Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण में ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का एकल सेल संग्रह

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61476
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Colorado Center for Reproductive Medicine

Summary

यहां, हम विट्रीफाइड ह्यूमन ब्लास्टोसिस्ट को गर्म करने, उन्हें विट्रो में प्रत्यारोपण अवधि के माध्यम से बनाने, उन्हें एकल कोशिकाओं में पचाने और आगे की जांच के लिए जल्दी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

मानव प्रत्यारोपण, अपोजिशन और गर्भाशय की सतह एपिथेलिया के लिए आसंजन और मातृ decidua में ब्लास्टोसिस्ट के बाद आक्रमण, एक महत्वपूर्ण अभी तक रहस्यपूर्ण जैविक घटना है कि ऐतिहासिक रूप से तकनीकी और नैतिक सीमाओं के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है । प्रत्यारोपण ट्रोफेक्टोडर्म के विकास से शुरुआत की जाती है ताकि जल्दी ट्रोफोब्लास्ट और बाद में अलग-अलग ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनीज में भेदभाव हो। एबररेंट अर्ली ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव से प्रत्यारोपण विफलता, अपरा विकृतियों, भ्रूण असामान्यताओं और गर्भपात हो सकते हैं। हाल ही में, मानव भ्रूण को मातृ ऊतकों की अनुपस्थिति में विट्रो में 13 के बाद निषेचन तक बढ़ने की अनुमति देने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, एक समय-अवधि जिसमें मनुष्यों में प्रत्यारोपण अवधि शामिल है। इससे शोधकर्ताओं को मानव प्रत्यारोपण की जांच करने और मातृ प्रभावों को भ्रमित किए बिना इस महत्वपूर्ण अवधि के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता को पुनः रीकैपिटल करने और वीवो में प्रारंभिक भ्रूण भेदभाव की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अंतर्निहित बाधाओं से बचने का अवसर मिला है । प्रत्यारोपण के दौरान विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज की विशेषता के लिए, हमने मौजूदा दो-आयामी (2D) विस्तारित संस्कृति विधियों को अपनाया है और डाउनस्ट्रीम परख के लिए विभिन्न प्रकार की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से पचाने और अलग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है। 2डी स्थितियों में सुसंस्कृत भ्रूण में अपेक्षाकृत चपटा आकृति विज्ञान होता है और वीवो त्रि-आयामी (3 डी) भ्रूणीय आर्किटेक्चर में मॉडलिंग में उप-अनुकूल हो सकता है। हालांकि, ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव कम प्रभावित होने लगता है जैसा कि विस्तारित संस्कृति के दौरान प्रत्याशित आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। साइटोट्रोफोब्लास्ट, सिंकियोट्रोफोब्लास्ट और प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट सहित विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को आकार, स्थान और लौकिक उद्भव से अलग किया जा सकता है, और आगे लक्षण वर्णन या प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं की जांच मानव प्रत्यारोपण को समझने, आम अपरा विकृतियों का इलाज करने और गर्भावस्था के नुकसान की घटनाओं को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जा सकती है।

Introduction

मानव प्रत्यारोपण और प्रारंभिक अपरा के उद्भव ऐतिहासिक रूप से जांच करने के लिए मुश्किल है और काफी हद तक अज्ञात रहते हैं क्योंकि मानव ऊतक इस स्तर पर दुर्गम हैं जब गर्भावस्था चिकित्सकीय अज्ञेय है। पशु मॉडल अपर्याप्त हैं, क्योंकि मानव अपरा में अन्य यूथेरियन स्तनधारियों की तुलना में अपनी अनूठी विशेषताएं हैं। उदाहरण के लिए, मानव प्लेसेंटा कुछ ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के साथ गर्भाशय मायोमेट्रियम के भीतरी तीसरे तक पहुंचने के साथ डिसिडुआ में गहराई से हमला करता है जबकि अन्य कोशिकाएं गर्भाशय सर्पिल धमनियों को फिर से तैयार करती हैं। यहां तक कि हमारे निकटतम विकासवादी पूर्वजों, गैर-मानव वानरों, मातृ,डिकिडुअल ऊतकों1,2,3के साथ अपरा आकृति विज्ञान और ट्रोफोब्लास्ट बातचीत में अंतर दिखाते हैं।, प्री-इम्प्लांटेशन मानव भ्रूण इन विट्रो प्राप्त करना 1 9 80 के दशक तक संभव नहीं था जब नैदानिक मानव इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) बांझपन4के इलाज के लिए एक नियमित अभ्यास के रूप में शुरू हुआ था। अब, मानव ब्लास्टोसिस्ट को विट्रो में उगाया जा सकता है ताकि हस्तांतरण के लिए अधिक व्यवहार्य भ्रूण के चयन के लिए अनुमति दी जा सके, साथ ही सुरक्षित आनुवंशिक परीक्षण को सक्षम किया जा सके । भ्रूण संस्कृति तकनीकों में सुधार के साथ-साथ आईवीएफ के बढ़ते उपयोग से कई अधिशेष ब्लास्टोसिस्ट मिले हैं जो रोगी के उपचार चक्र पूरा होने के बाद रहता है । रोगी की सहमति, आईआरबी अनुमोदन के साथ, और कुछ प्रतिबंधों के साथ, इन ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग अनुसंधान अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। वे एक अमूल्य संसाधन बन गए हैं जिनका उपयोग मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के व्युत्पन्न के लिए किया गया था5,भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के संक्रमण को समझना6,7और हाल ही में, मानव प्रत्यारोपण8, 9,9को फिर से तैयार करने के लिए दिन (डी) 13 तक सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया गया है।, हाल ही में विकसित एकल कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोणों का उपयोग करके, इन प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण ऊतकों तक पहुंच ने आणविक तंत्र का वर्णन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान किए हैं जो इस अत्यधिक गतिशील कोशिका भेदभाव प्रक्रिया को विनियमित करते हैं, जो पहले10, 11,,12,,,13का पता लगाने के लिए असंभव थे।12

यहां, हम मानव प्रत्यारोपण12के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता की विशेषता हमारे हाल के प्रकाशन में इस्तेमाल किए गए तरीकों का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में विट्रीफाइड ब्लास्टोसिस्ट का वार्मिंग, डी12 पोस्ट आईवीएफ तक विस्तारित भ्रूण संस्कृति, भ्रूण को एकल कोशिकाओं में एंजाइमेटिक पाचन, और डाउनस्ट्रीम परख(चित्रा 1)के लिए सेल संग्रह शामिल है। यह विस्तारित संस्कृति प्रणाली मातृ इनपुट के बिना पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण विकास का समर्थन करती है और ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव को पुनः प्राप्त करती है जो कई साल पहले 14 ,15,, 16,17 ,,17को हिस्टोलॉजिकल नमूनों से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप दिखाई देती है।17 प्रत्यारोपण के दौरान, ट्रोफोब्लास्ट आबादी में कम से कम दो सेल प्रकार शामिल होते हैं: मोनोन्यूक्लिटेड प्रोजेनिटर जैसे साइटोट्रोफोब्लास्ट (सीटीबी) और मरणासन्न विभेदित, बहुआयामी सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट (एसटीबी)। ट्रिप्सिन पाचन पर, सीटीबी छोटी, गोल कोशिकाएं हैं जो अन्य सेल वंश(चित्रा 2 ए, बाएंपैनल) से रूपात्मक रूप से अविवेच्य हैं। एपिब्लास्ट और आदिम एंडोडर्म जैसे अन्य सेल वंशों से सीटीबी का पृथक्करण, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण द्वारा प्रकट उनके अलग-अलग ट्रांसक्रिप्टोर्मिक प्रोफाइल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को आसानी से अनियमित आकार की संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है जो अन्य सेल प्रकारों की तुलना में काफी बड़े होते हैं और मुख्य रूप से भ्रूण की परिधि में स्थित होते हैं(चित्रा 2 ए,मध्य पैनल; चित्रा 2B,बाएं पैनल) । प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाएं (एमटीबी) भ्रूण विस्तारित संस्कृति के दौरान पाई जाने वाली एक और ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज हैं और इसे भ्रूण के मुख्य शरीर(चित्रा 2 ए,राइट पैनल, फिगर 2 बी,राइट पैनल) से दूर जाने के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट, हालांकि अतिरिक्त ट्रोफोब्लास्ट (ईवीटी) के रूप में एक ही मार्कर के कई व्यक्त करते हुए, ईवीटी के रूप में संदर्भित नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अपरा में लहंगा संरचनाएं विकास के इस प्रारंभिक चरण में नहीं उभरी हैं।

प्रायोगिक रूप से, हम छोटे सीटीबी और बड़े एसटीबी को इकट्ठा करने में सक्षम थे जो भ्रूण को डी 8, डी 10 और डी 12(चित्रा 2ए, बी)में एकल कोशिकाओं में पचाने के बाद आसानी से अलग होते हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट विस्तारित भ्रूण संस्कृति के बाद के चरणों में उत्पन्न होते हैं और पूरे भ्रूण(चित्रा 2ए, बी)के एंजाइमेटिक पाचन से पहले D12 में एकत्र किए जा सकते हैं। एकल कोशिका विश्लेषण से पहले इन तीन ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को अलग करके, हम विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक मार्कर की पहचान कर सकते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार की जैविक भूमिका को परिभाषित कर सकते हैं। साइटोट्रोफोब्लास्ट अत्यधिक प्रसारात्मक होते हैं और एसटीबी और एमटीबी विभेदित वंश 10 , 11,12,,1313की आपूर्ति में जनक कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं ।10 सिंकियटोट्रोफोब्लास्ट गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए अपरा हार्मोन का उत्पादन करने में शामिल हैं और एंडोमेट्रियम10 , 11 , 12,,13में बिल करने वालेभ्रूणोंके लिए भी जिम्मेदार होसकते13हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट में आक्रामक, प्रवासी फेनोटाइप की और भी मजबूत विशेषताएं हैं और गर्भाशय एंडोमेट्रियम10 , 11,,,12,13के गहरे और अधिक व्यापक उपनिवेशीकरणकेलिए जिम्मेदार हैं। प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिलिपि हस्ताक्षर को परिभाषित करने के बाद, क्लस्टरिंग विश्लेषणों से कोशिकाओं के दो अतिरिक्त सबसेट का भी पता चला है जो सीटीबी से रूपात्मक रूप से अविवेच्य थे और क्रमशः12एसटीबी और एमटीबी की विशेषताओं के साथ ट्रांसक्रिप्टोम थे । इन मध्यवर्ती चरण कोशिकाओं सीटीबी से या तो एमटीबी या एसटीबी सबलाइनेज में अंतर की प्रक्रिया में होने की संभावना है और अगर भ्रूण आंख बंद करके पचा रहे थे और कोशिकाओं को अकेले ट्रांसक्रिप्टोम द्वारा अलग किया गया था अनदेखी की गई होगी ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक दो आयामी (2डी) संस्कृति प्रणाली का उपयोग करता है और त्रि-आयामी (3 डी) संरचनात्मक विकास का समर्थन करने के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है, जैसा कि हाल ही में एक नव विकसित 3 डी संस्कृति प्रणाली13का वर्णन करते हुए एक प्रकाशन द्वारा सुझाया गया है । फिर भी , इस 2डी प्रणाली में प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट का अंतर वीवो नमूनों14 , 15, 16,,,1717में से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप प्रतीत होता है । इस प्रोटोकॉल को न्यूनतम परिवर्तनों के साथ हाल ही में वर्णित 3 डी संस्कृति प्रणाली13 में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। सभी कदम एक हाथ में माइक्रोमैनिमुलेशन पिपेट के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिस्पोजेबल टिप्स या रबर ट्यूबिंग, एक फिल्टर और एक मुखपत्र से जुड़े पतले खींचे गए ग्लास पिपेट से मुंह पिपेट के साथ किए जाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी मानव भ्रूण अनुसंधान में उपयोग के लिए सहमति के साथ दान किया गया है । विस्तारित मानव भ्रूण संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल पश्चिमी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (अध्ययन संख्या ११७९८७२) द्वारा अनुमोदित किया गया है और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों का पालन करें । मानव भ्रूण के किसी भी उपयोग की समीक्षा इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अनुसंधान संस्थान से जुड़े उचित नैतिकता और शासी निकायों द्वारा की जानी चाहिए ।

1. तैयारी

  1. एक बाँझ लैमिनार प्रवाह हुड में भ्रूण वार्मिंग से एक दिन पहले मीडिया और वसूली प्लेटें तैयार करें।
    1. 10% v/v सीरम प्रोटीन विकल्प (एसपीएस) के साथ ब्लास्टोसिस्ट कल्चर मीडिया (बीएम) की 2 मिलीएल तैयार करें।
      नोट: ब्लास्टोसिस्ट कल्चर मीडिया में अतिरिक्त प्रोटीन हो सकता है या नहीं हो सकता है। यहां, हमने एक माध्यम का उपयोग किया जिसे 10% इंगित एल्बुमिन प्रोटीन के साथ पूरक किया जाना चाहिए। इस पूरकता में भिन्नता के लिए निर्माता मार्गदर्शन की जांच करें। सभी मीडिया को संतुलन से पहले बाँझ सिरिंज से जुड़े बाँझ 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
    2. भ्रूण संस्कृति ग्रेड तेल के 500 माइक्रोन के साथ कवर 10% v/v एसपीएस के साथ बीएम के 500 μL के साथ दो केंद्र-अच्छी तरह से अंग संस्कृति धोने व्यंजन भरें।
    3. एक 60 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में, भ्रूण संस्कृति तेल की परत 8 एमसीए और फिर लंगर 10% v/v एसपीएस के साथ बीएम की 20 μL बूंदें संस्कृति प्लेट के नीचे करने के लिए । प्रत्येक भ्रूण गर्म के लिए 1 बूंद बनाओ।
      नोट: अधिक मीडिया, बूंदें, और धोने के व्यंजन जरूरत के रूप में बनाया जा सकता है । तेल को स्तरित करने से पहले बूंदों को पकवान में भी जोड़ा जा सकता है। तेल के नीचे लंगर की बूंदों वाष्पीकरण और ओस्मोलिटी में किसी भी बाद में परिवर्तन को कम करने में मदद मिलेगी ।
    4. इक्विलिब्रेट बीएम 10% v/v एसपीएस वॉश डिश और रिकवरी प्लेट के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, 5% ओ2 के लिए कम से कम 4 घंटे में।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस में या बेंच टॉप पर विस्तारित संस्कृति मीडिया (IVC1) के पहले कदम की एक शीशी गल।
    6. कोई तेल ओवरले के साथ IVC1 के 500 माइक्रोन की एक वॉश डिश तैयार करें। एक 5 एमएल स्नैप कैप ट्यूब में IVC1 के लगभग 4 एमएल Aliquot ।
    7. इक्विलिब्रेट आईवीसी1 वॉश डिश और आईवीसी1 की छोटी स्नैप कैप ट्यूब 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2 और वायुमंडलीय ओ2 में कम से कम 4 घंटे के लिए।
  2. एक बाँझ लैमिनार प्रवाह हुड में भ्रूण वार्मिंग से एक दिन पहले विस्तारित संस्कृति प्लेटें तैयार करें।
    1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में मानव सीरम से 30 μg/mL के लिए पतला फाइब्रोनेक्टिन । कक्षों को कोट करने के लिए प्रति भ्रूण 30 माइक्रोनेक्टिन के 250 माइक्रोनल की आवश्यकता होगी।
    2. कुओं को छूने के लिए ध्यान नहीं रखते हुए हुड के नीचे 8 अच्छी तरह से कक्षित कवरस्लिप पैकेज खोलें। धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में 30 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन के 250 माइक्रोन पाइपेट करें।
    3. ढक्कन को कक्षित कवर्लिप में वापस करें और 20-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  3. भ्रूण वार्मिंग की सुबह में विस्तारित संस्कृति प्लेट तैयार करें।
    1. फाइब्रोनेक्टिन के साथ कक्षित कवरलिप को पुनः प्राप्त करें और लैमिनार प्रवाह हुड में रखें। फाइब्रोनेक्टिन मिश्रण को 1 एमएल पिपेट के साथ निकालें और अपशिष्ट कंटेनर में त्याग दें।
    2. छोटे 5 एमएल स्नैप कैप ट्यूब से गरम, समतुल्य IVC1 मीडिया को पुनः प्राप्त करें।
    3. प्रत्येक कुएं में समान रूप से इवीसी1 का पिपेट 300 माइक्रोन। सावधान रहें कि किसी भी तरल पदार्थ को ढक्कन को छूने न दें क्योंकि इससे प्रदूषण का खतरा बढ़ जाएगा।
    4. 4 चरण में जोना पेलुसिडा को हटाने तक 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, और वायुमंडलीय ओ2 में इनक्यूबेट करने के लिए IVC1 के साथ कक्षित कवरलिप वापस करें।

2. वार्मिंग vitrified D5 मानव भ्रूण

नोट: अन्य निर्माताओं के पास अपनी विट्रीफिकेशन तकनीक के अनुसार थोड़ा अलग प्रोटोकॉल हो सकते हैं। लागू होने पर उपयोग के लिए निर्माता के निर्देश देखें।

  1. 35 मिमी डिश में 3.0 एमएल विगलन सॉल्यूशन (टीएस) को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। तनु पड़ने के घोल (डीएस) के 300 माइक्रोन और 300 μL के दो कुओं को कमरे के तापमान में 6 अच्छी तरह से प्लेट में लाएं।
  2. संदंश का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करते हुए कि विट्रीफाइड भ्रूण हमेशा तरल नाइट्रोजन के नीचे रहता है, ध्यान से क्रायो डिवाइस आस्तीन को हटा दें।
  3. क्रायो डिवाइस को लिक्विड नाइट्रोजन से जल्दी से मूव करें और टीएस में क्रायो डिवाइस की नोक को 37 डिग्री सेल्सियस पर डुबकी लगा लें। 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और क्रायो डिवाइस को तब तक जलमग्न रखें जब तक कि भ्रूण टीएस में अलग न हो जाए।
    नोट: गर्म भ्रूण एक समय में एक भ्रूण पहचान का ट्रैक रखने के रूप में वे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में रोगी जनसांख्यिकीय जानकारी से संबंधित हो सकता है ।
  4. टीएस में 1 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, ध्यान से क्रायो डिवाइस को हटा दें और धीरे-धीरे भ्रूण को उठाएं और टीएस डिश के विपरीत दिशा में जाएं।
    नोट: यदि कई भ्रूण culturing, भ्रूण को अलग रखने के लिए उचित पहचान सुनिश्चित करने के लिए मेहनती हो बनाए रखा जाता है ।
  5. 1 मिनट के बाद, धीरे से टीएस की एक छोटी राशि के साथ भ्रूण उठाओ, लगभग 2 μL । पिपेट से टीएस की पतली परत में भ्रूण को कवर करते हुए भ्रूण को 300 माइक्रोन डीएस के नीचे अच्छी तरह से ले जाएं। 3 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और कमरे के तापमान पर बेंच टॉप पर 6-वेल प्लेट रखें।
  6. 3 मिनट के बाद, डीएस की एक छोटी राशि के साथ भ्रूण उठाओ, लगभग 2 μL, और अगले अच्छी तरह से WS के ३०० μL युक्त के नीचे भ्रूण ले । फिर, धीरे भ्रूण पर पिपेट से डीएस की एक छोटी राशि परत । 5 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और बेंच टॉप पर लौटें।
  7. 5 मिनट के बाद, डब्ल्यूएस की न्यूनतम मात्रा के साथ भ्रूण उठाएं और 300 माइक्रोन डब्ल्यूएस के अंतिम कुएं के शीर्ष पर जाएं। भ्रूण धीरे-धीरे गिर जाएगा और डब्ल्यूएस के माध्यम से नीचे तक धो देगा। किसी भी बनाए रखा WS एक खाली कुएं में पिपेट से निष्कासित।
  8. न्यूनतम मात्रा के साथ भ्रूण उठाओ और WS के एक ही 300 μL अच्छी तरह से शीर्ष पर लौटें। भ्रूण एक बार फिर कुएं के नीचे तक गिर जाएगा। 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और बेंच टॉप पर 6-वेल प्लेट वापस करें।

3. गर्म भ्रूण की वसूली

  1. एक समय में एक, एक केंद्र में गरम भ्रूण कदम-अच्छी तरह से अंग ऊतक पकवान 10% v/v एसपीएस के तहत 10% v/v एसपीएस के साथ समतुलित भ्रूण संस्कृति ग्रेड तेल के ५०० μL के साथ ५०० μL युक्त ।
  2. प्रत्येक भ्रूण उठा और उन्हें पकवान में कई क्षेत्रों के लिए चारों ओर ले जा रहा है, जबकि बाहर चालें के बीच पुराने मीडिया उड़ाने से भ्रूण धोने । भ्रूण उठाओ और यह तेल के तहत 10% v/v एसपीएस के साथ समान रूप से बीएम के एक व्यक्ति 20 μL संस्कृति ड्रॉप करने के लिए ले जाते हैं ।
  3. गर्म भ्रूण 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ 2, 5% O2 पर एक इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए ठीक होजाते हैं।

4. जोना हटाने

  1. एक 2 घंटे की वसूली के बाद, फिर से विस्तार के लिए भ्रूण का आकलन और प्रत्येक भ्रूण की तस्वीरें ले लो ।
  2. एक 3 के 500 माइक्रोन में व्यक्तिगत रूप से भ्रूण ले जाएँ- (N-morpholino) -प्रोपेन्सल्फोनिक एसिड (MOPS) - 5% (v/v) भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ बफर हैंडलिंग माध्यम अम्लीय है Tyrode समाधान के साथ उपचार से पहले.
  3. माइक्रोस्कोप के माध्यम से सक्रिय रूप से देखते हुए गर्म अम्लीय टायरोड के समाधान के 300 माइक्रोन के माध्यम से एक भ्रूण को जल्दी से ले जाएं। जोना पेलुसिडा नेत्रहीन को भंग करने के लिए शुरू कर देंगे । इसमें लगभग 5 एस लगेंगे।
  4. तुरंत एसिड टायरोड के समाधान को बुझाने के लिए गर्म एमओपी के 300 माइक्रोन में जोना को भंग करने के साथ भ्रूण को स्थानांतरित करें।
  5. एमओपीएस बफर माध्यम की न्यूनतम मात्रा के साथ भ्रूण को एक केंद्र-अच्छी तरह से अंग ऊतक पकवान में ले जाएं जिसमें 500 माइक्रोन के साथ 50% v/v एसपीएस के साथ 500 माइक्रोन के तहत समानीकृत भ्रूण संस्कृति ग्रेड तेल को धोने के लिए।
  6. चरण 3.2 से 20 माइक्रोन रिकवरी ड्रॉप करने के लिए भ्रूण वापस करें।
    नोट: जोना हटाने के बाद दृश्य परीक्षा पर, बनाए रखा zona pellucidae के साथ किसी भी भ्रूण आगे अम्लीय है Tyrode समाधान के साथ इलाज किया जा सकता है यदि आवश्यक हो, कदम 4.2-4.6 दोहरा द्वारा । टायरोड के समाधान के संपर्क को कम करना वांछित है।

5. ब्लास्टोसिस्ट विस्तारित संस्कृति

  1. भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से कदम 1.1.6 से समानीकृत IVC1 मीडिया के साथ धोने के पकवान में ले जाएं। ध्यान से एक भ्रूण को समान रूप से आईवीसी 1 के साथ कक्षीकृत कवरलिप के एक कुएं में ले जाएं और भ्रूण की पहचान बनाए रखें।
    नोट: मध्यम वाष्पीकरण को कम करने के लिए इस कदम को जितनी जल्दी हो सके समाप्त करने की आवश्यकता है।
  2. 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, वायुमंडलीय ओ2 के लिए सेट एक इनक्यूबेटर के लिए एक इनक्यूबेटर के लिए वापसी कक्ष कवरलिप।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, मीडिया एक्सचेंज 4 एच के लिए वायुमंडलीय ओ 2 में मीडिया कोगल और बराबर करना सुनिश्चित करें।
  3. आउटग्रोथ डी 2 (D7 पोस्ट निषेचन) पर, माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के लगाव की सावधानीपूर्वक जांच करें और मीडिया एक्सचेंज करें।
    1. नोट मीडिया का आदान-प्रदान करने से पहले कौन सा भ्रूण डिश से जुड़ा होता है। धीरे-धीरे प्लेट पर टैप करें और जांच करें कि क्या किसी भ्रूण ने माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट से सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है।
    2. ढक्कन निकालें और ध्यान से IVC1 के 150 μL निकालें और संलग्न भ्रूण को परेशान नहीं करते हुए त्यागें। यदि कोई भ्रूण अभी तक प्लेट से जुड़ा नहीं है, तो मीडिया का आदान-प्रदान न करें, क्योंकि IVC1 में सीरम भ्रूण लगाव में सहायता करेगा ।
    3. पिपेट 150 μL का विस्तारित विस्तारित संस्कृति मीडिया, आईवीसी 2, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में और ढक्कन को कक्षित कवरस्लिप में वापस करें।
      नोट: मध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए सुनिश्चित करें कि कक्ष कवरलिप से ढक्कन हटाने को कम किया जाता है।
  4. ध्यान से ढक्कन पर किसी भी मीडिया छिड़काव के बिना इनक्यूबेटर के लिए कक्ष कवरलिप वापस। दोहराएं मीडिया विनिमय और लगाव विस्तारित संस्कृति के हर दिन की जांच जब तक भ्रूण निर्धारण या एकल कोशिका पाचन के लिए तैयार हैं ।

6. खर्च मीडिया का वैकल्पिक संग्रह

  1. वैकल्पिक रूप से, D7 या उसके बाद किसी भी दिन के बाद संस्कृति मीडिया के आदान-प्रदान के दौरान खर्च किए गए मीडिया को इकट्ठा करें। चरण 5.3.2 के दौरान, मध्यम स्नैप को त्यागने के बजाय भविष्य के विश्लेषण के लिए एक बाँझ, कम बांध 0.5 एमएल ट्यूब में हटाए गए IVC1 के 150 माइक्रोन को फ्रीज करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए वैकल्पिक निर्धारण

  1. किसी भी बाहुलर मलबे को हटाने के लिए निर्धारण से पहले 3x के लिए पीबीएस के 1/2 मीडिया एक्सचेंजों के साथ भ्रूण धोने के लिए एक २०० μL पिपेट का उपयोग करें । अतिरिक्त मलबे और प्रोटीन को धोने से स्पष्टता का अनुकूलन करने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ प्राप्त छवियों में पृष्ठभूमि को कम करने में मदद मिलेगी।
  2. सभी मीडिया को हटा दें और धीरे-धीरे पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 माइक्रोल को अच्छी तरह से जोड़ें। भ्रूण तरल पदार्थ की सतह से चिपके रहना चाहेगा। सभी तरल पदार्थ को हटाने से पहले 4% पीएफए के साथ कई 150 μL धोता भ्रूण को किसी भी नुकसान को कम करने में मदद मिलेगी।
  3. निर्धारण के लिए 20 मिनट के लिए 4% पीएफए में भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
  4. ताजा पीबीएस में 0.1% v/v पॉलीसॉरबेट 20 के 200 माइक्रोन के साथ प्रति वॉश 10 मिनट के लिए भ्रूण 3x धोएं।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले पीबीएस में 0.1% v/v पॉलीसोरबेट 20 में 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स्ड भ्रूण स्टोर करें।

8. ट्राइप्सिन के साथ एकल कोशिका पाचन

नोट: ताजा (तय नहीं) भ्रूण एकल कोशिका पाचन के लिए उपयोग किया जाता है ।

  1. पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ एक बार भ्रूण को धोएं और प्रत्येक कुएं में ट्राइपसिन समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के लिए कक्ष कवरलिप वापस।
  2. इनक्यूबेटर से कक्षित कवरलिप निकालें और एक स्टीरियोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें। भ्रूण की परिधि पर कोशिकाओं को वापस लेना शुरू कर देंगे और एमटीबी अभी भी थाली जहां वे दूर से भ्रूण से स्थित है से जुड़ा होना चाहिए ।
  3. पूरे भ्रूण को तोड़ने से पहले व्यक्तिगत एमटीबी लेने के लिए एक छोटे पिपेट या पतले खींचे गए मुंह पिपेट का उपयोग करें। एमटीबी को बचाने के लिए 9.1 कदम करने के लिए आगे छोड़ें और चरण 9.3 के बाद चरण 8.4 पर लौटें।
  4. ऊपर और नीचे उठकर भ्रूण को धीरे-धीरे अलग करने के लिए हैंडहेल्ड माइक्रोमैनिमुलेशन पिपेट या माउथ पिपेट का उपयोग करें।
  5. कोशिकाओं को पूरे भ्रूण से अलग करने के लिए शुरू हो जाएगा। भ्रूण को धीरे-धीरे और बार-बार एक छोटे व्यास पिपेट टिप या मुंह पिपेट का उपयोग करना जारी रखें जब तक कि भ्रूण को ट्राइप्सिन में कुल 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड नहीं किया गया हो।

9. एकल सेल चयन और नमूना संग्रह

  1. न्यूनतम ट्रिप्सिन के साथ, भ्रूण संस्कृति तेल के तहत 20 माइक्रोन पीबीएस + 0.1% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) की तीन वॉश बूंदों के माध्यम से अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, देखभाल के साथ किसी भी कोशिकाओं को खोने के लिए नहीं।
  2. कोशिकाओं को धोने के बाद, एक सेल का चयन करने के लिए एक पतले खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करें। ध्यान से एक बाँझ 0.2 मिलील कम बांध ट्यूब PBS + 0.1% पीवीपी की न्यूनतम मात्रा के साथ में एक पाइपेट।
  3. स्नैप तरल नाइट्रोजन (एलएन2)में एकल कोशिकाओं को फ्रीज करें, और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

स्वस्थ भ्रूण विस्तारित संस्कृति(चित्रा 2B)के पाठ्यक्रम पर निरंतर प्रसार का प्रदर्शन किया । असामान्य भ्रूण अपने बाहरी किनारों से वापस लेना और विखंडित(चित्रा 2C)करने लगे। हमारे अनुभव से, लगभग 75% भ्रूण 48 घंटे में फाइब्रोनेक्टिन लेपित पकवान के नीचे से जुड़े थे और संस्कृति में 72 घंटे तक लगाव लगभग 90% तक बढ़ गया। भ्रूण लगाव की सफलता काफी हद तक ब्लास्टोसिस्ट की प्रारंभिक गुणवत्ता से प्रभावित हो सकती है। भ्रूण ७२ घंटे से संलग्न नहीं होने की संभावना जीवित नहीं होगा ।

D8 पोस्ट निषेचन (विस्तारित संस्कृति के D3) में, भ्रूण में अधिकांश कोशिकाएं सीटीबी थीं जो ट्रोफोब्लास्ट मार्कर GATA3(चित्रा 3A)के लिए सकारात्मक थीं। साइटोट्रोफोब्लास्ट्स ने पहले से ही भ्रूण की परिधि(चित्रा 2B, बाएंपैनल, बिंदीदार रेखा) पर बहुनीय एसटीबी में अंतर करना शुरू कर दिया था। इन एसटीबी में शीट जैसी उपस्थिति थी और मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन सबयूनिट बीटा (एचसीजीबी) के लिए सकारात्मक थे; चित्रा 3A,केंद्र पैनल) । भ्रूण जल्दी से बढ़ी, D8 और D10 के बीच, इस अवधि के दौरान CTB के एक तेजी से सेल प्रसार का सुझाव । D10 में, सीजीबी पॉजिटिव एमटीबी का गठन अधिकतम था, जिसकी पुष्टि इस समय एचसीजी उत्पादन के उछाल(चित्रा 3 बी)से की जा सकती है। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट भी उभरने लगे और भ्रूण शरीर से दूर चले गए और ईवीटी मार्कर, एचएलए-जी(चित्रा 3 ए,राइट पैनल) के लिए सकारात्मक दाग रहे थे। D12 द्वारा, एसटीबी भेदभाव में गिरावट आई थी और एमटीबी उत्पादन अधिक प्रमुख हो गया, डी 10 पर हार्मोन उत्पादन से D12 पर सेल माइग्रेशन पर जोर देने का सुझाव दिया गया। इन परिवर्तनों को इस पेरी-प्रत्यारोपण अवधि(मूवी 1)के दौरान प्राप्त समय-चूक वीडियो द्वारा देखा गया था। हमारे एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा भी सेल समारोह में इस तरह के गतिशील परिवर्तन परिलक्षित । साथ में, ये डेटा प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव का सुझाव देते हैं और प्रारंभिक अपरा का उद्भव एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसके दौरान भ्रूण सफल प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए बहुत विशिष्ट समय बिंदुओं पर अत्यधिक विशिष्ट कोशिका कार्यों को प्राथमिकता दे सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: विस्तारित संस्कृति और एकल सेल नमूना संग्रह की प्रक्रियात्मक योजनाबद्ध।
वार्मिंग विट्रीफाइड भ्रूण, जोना पेलुसिडा हटाने, विस्तारित भ्रूण संस्कृति, एंजाइमेटिक पाचन, और साइटोट्रोफोब्लास्ट (सीटीबी), सिंकिस्टियोट्रोफोब्लास्ट (एसटीबी), और प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट (एमटीबी) का अलगाव। इस आंकड़े को पश्चिम एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विस्तारित संस्कृति के दौरान ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं और भ्रूण की मोर्फोलोजी।
(ए)ट्राइप्सिन के साथ एंजाइमेटिक पाचन के बाद विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सेल प्रकारों की प्रतिनिधि छवियां। बाईं ओर छोटा सीटीबी, बीच में बड़ा एसटीबी, और दाईं ओर एमटीबी। (ख)D8 (बाएं), D10 (मध्य) और D12 (दाएं) में स्वस्थ भ्रूण के प्रतिनिधि छवियां । बाएं पैनल में धराशायी लाइनें संभवतः प्रोलिफेरेटिव सीटीबी आबादी की रूपरेखा तैयार करती हैं जबकि बिंदीदार रेखा चपटी एसटीबी को रेखांकित करती है । सही पैनल में गुलाबी हलकों एमटीबी कि दूर से भ्रूण से स्थित थे रूपरेखा । (ग)असामान्य भ्रूण के प्रतिनिधि छवियों को वापस लेने और D8 (बाएं), D10 (मध्य), और D12 (दाएं) में विघटित करने के लिए शुरुआत । स्केल बार = 200 माइक्रोन। कुछ छवियों को पश्चिम एट अलसेअनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विस्तारित संस्कृति के दौरान ट्रोफोब्लास्ट मार्कर अभिव्यक्ति और एचसीजी उत्पादन की प्रतिनिधि छवियां।
(A)D10 (बाएं), D10 (मध्य) में एसटीबी मार्कर CGB, और D12 (दाएं) में एमटीबी मार्कर एचएलए-जी में सीटीबी मार्कर GATA3 की अभिव्यक्ति दिखाने वाले भ्रूणों की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां । स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी)प्रतिनिधि एचसीजी एकाग्रता (mIU/एमएल) डी 8 से डी 12 (मतलब ± SEM, n = 3) के विस्तारित संस्कृति के पाठ्यक्रम पर। सांख्यिकीय विश्लेषण वन-वे एवरोवा के साथ किया गया था जिसके बाद तुकी का परीक्षण (पी एंड एलटी; 0.05) था। इन छवियों को पश्चिम एट अल12से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: डी 8 से D12 तक विस्तारित संस्कृति में एक मानव भ्रूण का समय-चूक वीडियो। वीडियो ब्लास्टोकोल के पतन को दर्शाता है, एसटीबी का गठन (हरे घेरे द्वारा इंगित), और फिर एमटीबी के अंतिम भेदभाव और प्रवास (नारंगी हलकों द्वारा इंगित)। इसे पश्चिम एट अल12से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रत्यारोपण के माध्यम से मानव भ्रूण को संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के विकास ने वैज्ञानिकों को विकासमेंपहले से अज्ञात समय का पता लगाने की अनुमति दी है8 ,9. यहां, हम मानव भ्रूण संस्कृति के लिए एक विस्तारित संस्कृति प्रणाली का उपयोग करें और villous अपरा के गठन से पहले जल्दी ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव का अध्ययन । यहां वर्णित तरीके हमें डाउनस्ट्रीम सिंगल-सेल विश्लेषण में उपयोग के लिए विभिन्न टीबी उपरेखाओं को इकट्ठा करने की अनुमति देते हैं। यह काम वैज्ञानिक समुदाय को मानव विकास में इस महत्वपूर्ण और रहस्यपूर्ण अवधि को समझने का मौका देता है, और गर्भपात या पूर्व-एक्लेम्पसिया जैसी अन्य अपरा विकृतियों के लिए चिकित्सीय उपचार के लिए नए अवसर खोल सकता है, साथ ही प्रारंभिक मानव विकास के बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण वार्मिंग के दौरान भ्रूण हेरफेर में कौशल की आवश्यकता है, zona हटाने और चढ़ाना विस्तारित संस्कृति से पहले भ्रूण तनाव को कम करने के लिए । मीडिया वाष्पीकरण को कम करना और इस प्रकार मीडिया एक्सचेंज के दौरान एक्सपोजर के समय को सीमित करके मध्यम ऑस्मोलिटी में वृद्धि आवश्यक है। मध्यम और चलती व्यंजनों का आदान-प्रदान करते समय उचित एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करने का ध्यान रखना संदूषण को कम करने में मदद करेगा। जब उपयोग में किसी भी यांत्रिक अशांति को कम करने के लिए उपयोग में जब भ्रूण संलग्न है पकवान स्थिर भी महत्वपूर्ण है । भ्रूण है कि जोर दिया हो उनके समकालिक अनुमानों को पीछे हटना शुरू कर देंगे और apoptose शुरू करते हैं । यह भी संस्कृति मीडिया के meniscus भ्रूण की सतह को छूने के लिए अनुमति देने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, और कुओं में किसी भी तेल को कम करने के लिए । इन परिदृश्यों में से कोई भी भ्रूण को नष्ट कर सकता है।

ब्लास्टोसिस्ट चरण से परे मानव भ्रूण को ढंग से तैयार करना एक तेजी से विकसित होता हुआ क्षेत्र है। हाल ही में एक अध्ययन13 का प्रदर्शन किया है कि एक उपन्यास संस्कृति प्रणाली है जो एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन मिश्रण का 10% और सोडियम pyruvate, लैक्टेट, और rho-एसोसिएट प्रोटीन kinase (रॉक) अवरोधक के अतिरिक्त पूरकता के साथ एक माध्यम वीवो 3 डी भ्रूण वास्तुकला में मॉडलिंग में लाभप्रद है और विस्तारित संस्कृति के बाद के चरण में काफी अधिक व्यवहार्य भ्रूण मिले यहां वर्णित प्रणाली की तुलना में । इस नई प्रणाली के सत्यापन के लिए अपनी प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करने की आवश्यकता होगी । हमारा मानना है कि यहां वर्णित प्रक्रियाओं को मामूली परिवर्तनों के साथ इस नए 3डी प्रणाली के अनुकूल किया जा सकता है और इसलिए, इस क्षेत्र में कार्यप्रणाली में उन्नति को लाभ हो सकता है ।

आईवीएफ संस्कृति मीडिया अनुकूलन में जांच की अनुमति देने के लिए इस प्रोटोकॉल को भी अनुकूलित किया जा सकता है। हमने हाल ही में दिखाया है कि माउस में, विस्तारित संस्कृति के दौरान भ्रूण विकास भ्रूण हस्तांतरण18के बाद भ्रूण के विकास की सफलता की भविष्यवाणी कर सकता है । 3 प्रोन्यूक्लिई (पीएन) के साथ असामान्य रूप से निषेचित और फेंके गए मानव जाइगोट्स को विभिन्न परिस्थितियों में डी 5 पर ब्लास्टोसिस्ट के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है जो तब विस्तारित संस्कृति के दौरान उनके विकास को प्रभावित कर सकते हैं। दान D5 मानव blastocysts प्रदर्शन मूल्यांकन के लिए विस्तारित संस्कृति प्रणाली में रखा जा रहा से पहले उपन्यास शर्तों में ४८ एच के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है । एपिब्लास्ट सेल संख्या, कुल सेल संख्या, आउटग्रोथ क्षेत्र और एचसीजी के नियमित मापन ने हमारी प्रयोगशाला को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति दी है कि विभिन्न संस्कृति मीडिया की स्थिति मानव पूर्व प्रत्यारोपण भ्रूण विकास का बेहतर समर्थन कर सकती है और उनके प्रत्यारोपण के बाद की सफलता को प्रभावित कर सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रजनन चिकित्सा के लिए कोलोराडो केंद्र (CCRM) है कि शालीनता से अनुसंधान के लिए अपने भ्रूण दान किया है पर कई रोगियों को स्वीकार करना चाहते हैं । हम एचसीजी नमूनों के प्रसंस्करण में उनकी मदद के लिए करेन मारुनियाक और सीसीआरएम में नैदानिक प्रयोगशाला के साथ-साथ मुकदमा मैककॉर्मिक और सीसीआरएम में उसके नैदानिक आईवीएफ भ्रूणविज्ञान टीम को भ्रूण संग्रह, भंडारण, ट्रैकिंग और दान के साथ उनकी मदद के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। सीसीआरएम द्वारा आंतरिक रूप से वित्तपोषण प्रदान किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NORM JECT Luer Lock sterile syringe VWR 53548-019 Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 160 मानव भ्रूण पेरी-प्रत्यारोपण ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाएं विस्तारित संस्कृति एकल कोशिका पाचन
पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण में ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का एकल सेल संग्रह
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Logsdon, D. M., Kile, R. A.,… More

Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter