Summary
Här beskriver vi en metod för uppvärmning förglasade mänskliga blastocyster, culturing dem genom implantationsperioden in vitro, smälta dem i enstaka celler och samla tidiga trophoblast celler för vidare utredning.
Abstract
Mänskliga implantation, apposition och vidhäftning till livmoderns yta epithelia och efterföljande invasionen av blastocyst i moderns decidua, är en kritisk men gåtfulla biologiska händelse som har historiskt svårt att studera på grund av tekniska och etiska begränsningar. Implantation initieras av utvecklingen av trophectoderm till tidig trophoblast och efterföljande differentiering till distinkta trofoblast dellineages. Aberrant tidiga trophoblast differentiering kan leda till implantation misslyckande, placenta patologier, fetala avvikelser och missfall. Nyligen har metoder utvecklats för att tillåta mänskliga embryon att växa fram till dag 13 efter befruktning in vitro i avsaknad av moderns vävnader, en tidsperiod som omfattar implantation perioden hos människor. Detta har gett forskare möjlighet att undersöka människans implantation och rekapitulera dynamiken i trophoblast differentiering under denna kritiska period utan att blanda ihop moderns influenser och undvika inneboende hinder för att studera tidiga embryodifferentiering händelser in vivo. För att karakterisera olika trophoblast sublineages under implantation, har vi antagit befintliga tvådimensionella (2D) utökade odlingsmetoder och utvecklat ett förfarande för att enzymatiskt smälta och isolera olika typer av trofoblast celler för nedströms analyser. Embryon odlade i 2D-villkor har en relativt tillplattad morfologi och kan vara suboptimala i modellering in vivo tredimensionella (3D) embryonala arkitekturer. Trophoblast differentiering verkar dock vara mindre påverkas som framgår av förväntade morfologi och genen förändringar uttryck under loppet av utökade kultur. Olika trofoblast dellinjer, inklusive cytotrophoblast, syncytiotrophoblast och flyttande trofoblast kan separeras med storlek, plats och tidsmässiga uppkomst, och används för ytterligare karakterisering eller experiment. Utredning av dessa tidiga trophoblast celler kan vara avgörande för att förstå mänskliga implantation, behandla vanliga placenta patologier och mildra förekomsten av graviditet förlust.
Introduction
Human implantation och uppkomsten av den tidiga moderkakan är historiskt svårt att undersöka och förblir till stor del okända eftersom mänskliga vävnader är otillgängliga i detta skede när graviditeten är kliniskt omöjlig att upptäcka. Djurmodeller är otillräckliga, eftersom människans placentation har sina egna unika egenskaper jämfört med andra eutherian däggdjur. Till exempel, mänskliga moderkakan invaderar djupt in i decidua med några trophoblast celler når åtminstone den inre tredjedelen av livmoderns myometrium medan andra celler remodel livmodern spiral artärer. Även våra närmaste evolutionära förfäder, de icke-mänskliga primater, visar skillnader i placenta morfologi och trofoblast interaktioner med moderns decidual vävnader1,2,3. Att få fram förimplantationen mänskliga embryon in vitro var inte möjligt förrän på 1980-talet då klinisk human in vitro-fertilisering (IVF) började som en rutinpraxis för behandling av infertilitet4. Nu kan mänskliga blastocysts odlas in vitro för att möjliggöra val av mer livskraftiga embryon för överföring, samt möjliggöra säker genetisk testning. Förbättring av embryokultur tekniker, liksom den ökande användningen av IVF har gett många överskott blastocysts som kvarstår efter patientens behandling cykler har slutförts. Med patientens samtycke, IRB-godkännande, och med vissa begränsningar, dessa blastocysts kan utnyttjas för forskningsstudier. De har blivit en ovärderlig resurs som användes för härledning av mänskliga embryonala stamceller5, förstå övergången av inre cellmassa till embryonala stamceller6,7, och på senare tid, har framgångsrikt odlade fram till dag (D) 13 till remodel mänsklig implantation8,9. Genom att utnyttja nyligen utvecklade single cell omics metoder, tillgång till dessa implantation skede mänskliga embryo vävnader har erbjudit unika möjligheter att beskriva de molekylära mekanismer som reglerar denna mycket dynamisk cell differentiering process, som tidigare var omöjligt attutforska 10,11,12,13.
Här beskriver vi de metoder som används i vår senaste publikation som kännetecknar dynamiken i trophoblast differentiering under människans implantation12. Detta protokoll omfattar uppvärmningen av förglasade blastocysts, utökad embryo kultur upp till D12 post IVF, enzymatisk matsmältning av embryot i enstaka celler, och cellsamling för nedströms analyser (Figur 1). Detta utökade kultur system stöder peri-implantation skede mänskliga embryot utveckling utan moderns input och rekapituler trophoblast differentiering som verkar överensstämma med de observationer som gjorts från histologiska exemplar många år sedan14,15,16,17. Under implantationen består trofoblastpopulationen av minst två celltyper: den mononuklerade progenitorliknande cytotrofoblast (CTB) och den terminalt differentierade, flerkärniga synkietiotrofoblast (STB). Vid trypsin matsmältningen, CTB är små, runda celler som är morfologiskt omöjlig att skilja från andra cell härstamningar (Figur 2A, vänster panel). Separation av CTB från andra cellinje, såsom epiblast och primitiva endoderm, kan uppnås genom deras distinkta transkriptomiska profiler avslöjas av enda cell RNA sekvensering. Syncytiotrophoblast celler kan lätt identifieras som oregelbundna formade strukturer som är betydligt större än de andra celltyperna och huvudsakligen ligger i periferin av embryot (Figur 2A, mellanpanelen; Bild 2B, vänster panel). Flyttande trofoblastceller (MTB) är en annan trophoblast sublineage som finns under embryo utökade kultur och kan erkännas som till synes flytta bort från huvuddelen av embryot (Figur 2A, höger panel, Figur 2B, höger panel). Flyttande trofoblast, även om de uttrycker många av samma markörer som extra villous trophoblast (EVT), bör inte kallas EVT, eftersom villous strukturerna i moderkakan inte har uppstått i detta mycket tidiga utvecklingsstadium.
Experimentellt kunde vi samla små CTB och stora STB som är lätt att skilja efter embryon rötas i enstaka celler på D8, D10, och D12 (Figur 2A,B). Flyttande trofoblaster uppstår i de senare stadierna av utökad embryokultur och kan samlas in vid D12 före enzymatisk rötning av hela embryot (Figur 2A,B). Genom att fenotypiskt separera dessa tre trofoblast dellinjer innan encellsanalys, kan vi identifiera specifika transkriptomic markörer och definiera den biologiska roll varje celltyp. Cytotrofoblast är mycket proliferativ och fungerar som stamceller i att leverera STB och MTB differentierade härstamningar10,11,12,13. Syncytiotrophoblast är involverade i att producera placentahormoner för att upprätthålla graviditet och kan också vara ansvarig för embryon som gräver i livmoderslemhinnan10,11,12,13. Flyttande trofoblast har ännu starkare drag av en invasiv, flyttande fenotyp och är sannolikt ansvarig för djupare och mer omfattande kolonisering av livmoderns livmoderenstrium10,11,12,13. Efter att ha definierat transkriptomiska signaturen för varje celltyp har klustringsanalyser också avslöjat två ytterligare undergrupper av celler som var morfologiskt omöjliga att skilja från CTB och hade transkriptomer med funktioner i STB och MTB, respektive12. Dessa mellanliggande steg celler är sannolikt i färd med att skilja från CTB till antingen MTB eller STB dellinjer och skulle ha förbisetts om embryon var blint smält och celler separerades av transkriptom ensam.
Protokollet som beskrivs här utnyttjar ett tvådimensionellt (2D) kultursystem och kanske inte är optimalt för att stödja tredimensionell (3D) strukturell utveckling, som föreslagits av en nyligen publicerad som beskriver en nyutvecklad 3D-kultur system13. Ändå, i detta 2D-system differentiering av tidig trophoblast verkar vara förenligt med observationer gjorda av in vivo exemplar14,15,16,17. Detta protokoll kan också lätt anpassas för användning i den nyligen beskrivna 3D-kultur system13 med minimala förändringar. Alla steg utförs med en handhållen mikromanipulationspipett med kommersiellt tillgängliga engångsspetsar eller en munpipett från en findragen glaspipett fäst vid gummislangar, ett filter, och ett munstycke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga embryon har donerats med samtycke för användning i forskning. Protokoll för utökad mänsklig embryokultur har godkänts av Western Institutional Review Board (studie nr 1179872) och följer internationella riktlinjer. All användning av mänskliga embryon måste granskas av de lämpliga etiska och styrande organ som är knutna till forskningsinstitutionen med hjälp av detta protokoll.
1. Förberedelse
- Förbered media och återhämtning plattor en dag före embryot uppvärmningen i en steril laminär flöde huva.
- Förbered 2 mL av blastocyst odlingsmedia (BM) med 10% v/v serumproteinersättning (SPS).
OBS: Blastocyst kultur media kan eller inte kan innehålla tillsatt protein. Här använde vi ett medium som måste kompletteras med 10% av det angivna albuminproteinet. Kontrollera tillverkaren vägledning för variation i detta tillskott. Alla medier ska filtreras med hjälp av ett sterilt 0,22 μM-filter som är fäst vid en steril spruta före jämvikt. - Fyll två center-brunn orgel kultur diska med 500 μL bm med 10% v / v SPS täckt med 500 μL av embryokultur grade olja.
- I en 60 mm vävnadsodlingsfat förankrar skikt 8 mL embryokulturolja och förankrar sedan 20 μL-droppar BM med 10% v/v SPS till botten av odlingsplattan. Gör 1 droppe för varje embryo värms.
OBS: Mer media, droppar och diskdiskar kan göras vid behov. Droppar kan också läggas till skålen innan oljan är skiktad. Förankring droppar under oljan kommer att bidra till att minska avdunstning och eventuella efterföljande förändringar i osmolalitet. - Jämvikt BM med 10% v/v SPS diska och återhämtning tallrik i en inkubator vid 37 °C, 6% CO2, 5% O2 i minst 4 h.
- Tina en injektionsflaska av det första steget i utökade odlingsmedier (IVC1) i 4 °C eller på bänkskivan.
- Förbered en tvätt maträtt på 500 μL av IVC1 utan olja overlay. Aliquot cirka 4 mL av IVC1 i en 5 mL snap cap röret.
- Jämvikt IVC1 tvättfat och små snap cap röret av IVC1 i 37 °C, 6% CO2, och atmosfäriska O2 i minst 4 h.
- Förbered 2 mL av blastocyst odlingsmedia (BM) med 10% v/v serumproteinersättning (SPS).
- Förbered förlängda odlingsplattor en dag före embryots uppvärmning i en steril laminär flödeshuva.
- Späd fibronectin från humant serum i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 30 μg/mL. 250 μL av 30 μg/mL fibronectin per embryo kommer att behövas för att belägga kamrarna.
- Öppna 8 väl kammade coverslip paketet under huven samtidigt noga med att inte röra vid brunnarna. Försiktigt pipettera 250 μL av 30 μg/mL fibronectin i varje brunn.
- Sätt tillbaka locket till den kammade täckplattan och lägg i 4 °C i 20-24 h.
- Förbered utökad odlingsplatta på morgonen av embryots uppvärmning.
- Hämta den kammade täckslip med fibronectin och placera i laminär flödeshuva. Ta bort fibronectinblandningen med en 1 mL-pipett och kasta i avfallsbehållaren.
- Hämta värmt, ekvilovilligt IVC1-media från små 5 mL snäpplocksrör.
- Pipett 300 μL av ekvilovilraterad IVC1 i varje brunn. Var försiktig så att du inte låter någon vätska vidröra locket eftersom detta ökar risken för kontaminering.
- Returnera den kamra täckplattan med IVC1 för att inkubera i 37 °C, 6% CO2, och atmosfäriska O2 tills avlägsnandet av zona pellucida i steg 4.
2. Värmande förglasade D5 mänskliga embryon
OBS: Andra tillverkare kan ha lite olika protokoll enligt sin egen förglasningsteknik. Se tillverkarens bruksanvisning när det är tillämpligt.
- Värm 3,0 mL upptiningslösning (TS) i 35 mm skål till 37 °C. Ta med 300 μL utspädningslösning (DS) och två brunnar på 300 μL tvättlösning (WS) i en 6 brunnsplatta till rumstemperatur.
- Med hjälp av tångar, försiktigt bort cryo enheten hylsan samtidigt som man ser till att det förglasade embryot alltid förblir under flytande kväve.
- Flytta snabbt cryo-enheten från flytande kväve och kasta spetsen på kryoapparaten i TS i 37 °C. Ställ in en timer i 1 min och håll cryo-enheten nedsänkt tills embryot lossnar i TS.
OBS: Varma embryon en i taget för att hålla reda på embryoidentiteter eftersom de kan relatera till patientdemografisk information i nedströmsanalys. - Under 1 min inkubation i TS, försiktigt ta bort cryo enheten och försiktigt plocka upp embryot och flytta till motsatt sida av TS skålen.
OBS: Om culturing flera embryon, vara flitig för att hålla embryon separata för att säkerställa korrekt identiteter upprätthålls. - Efter 1 min, plocka försiktigt upp embryot med en liten mängd TS, cirka 2 μL. Flytta embryot till botten av 300 μL DS väl samtidigt som du täcker embryot i ett tunt lager av TS från pipetten. Ställ in en timer i 3 min och placera 6-brunnsplattan på bänkskivan vid rumstemperatur.
- Efter 3 min, plocka upp embryot med en liten mängd DS, cirka 2 μL, och flytta embryot till botten av nästa brunn som innehåller 300 μL WS. Återigen, försiktigt lager en liten mängd DS från pipetten över embryot. Ställ in en timer för 5 min och återgå till bänkskivan.
- Efter 5 min, plocka upp embryot med minimal volym WS och flytta till toppen av den slutliga brunnen av 300 μL WS. Embryot kommer långsamt att falla och tvätta genom WS till botten. Utvisa eventuellt kvarhållet WS från pipetten till en tom brunn.
- Plocka upp embryot med minimal volym och återgå till toppen av samma 300 μL-brunn av WS. Embryot kommer återigen att falla till botten av brunnen. Ställ in en timer i 1 min och återför 6-brunnsplattan till bänkskivan.
3. Återvinning av uppvärmda embryon
- En i taget, flytta uppvärmda embryon i en center-well organ vävnadsskål som innehåller 500 μL av ekvilolös BM med 10% v / v SPS under 500 μL av ekvilomat embryo kultur grade olja.
- Tvätta embryon genom att plocka upp varje embryo och flytta dem runt till flera områden i skålen samtidigt blåser ut gamla medier mellan flyttar. Plocka upp embryot och flytta det till en enskild 20 μL kultur droppe ekvilovilraterad BM med 10% v / v SPS under olja.
- Låt de värmda embryona återhämta sig i 2 h i en inkubator vid 37 °C, 6 % CO2, 5 % O2.
4. Borttagning av Zona
- Efter en 2 h återhämtning, bedöma embryon för åter expansion och ta bilder av varje embryo.
- Flytta embryon individuellt i 500 μL av en 3-(N-morpholino)-propanesulfonic syra (MOPS)-buffrat hanteringsmedium med 5% (v/v) fetalt kalvserum (FCS) före behandlingen med sura Tyrodes lösning.
- Flytta ett embryo snabbt genom 300 μL värmd surt Tyrode lösning medan aktivt titta genom mikroskopet. Zona pellucida kommer visuellt att börja lösas upp. Detta kommer att ta cirka 5 s.
- Flytta omedelbart embryot med upplösning av zona i 300 μL värmt MOPS buffrat medium för att släcka syrans Tyrodes lösning.
- Flytta embryot med minimal volym av MOPS buffrat medium i en center-well organ vävnad skålen som innehåller 500 μL av ekvilomedelad BM med 10% v / v SPS under 500 μL av ekvilomedelad embryo kultur grade olja att tvätta.
- Återför embryot till 20 μL-återvinningsfallet från steg 3.2.
OBS: Vid visuell undersökning efter avlägsnande av zona får eventuella embryon med kvarhållen zona pellucidae behandlas ytterligare med sura Tyrodes lösning om så behövs, genom att upprepa steg 4.2-4.6. Att minimera exponeringen för Tyrodelösningen önskas.
5. Blastocyst utökad kultur
- Flytta embryona individuellt till tvättskålen med ekvilomat ivc1-media från steg 1.1.6. Flytta försiktigt ett embryo till en brunn av den kamrade täcken med ekvilovillig IVC1 och underhåll embryoidentifiering.
OBS: Detta steg måste vara färdigt så snabbt som möjligt för att minimera medelhög avdunstning. - Returkammaren coverslip till en inkubator inställd på 37 °C, 6% CO2, atmosfäriska O2 för 2 dagar.
OBS: Var noga med att tina och jämviktsmedier i 37 °C, 6% CO2, atmosfäriskA O2 för medieutbytet 4 h i förväg. - Vid utväxt D2 (D7 post befruktning), noggrant undersöka kvarstad på embryon under mikroskopet och utföra mediautbyte.
- Notera vilket embryo som är fäst vid skålen innan du utbyter media. Knacka försiktigt på plattan och undersöka om ett embryo har fästs ordentligt på plattan under mikroskopet.
- Ta bort locket och ta försiktigt bort 150 μL IVC1 och kassera medan du inte stör det bifogade embryot. Om ett embryo ännu inte har fästs på plattan, inte byta media, som serumet i IVC1 kommer att stöd i embryo attachment.
- Pipett 150 μL av ekviloförlängda odlingsmedier, IVC2, långsamt in i varje brunn och återför locket till det kammade täcket.
OBS: Se till att ta bort locket från den kammade täckslip minimeras för att undvika medelhög avdunstning.
- Återsända försiktigt den kammade täckplattan till inkubatorn utan att stänka några media på locket. Upprepa media utbyte och bifogad fil kontrollera varje dag av utökad kultur tills embryon är redo för fixering eller encellig matsmältning.
6. Valfri samling av förbrukade medier
- Eventuellt samla in förbrukade medier under utbyte av kultur media efter D7 eller någon dag därefter. Under steg 5.3.2, i stället för att kassera medelsnafset snap-frysa 150 μL av borttaget IVC1 in i ett sterilt, low-bind 0.5 mL rör för framtida analys.
7. Valfri fixering för immunofluorescens
- Använd en 200 μL-pipett för att tvätta embryon med 1/2 mediautbyten pbs för 3x före fixering för att avlägsna eventuellt extracellulärt skräp. Tvättning bort överflödigt skräp och protein kommer att bidra till att optimera klarheten och minska bakgrunden i bilder som erhållits med immunofluorescens.
- Ta bort alla medier och tillsätt långsamt 200 μL av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS till brunnen. Embryot kommer att vilja hålla sig till ytan av vätskan. Flera 150 μL tvättar med 4% PFA innan du tar bort all vätska kommer att bidra till att minimera eventuella skador på embryot.
- Inkubera embryona i 4% PFA i 20 min för fixering.
- Tvätta embryon 3x i 10 min per tvätt med 200 μL på 0,1% v/v polysorbat 20 i färsk PBS.
- Förvara fasta embryon i 0,1 % v/v polysorbat 20 i PBS vid 4 °C innan du fortsätter med immunofluorescensprotokollet.
8. Encellsspjältring med Trypsin
OBS: Färska (ej fasta) embryon används för encellig matsmältning.
- Tvätta embryot en gång med 200 μL PBS och tillsätt 200 μL trypsinlösning till varje brunn. Returnera den kammade täckmarken till inkubatorn i 5 min.
- Ta bort det kammade täcket från inkubatorn och undersök embryona under ett stereoskop. Celler i embryots periferi kommer att börja dra tillbaka och MTB bör fortfarande fästas på den platta där de är avlägset placerade från embryot.
- Använd en liten pipett eller fint dras mun pipetten att plocka upp enskilda MTB innan bryta isär hela embryot. Hoppa framåt till steg 9.1 för att spara MTB och återgå till steg 8.4 efter steg 9.3.
- Använd en handhållen mikromanipulationspipett eller munpipett för att försiktigt dissociera embryot genom att aspirera upp och ner.
- Celler kommer att börja separera från hela embryot. Fortsätt att aspirera embryot försiktigt och upprepade gånger med hjälp av en pipettspets eller munpipett med mindre diameter tills embryot har inkuberas i totalt 10 min i trypsin.
9. Enkelcellsurval och provsamling
- Med minimal trypsin, flytta de dissocierade cellerna genom tre tvättdroppar på 20 μL PBS + 0,1% polyvinylpyrrolidon (PVP) under embryokulturolja med försiktighet att inte förlora några celler.
- Efter tvätt av cellerna, använd en fint dragna glaspipett för att välja en cell. Försiktigt pipettera den enda cellen till ett sterilt 0,2 mL lågrör med minimal volym PBS+0,1% PVP.
- Snap frysa enstaka celler i flytande kväve (LN2), och förvara i -80 °C för framtida bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friska embryon uppvisade fortsatt spridning under loppet av utvidgad kultur (Figur 2B). Onormala embryon började dra sig tillbaka från sina ytterkanter och upplösas (Figur 2C). Från vår erfarenhet var ungefär 75% av embryon knutna till botten av fibronectin belagda skålen vid 48 h och fastsättning ökade till cirka 90% med 72 h i kultur. Framgången för embryotillbehör kan till stor del påverkas av den ursprungliga kvaliteten på blastocysts. Embryon som inte är fästa med 72 h sannolikt inte kommer att överleva.
Vid D8 post befruktning (D3 av utökad kultur), de flesta celler i embryon var CTB som var positiva för trophoblast markör GATA3 (Figur 3A). Cytotrophoblasts hade redan börjat differentiera till flerkärniga STB på periferin av embryot (Figur 2B, vänster panel, prickade linjen). Dessa STB hade ett arkliknande utseende och var färgas positivt för den mänskliga korionen gonadotropin subunit beta (hCGB; Bild 3A, mittpanelen). Embryona växte snabbt, mellan D8 och D10, vilket tyder på en snabb cellproliferation av CTB under denna period. Vid D10 var bildandet av CGB positiv MTB på en maximal, vilket kunde bekräftas av uppgången av hCG produktion vid denna tid (Figur 3B). Flyttande trofoblaster började också dyka upp och migreras bort från embryot kroppen och var färgas positivt för EVT markör, HLA-G (Figur 3A, höger panel). Genom D12 var STB differentiering på tillbakagång och MTB produktionen blev mer framträdande, vilket tyder på en förskjutning av betoning från hormonproduktion på D10 till cell migration på D12. Dessa förändringar observerades av time-lapse video som erhållits under denna peri-implantation period (Film 1). Våra single cell RNA sekvensering data återspeglade också sådana dynamiska förändringar i cellens funktion. Tillsammans tyder dessa data på tidig trophoblast differentiering och framväxten av den tidiga moderkakan är en dynamisk process, under vilken embryot kan prioritera högspecialiserade cellfunktioner vid mycket specifika tidpunkter för att uppnå framgångsrik implantation.
Bild 1: Förfarandeschema av utökad kultur och enkelcellsprovsamling.
Arbetsflöde av uppvärmningen förglasade embryon, zona pellucida avlägsnande, utökade embryo kultur, enzymatisk matsmältning, och isolering av cytotrophoblast (CTB), syncytiotrophoblast (STB), och flyttande trophoblast (MTB). Denna siffra har modifierats från West et al.12. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologier av trofoblastceller och embryon under utökad kultur.
(A) Representativa bilder av olika trofoblast celltyper efter enzymatisk matsmältning med trypsin. Liten CTB till vänster, stora STB i mitten, och MTB till höger. (B) Representativa bilder av friska embryon vid D8 (vänster), D10 (mitten) och D12 (höger). Streckade linjer i vänster panel kontur förmodligen proliferative CTB befolkningen medan prickade linjen konturer tillplattad STB. Rosa cirklar i den högra panelen kontur MTB som var avlägset belägna från embryot. (C) Representativa bilder av onormala embryon som börjar dra tillbaka och upplösas vid D8 (vänster), D10 (mitten), och D12 (höger). Skalstång = 200 μm. Vissa bilder har anpassats från West et al.12. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av trofoblastmarkörsuttryck och hCG-produktion under utökad kultur.
(A) Representativa immunofluorescensbilder av embryon som visar uttryck för en CTB-markör GATA3 vid D10 (vänster), STB-markör CGB vid D10 (mitten), och MTB-markör HLA-G vid D12 (höger). Skala barer= 200 μm. (B) Representativ hCG koncentration (mIU/mL) under loppet av utökade kultur från D8 till D12 (medelvärde± SEM, n = 3). Statistisk analys utfördes med One-Way ANOVA följt av Tukeys test (P < 0,05). Dessa bilder har anpassats från West et al.12. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Film 1: Time-lapse video av ett mänskligt embryo i utökad kultur från D8 till D12. Videon visar kollapsen av blastocoel, bildandet av STB (anges av de gröna cirklarna), och sedan eventuell differentiering och migration av MTB (anges av de orange cirklarna). Denna har anpassats från West et al.12. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av protokollet till kultur mänskliga embryon genom implantation har gjort det möjligt för forskare att utforska en tidigare outforskad tid i utveckling8,9. Här använder vi ett utökat odlingssystem för att odla mänskliga embryon och studera tidig trophoblast-differentiering före bildandet av villös moderkakan. De metoder som beskrivs här tillåter oss att samla in olika TB sublineages för användning i nedströms single-cell analys. Detta arbete ger det vetenskapliga samfundet en chans att förstå denna kritiska och gåtfulla period i mänsklig utveckling, och kan öppna nya möjligheter för terapeutiska behandlingar för missfall eller andra placenta patologier såsom pre-eclampsia, samt ge nya insikter om tidig mänsklig utveckling.
Detta protokoll kräver färdigheter i snabbt manipulera embryon under embryot uppvärmningen, zona avlägsnande och plätering för att minimera embryo stress före utökad kultur. Att minimera mediaavdunstning och därmed en ökning av medelsosmolaliteten genom att begränsa exponeringstiden vid medieutbyte är väsentligt. Att ta hand om att använda korrekt aseptisk teknik vid utbyte av medium och rörliga rätter kommer att bidra till att minimera kontaminering. Stabilisera skålen när den används för att minimera eventuella mekaniska störningar när embryon har fäst är också viktigt. Embryon som blir stressade kommer att börja dra sig tillbaka sina synkytialprojektioner och börja apoptose. Det är också viktigt att undvika att låta menisken av kulturmedia att röra embryots yta, och att minimera eventuell olja i brunnarna. Endera av dessa scenarier kan förstöra embryot.
Culturing mänskliga embryon bortom blastocyst scenen är ett snabbt föränderligt område. En nyligen genomfördstudie 13 visat att en roman kultur system som innehåller 10% av en extracellulär matris proteinblandning och ett medium med ytterligare tillskott av natrium pyruvat, laktat och rho-associate protein kinas (ROCK) hämmare är fördelaktigt i modellering in vivo 3D embryonala arkitekturer och gav betydligt mer livskraftiga embryon i senare skede av utökad kultur jämfört med det utvidgade kultursystemet som beskrivs här. Validering av detta nya system för att visa dess reproducerbarhet kommer att krävas. Vi tror att de förfaranden som beskrivs här kan anpassas till detta nya 3D-system med mindre förändringar och kan därför gynna avancemang inom metodik inom detta område.
Detta protokoll kan också anpassas för att möjliggöra undersökning av IVF kultur media optimering. Vi har nyligen visat att i mus, embryo utveckling under utökad kultur kan förutsäga framgång fosterutveckling efter embryoöverföring18. Onormalt befruktade och kasseras mänskliga zygotes med 3 pronuclei (PN) kan odlas till blastocysts på D5 i olika förhållanden som kan sedan påverka deras utveckling under utökade kultur. Donerade D5 mänskliga blastocysts kan odlas i 48 h i nya förhållanden innan de placeras i det utökade kultursystemet för prestandautvärdering. Rutinmässiga mätningar av epiblast cell nummer, totalt celltal, utväxt område och hCG har gjort vårt laboratorium för att bättre förstå hur olika kultur medieförhållanden kan bättre stödja mänskliga pre-implantation embryo utveckling och påverka deras post-implantation framgång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill erkänna de många patienter vid Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) som nådigt har donerat sina embryon för forskning. Vi vill också tacka Karen Maruniak och det kliniska laboratoriet på CCRM för deras hjälp med bearbetning av hCG-prover, samt Sue McCormick och hennes kliniska IVF embryologi team på CCRM för deras hjälp med embryosamling, lagring, spårning och donation. Finansieringen tillhandahölls internt av CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
