant 3 min et placez la plaque de 6 puits sur le dessus du banc à température ambiante.
- Après 3 min, ramasser l’embryon avec une petite quantité de DS, environ 2 μL, et déplacer l’embryon vers le fond du puits suivant contenant 300 μL de WS. Encore une fois, superposer délicatement une petite quantité de DS de la pipette sur l’embryon. Réglez une minuterie pendant 5 min et retournez au dessus du banc.
- Après 5 min, ramasser l’embryon avec un volume minimal de WS et se déplacer vers le haut du puits final de 300 μL WS. L’embryon tombera lentement et se lavera à travers le WS jusqu’au fond. Expulser tout WS conservé de la pipette dans un puits vide.
- Prenez l’embryon avec un volume minimal et retournez au sommet du même puits de 300 μL de WS. L’embryon tombera une fois de plus au fond du puits. Réglez une minuterie pendant 1 min et retournez la plaque de 6 puits sur le dessus du banc.
3. Récupération d’embryons réchauffés
- Un à la fois, déplacez les embryons réchauffés dans un plat de tissu d’organe de puits central contenant 500 μL de BM équilibré avec 10% v/v SPS sous 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire équilibrée.
- Laver les embryons en ramassant chaque embryon et en les déplaçant vers plusieurs zones du plat tout en soufflant de vieux milieus entre les mouvements. Prenez l’embryon et déplacez-le vers une baisse individuelle de culture de 20 μL de BM équilibrée avec 10% v/v SPS sous l’huile.
- Laissez les embryons réchauffés récupérer pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO2, 5 % O2.
4. Suppression de Zona
- Après une récupération de 2 h, évaluez les embryons pour la ré expansion et prenez des photos de chaque embryon.
- Déplacer les embryons individuellement dans 500 μL d’un milieu de manipulation tamponné d’acide propane (MOPS) à 500 μL avant le traitement avec la solution du Tyrode acide.
- Déplacez rapidement un embryon à travers 300 μL de la solution de Tyrode acide réchauffé tout en regardant activement à travers le microscope. La zona pellucida commencera visuellement à se dissoudre. Cela prendra environ 5 s.
- Déplacez immédiatement l’embryon avec la zona dissolvante dans 300 μL de meps réchauffé tamponné moyen pour éteindre la solution de l’acide Tyrode.
- Déplacez l’embryon avec un volume minimal de MOPS tamponné moyen dans un plat de tissu d’organe de puits central contenant 500 μL de BM équilibré avec 10% v/v SPS sous 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire équilibrée pour laver.
- Renvoyez l’embryon à la baisse de récupération de 20 μL à partir de l’étape 3.2.
REMARQUE : Lors de l’examen visuel suivant l’ablation de la zona, tous les embryons atteints de zona pellucidae retenus peuvent être traités davantage avec la solution acide du Tyrode si nécessaire, en répétant les étapes 4.2-4.6. La réduction de l’exposition à la solution du Tyrode est souhaitée.
5. Blastocyst culture étendue
- Déplacez les embryons individuellement dans le plat de lavage à l’une des supports IVC1 équilibrés de l’étape 1.1.6. Déplacez soigneusement un embryon à un puits du couvercle chambrelé avec IVC1 équilibré et maintenez l’identification d’embryon.
REMARQUE : Cette étape doit être terminée le plus rapidement possible afin de minimiser l’évaporation moyenne. - Retour de couvercles chambre à un incubateur réglé à 37 °C, 6% CO2, atmosphérique O2 pendant 2 jours.
REMARQUE : Assurez-vous de décongeler et d’équilibrer les supports à 37 °C, 6 % de CO2, d’atmosphère O2 pour l’échange de médias 4 h à l’avance. - Lors de la croissance D2 (D7 après la fécondation), examiner attentivement l’attachement des embryons sous le microscope et effectuer l’échange de médias.
- Notez quel embryon est attaché au plat avant d’échanger des supports. Appuyez doucement sur la plaque et examinez si un embryon s’est fixé solidement à la plaque sous le microscope.
- Retirez le couvercle et retirez soigneusement 150 μL d’IVC1 et jetez-les sans déranger l’embryon attaché. Si un embryon n’a pas encore attaché à la plaque, n’échangez pas les supports, car le sérum dans IVC1 aidera à l’attachement à l’embryon.
- Pipette 150 μL de milieux de culture étendus équilibrés, IVC2, lentement dans chaque puits et retourner le couvercle à la couverture chambre.
REMARQUE : Assurez-vous que l’enlèvement du couvercle de la couverture chambrenée est réduit au minimum afin d’éviter l’évaporation moyenne.
- Retournez soigneusement le couvercle chambrelé à l’incubateur sans éclabousser aucun support sur le couvercle. Répétez l’échange de médias et la vérification de l’attachement tous les jours de culture prolongée jusqu’à ce que les embryons soient prêts pour la fixation ou la digestion d’une seule cellule.
6. Collecte facultative des supports dépensés
- En option, recueillir les médias passés lors de l’échange de médias culturels après D7 ou n’importe quel jour par la suite. Au cours de l’étape 5.3.2, plutôt que de jeter le gel de rupture moyen les 150 μL d’IVC1 enlevés dans un tube stérile de 0,5 mL à faible liaison pour analyse future.
7. Fixation facultative pour l’immunofluorescence
- Utilisez une pipette de 200 μL pour laver les embryons avec 1/2 échanges de SUPPORTs pendant 3x avant fixation pour enlever les débris extracellulaires. Le lavage des débris et des protéines excédentaires aidera à optimiser la clarté et à réduire le contexte dans les images obtenues avec l’immunofluorescence.
- Retirez tous les supports et ajoutez lentement 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le puits. L’embryon voudra coller à la surface du liquide. Plusieurs lavages de 150 μL avec 4 % de PFA avant d’enlever tout le liquide aideront à minimiser les dommages causés à l’embryon.
- Incuber les embryons dans 4% PFA pendant 20 min pour la fixation.
- Laver les embryons 3x pendant 10 min par lavage avec 200 μL de 0,1% v/v polysorbate 20 dans pbs frais.
- Stockez les embryons fixes en polysorbate 20 de 0,1 % v/v en PBS à 4 °C avant de passer au protocole d’immunofluorescence.
8. Digestion à cellule unique avec trypsine
REMARQUE : Les embryons frais (non fixes) sont utilisés pour la digestion des cellules uniques.
- Laver l’embryon une fois avec 200 μL de PBS et ajouter 200 μL de solution de trypsin à chaque puits. Remettre le couvercle chambrelé à l’incubateur pendant 5 min.
- Retirez le couvercle chambrelé de l’incubateur et examinez les embryons sous un stéréoscope. Les cellules à la périphérie de l’embryon commenceront à se rétracter et le VTT doit encore être fixé à la plaque où ils sont situés à distance à partir de l’embryon.
- Utilisez une petite pipette ou une pipette buccale finement tirée pour ramasser la VTT individuelle avant de briser l’embryon entier. Passez à l’étape 9.1 pour sauver le VTT et revenez à l’étape 8.4 après l’étape 9.3.
- Utilisez une pipette de micromanipulation de poche ou une pipette buccale pour dissocier doucement l’embryon en aspirant de haut en bas.
- Les cellules commenceront à se dissocier de l’embryon entier. Continuer à aspirate l’embryon doucement et à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit diamètre ou d’une pipette buccale jusqu’à ce que l’embryon ait été incubé pendant un total de 10 min dans la trypsine.
9. Sélection de cellules simples et prélèvement d’échantillons
- Avec la trypsine minimale, déplacez les cellules dissociées à travers trois gouttes de lavage de 20 μL PBS + 0,1% de polyvinylpyrolidone (PVP) sous l’huile de culture embryonnaire avec soin de ne pas perdre de cellules.
- Après avoir lavé les cellules, utilisez une pipette en verre finement tirée pour sélectionner une cellule. Pipette soigneusement la cellule simple dans un tube stérile de 0,2 mL à faible liaison avec un volume minimal de PBS+0,1% PVP.
- Casser congeler les cellules individuelles dans l’azote liquide (LN2)et les stocker à -80 °C pour une utilisation future.
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Representative Results
Les embryons sains ont fait l’présentant une prolifération continue au cours de la culture étendue (Figure 2B). Les embryons anormaux ont commencé à se rétracter de leurs bords extérieurs et à se désintégrer (figure 2C). D’après notre expérience, environ 75% des embryons ont été attachés au fond du plat enduit de fibronectine à 48 h et l’attachement a augmenté à environ 90% par 72 h en culture. Le succès de l’attachement à l’embryon peut être largement affecté par la qualité initiale des blastocystes. Les embryons non attachés par 72 h ne survivront probablement pas.
À D8 après la fécondation (D3 de culture étendue), la plupart des cellules des embryons étaient CTB qui étaient positives pour le marqueur trophoblastique GATA3 (Figure 3A). Les cytotrophoblastes avaient déjà commencé à se différencier en STB multinucléé à la périphérie de l’embryon(figure 2B, panneau gauche, ligne pointillée). Ces STB ont eu une apparence de feuille-comme et ont été tachés positifs pour la bêta de subunite de gonadotropine chorionique humaine (hCGB ; Figure 3A, panneau central). Les embryons se sont rapidement développés, entre D8 et D10, suggérant une prolifération cellulaire rapide de CTB pendant cette période. À D10, la formation de VTT positif CGB était à un maximum, ce qui pourrait être confirmé par la montée en puissance de la production de HCG à ce moment-- figure 3B). Les trophoblastes migrateurs ont également commencé à émerger et ont migré loin du corps de l’embryon et ont été tachés positifs pour le marqueur EVT, HLA-G (Figure 3A, panneau droit). En D12, la différenciation des STB était en déclin et la production de VTT est devenue plus importante, suggérant un changement d’accent de la production d’hormones sur le D10 à la migration cellulaire sur D12. Ces changements ont été observés par vidéo time-lapse obtenue au cours de cette période de péri-implantation (Movie 1). Nos données de séquençage de l’ARN à cellule unique reflétaient également de tels changements dynamiques dans la fonction cellulaire. Ensemble, ces données suggèrent la différenciation précoce de trophoblaste et l’émergence du placenta tôt est un processus dynamique, pendant lequel l’embryon peut prioriser des fonctions cellulaires hautement spécialisées à des points de temps très spécifiques pour réaliser l’implantation réussie.
Figure 1 : Schéma procédural de la culture étendue et de la collecte d’échantillons de cellules uniques.
Flux de travail du réchauffement des embryons vitrifiés, de l’ablation de la zona pellucida, de la culture embryonnaire étendue, de la digestion enzymatique et de l’isolement du cytotrophoblaste (CTB), du syncytiotrophoblaste (STB) et du trophoblaste migrateur (TBM). Ce chiffre a été modifié par West et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Morphologies des cellules trophoblastiques et des embryons au cours d’une culture étendue.
(A) Images représentatives de différents types de cellules trophoblastiques après digestion enzymatique avec trypsine. Petit CTB à gauche, grand STB au milieu et VTT à droite. (B) Images représentatives d’embryons sains à D8 (à gauche), D10 (milieu) et D12 (à droite). Les lignes pointillées dans le panneau gauche décrivent probablement la population proliférative de CTB tandis que la ligne pointillée décrit le STB aplati. Les cercles roses du panneau droit décrivent le VTT qui a été localisé à distance à partir de l’embryon. (C) Images représentatives d’embryons anormaux qui commencent à se rétracter et à se désintégrer à D8 (à gauche), D10 (au milieu) et D12 (à droite). Barres d’échelle = 200 μm. Certaines images ont été adaptées de West et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images représentatives de l’expression des marqueurs trophoblastiques et de la production de hCG pendant la culture étendue.
(A) Images représentatives de l’immunofluorescence des embryons montrant l’expression d’un marqueur CTB GATA3 à D10 (à gauche), du marqueur STB CGB à D10 (milieu) et du marqueur de VTT HLA-G à D12 (à droite). Barres d’échelle = 200 μm. (B) Concentration représentative de hCG (miU/mL) au cours de la culture étendue de D8 à D12 (moyenne± SEM, n = 3). L’analyse statistique a été réalisée avec One-Way ANOVA, suivie du test de Tukey (P < 0,05). Ces images ont été adaptées de West et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1: Time-lapse vidéo d’un embryon humain dans la culture étendue de D8 à D12. La vidéo montre l’effondrement du blastocoel, la formation du STB (indiqué par les cercles verts), puis la différenciation et la migration éventuelles de vtt (indiqué par les cercles oranges). Ceci a été adapté de West et coll.12. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le développement du protocole de culture des embryons humains par l’implantation a permis aux scientifiques d’explorer une période inédite dans le développement8,9. Ici, nous utilisons un système de culture étendu pour la culture des embryons humains et étudier la différenciation des trophoblastes précoces avant la formation du placenta villous. Les méthodes décrites ici nous permettent de collecter différents sous-lignes de tuberculose pour une utilisation dans l’analyse unicellulaire en aval. Ce travail permet à la communauté scientifique de comprendre cette période critique et énigmatique dans le développement humain, et peut ouvrir de nouvelles possibilités de traitements thérapeutiques pour les fausses couches ou d’autres pathologies placentaires telles que la pré-éclampsie, ainsi que de fournir de nouvelles perspectives sur le développement humain précoce.
Ce protocole exige des compétences dans la manipulation rapide des embryons pendant le réchauffement de l’embryon, l’enlèvement de la zona et le placage pour minimiser le stress des embryons avant la culture étendue. Il est essentiel de minimiser l’évaporation des médias et donc d’augmenter l’osmolalité moyenne en limitant le temps d’exposition lors de l’échange de médias. Prendre soin d’utiliser la bonne technique aseptique lors de l’échange de plats moyens et en mouvement aidera à minimiser la contamination. Il est également important de stabiliser le plat lorsqu’il est utilisé pour minimiser toute perturbation mécanique une fois que les embryons se sont attachés. Les embryons qui deviennent stressés commenceront à reculer leurs projections syncytiales et commenceront à devenir apoptose. Il est également essentiel d’éviter de permettre au ménisque des milieux de culture de toucher la surface de l’embryon et de minimiser toute huile dans les puits. L’un ou l’autre de ces scénarios peut détruire l’embryon.
La culture d’embryons humains au-delà du stade blastocyste est un domaine en évolution rapide. Une étude récente13 a démontré qu’un nouveau système de culture qui contient 10% d’un mélange de protéines extracellulaires et un milieu avec une supplémentation supplémentaire de pyruvate de sodium, de lactate, et rho-associé protéine kinase (ROCK) inhibiteur est avantageux dans la modélisation in vivo 3D architectures embryonnaires et a donné des embryons significativement plus viables à un stade ultérieur de la culture étendue par rapport au système de culture étendue décrit ici. La validation de ce nouveau système pour démontrer sa reproductibilité sera nécessaire. Nous croyons que les procédures décrites ici peuvent être adaptées à ce nouveau système 3D avec des changements mineurs et peuvent, par conséquent, bénéficier de l’avancement de la méthodologie dans ce domaine.
Ce protocole peut également être adapté pour permettre l’investigation sur l’optimisation des médias de culture de FIV. Nous avons récemment montré que chez la souris, le développement de l’embryon au cours de la culture étendue peut prédire le succès du développement fœtal après le transfert d’embryons18. Les zygotes humains anormalement fécondés et jetés avec 3 pronucles (PN) peuvent être cultivés en blastocystes sur D5 dans différentes conditions qui peuvent alors influencer leur développement au cours de la culture étendue. Les blastocystes humains D5 donnés peuvent être cultivés pendant 48 h dans de nouvelles conditions avant d’être placés dans le système de culture étendu pour l’évaluation des performances. Les mesures de routine du nombre de cellules épiblastiques, du nombre total de cellules, de la zone d’excroissance et du hCG ont permis à notre laboratoire de mieux comprendre comment différentes conditions de culture peuvent mieux soutenir le développement humain de l’embryon préimplantation et influencer leur succès post-implantation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les nombreux patients du Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) qui ont gracieusement fait don de leurs embryons pour la recherche. Nous tenons également à remercier Karen Maruniak et le laboratoire clinique du CCRM pour leur aide dans le traitement des échantillons de hCG, ainsi que Sue McCormick et son équipe d’embryologie clinique de FIV au CCRM pour leur aide à la collecte, au stockage, au suivi et au don d’embryons. Le financement a été fourni à l’interne par le CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
