Summary
We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.
Abstract
Uitgebreide studies hebben de ontwikkeling en differentiatie van muriene B-cellen in secundaire lymfoïde organen gekenmerkt. Antilichamen die door B-cellen worden uitgescheiden, zijn geïsoleerd en ontwikkeld tot gevestigde therapieën. Validatie van de ontwikkeling van muizen B-cellen, in de context van auto-immuungevoelige muizen, of bij muizen met een gemodificeerd immuunsysteem, is een cruciaal onderdeel van het ontwikkelen of testen van therapeutische middelen bij muizen en is een geschikt gebruik van flowcytometrie. Gevestigde cytometrische parameters van de B-celstroom kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van B-cellen in het peritoneum van het muizenvlies, het beenmerg en de milt te evalueren, maar er moeten een aantal best practices worden nageleefd. Bovendien moet flowcytometrische analyse van B-celcompartimenten ook aanvullende uitlezingen van B-celontwikkeling aanvullen. Gegevens die met behulp van deze techniek worden gegenereerd, kunnen ons begrip van wilde, auto-immuungevoelige muismodellen en gehumaniseerde muizen bevorderen die kunnen worden gebruikt om antilichamen of antilichaamachtige moleculen als therapeutica te genereren.
Introduction
Monoklonale antilichamen zijn in toenemende mate de keuzetherapie geworden voor veel menselijke ziekten, omdat ze deel gaan uitmaken van de reguliere geneeskunde1,2. We hebben eerder genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die efficiënt antilichamen produceren die volledig menselijke variabele gebieden herbergen met muis IgH-constanten3,4. Onlangs hebben we genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die antilichaamachtige moleculen produceren die verschillende antigeenbinding5 hebben. Antilichamen worden uitgescheiden door B-cellen en vormen de basis van adaptieve humorale immuniteit. Er zijn twee verschillende soorten B-cellen, B-1 en B-2. Bij zoogdieren ontstaan B-1-cellen in de foetale lever en worden ze na de geboorte verrijkt in slijmvliesweefsels en de pleurale en peritoneale holtes, terwijl B-2-cellen vóór de geboorte ontstaan in de foetale lever en daarna in het beenmerg (BM). B-2 cellen worden verrijkt in secundaire lymfoïde organen, waaronder de milt en het bloed6,7,8. In de BM beginnen B-2 hematopoietische voorlopers te differentiëren naar pro-B-cellen bij de initiatie van Ig mu zware ketenherschikking9,10. Succesvolle herschikking van de zware keten van Ig en de assemblage ervan in de pre-B-celreceptor (pre-BCR), samen met signalering en proliferatieve expansie, leidt tot differentiatie naar pre-B-cellen. Nadat pre-B-cellen hun Ig kappa (Igκ), of indien onproductief, Ig lambda (Igλ) lichte ketens herschikken, paren ze met μ zware keten, wat resulteert in oppervlakte IgM BCR-expressie. Het is belangrijk erop te wijzen dat bekend is dat de expressie van het IgM-oppervlak verminderd is onder omstandigheden van autoreactiviteit, waardoor wordt bijgedragen aan zelftolerantie in functioneel niet-reagerende of anerge B-cellen11,12. Onrijpe B-cellen komen dan in een overgangsfase, waar ze IgD beginnen te co-expresseren en migreren van de BM naar de milt. In de milt neemt de IgD-expressie verder toe en rijpen de cellen tot een tweede fase van overgangs-B-cellen, gevolgd door voltooiing van hun rijpingsstatus en ontwikkeling tot marginale zone (MZ) of folliculaire (Fol) cellen13,14,15. Bij volwassen muizen, in een niet-zieke omgeving, blijft het aantal volwassen B-cellen constant, ondanks dat er dagelijks 10-20 miljoen onrijpe B-cellen in de BM worden gegenereerd. Hiervan komt slechts drie procent in de poel van volwassen B-cellen. De grootte van het perifere B-celcompartiment wordt beperkt door celdood, deels als gevolg van verschillende factoren, waaronder zelfreactiviteit en onvolledige rijping16,17,18. Flowcytometrische analyse is uitgebreid gebruikt om veel subcompartimenten van immuuncellen bij mensen en muizen te karakteriseren en op te sommen. Hoewel er enkele overeenkomsten zijn tussen menselijke en muriene B-celcompartimenten, is dit protocol alleen van toepassing op de analyse van muriene B-cellen. Dit protocol is ontwikkeld met het doel om genetisch gemanipuleerde muizen te fenotyperen, om te bepalen of genetische manipulatie de ontwikkeling van B-cellen zou veranderen. Flowcytometrie is ook enorm populair geweest in veel andere toepassingen, waaronder bij het meten van celactivering, functie, proliferatie, cyclusanalyse, DNA-inhoudsanalyse, apoptose en celsortering 19,20.
Flowcytometrie is het instrument bij uitstek om verschillende lymfocytencompartimenten bij muizen en mensen te karakteriseren, inclusief in complexe organen zoals de milt, BM en bloed. Vanwege de algemeen beschikbare muisspecifieke antilichaamreagentia voor flowcytometrie kan deze techniek worden gebruikt om niet alleen celoppervlakeiwitten te onderzoeken, maar ook intracellulaire fosfoproteïnen en cytokines, evenals functionele uitlezingen21. Hierin laten we zien hoe flowcytometrie-reagentia kunnen worden gebruikt om B-cellensubsets te identificeren terwijl ze rijpen en differentiëren in secundaire lymfoïde organen. Na optimalisatie van kleuringsomstandigheden, monsterverwerking, correcte instrumentopstelling en gegevensverzameling, en ten slotte gegevensanalyse, kan een protocol voor uitgebreide flowcytometrische analyse van het B-celcompartiment bij muizen worden gebruikt. Een dergelijke uitgebreide analyse is gebaseerd op een decennia oude nomenclatuur bedacht door Hardy en collega's, waarbij de ontwikkeling van BM B-2-cellen kan worden verdeeld in verschillende fracties (fraction), afhankelijk van hun expressie van B220, CD43, BP-1, CD24, IgM en IgD22. Hardy et al., toonden aan dat B220+ CD43 BM B-cellen kunnen worden onderverdeeld in vier subsets (Fractie A-C') op basis van BP-1 en CD24 (30F1) expressie, terwijl B220+ CD43-(dim to neg) BM B-cellen kunnen worden opgelost in drie deelverzamelingen (Fractie D-F) op basis van differentiële expressie van IgD en oppervlakte IgM23. Fractie A (pre-pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1- CD24 (30F1)-, Fractie B (vroege pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1- CD24 (30F1)+, Fractie C (late pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1+ CD24 (30F1)+, en Fractie C' (vroege pre-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1+ en CD24high. Verder worden Fractie D (pre-B-cellen) gedefinieerd als B220+ CD43- IgM- B-cellen, en Fractie E (nieuw gegenereerde B-cellen, combinatie van onrijp en overgangscellen) worden gedefinieerd als B220+ CD43- IgM+ B-cellen en Fractie F (volwassen, recirculterende B-cellen) worden gedefinieerd als B220high CD43- IgM+ B-cellen. Daarentegen kan de meerderheid van de naïeve B-cellen in de milt worden onderverdeeld in volwassen (B220+ CD93-) B-cellen en overgangscellen (T1, T2, T3), afhankelijk van de expressie van CD93, CD23 en IgM. Volwassen B-cellen kunnen worden opgelost in marginale zone- en folliculaire subsets op basis van expressie van IgM en CD21/CD35, en folliculaire subsets kunnen verder worden onderverdeeld in volwassen folliculaire type I en folliculaire type II B celsubsets, afhankelijk van het niveau van hun IgM- en IgD-oppervlakte-expressie24. Deze milt B-celpopulaties drukken voornamelijk Igκ lichte keten uit. Ten slotte zijn B-1 B-celpopulaties, die hun oorsprong vinden in de foetale lever en voornamelijk worden aangetroffen in de peritoneale en pleurale holtes van volwassen muizen, beschreven in de literatuur. Deze peritoneale B-cellen kunnen worden onderscheiden van de eerder beschreven B-2 B-cellen door hun gebrek aan CD23-expressie. Ze worden vervolgens verder onderverdeeld in B-1a- of B-1b-populaties, waarbij de eerste wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van CD5 en de laatste door de afwezigheid ervan25. B-1 cel voorlopercellen zijn overvloedig aanwezig in de foetale lever, maar worden niet gevonden in volwassen BM. Hoewel B-1a- en B-1b-cellen afkomstig zijn van verschillende voorlopers, zaaien ze beide de peritoneale en pleurale holtes24. In tegenstelling tot B-2-cellen zijn B-1-cellen uniek in staat tot zelfvernieuwing en zijn ze verantwoordelijk voor de productie van natuurlijke IgM-antilichamen.
Defecten in de ontwikkeling van B-cellen kunnen zich in veel gevallen voordoen, waaronder tekortkomingen in de componenten van de BCR26,27, verstoringen van signaalmoleculen die de BCR-signaalsterkte beïnvloeden14,28,29, of verstoring van cytokines die de overleving van B-cellen moduleren30,31 . Flowcytometrie-analyse van de lymfoïde compartimenten heeft bijgedragen aan de karakterisering van de B-celontwikkelingsblokken bij deze muizen en vele anderen. Een voordeel van flowcytometrische analyse van lymfoïde compartimenten is dat het de mogelijkheid biedt om metingen te doen op individuele cellen verkregen uit levend gedissocieerd weefsel. De beschikbaarheid van reagentia in een steeds groter wordend bereik van fluoroforen maakt de gelijktijdige analyse van meerdere parameters mogelijk en maakt de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk. Bovendien vormt de opsomming van B-cellen door flowcytometrische analyse een aanvulling op andere immunologische testen, zoals immunohistochemische methoden die cellokalisatie in lymfoïde organen visualiseren, detectie van circulerende antilichaamniveaus als een maat voor humorale immuniteit, evenals twee fotonmicroscopie om B-celresponsen in reële ruimte en tijd te meten32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muisstudies werden gecontroleerd en goedgekeurd door Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het experiment werd uitgevoerd op weefsels van drie C57BL / 6J vrouwelijke muizen (17 weken oud) van Jackson Laboratories. Titreer alle antilichamen voordat u met het experiment begint om de ideale concentratie te bepalen. Wanneer u compensatiekralen gebruikt voor compensatie in één kleur, zorg er dan voor dat ze net zo helder of helderder kleuren dan uw monsters. Bewaar alle buffers, antilichamen en cellen op ijs of bij 4 °C. Na de toevoeging van levensvatbaarheidskleurstof, voer alle stappen en incubaties uit bij 4 °C bij weinig licht of in het donker.
1. Peritoneale celoogst en eencellige isolatie
- Euthanaseer de muis met CO2 of volgens goedgekeurd protocol.
- Leg de muis op zijn rug, spuit met 70% ethanol en knip de buitenste buikhuid met een schaar, waarbij je voorzichtig bent om het peritoneum niet door te knippen.
- Injecteer 3 ml ijskoude wasbuffer (0,5% runderserumalbumine (BSA) in DPBS [vol/vol]) in de peritoneale holte met een spuit van 3 ml met een naald van 25 gauge.
- Masseer het peritoneum zachtjes met de vingertoppen.
- Herhaal stap 1.3 en 1.4.
- Steek een spuit van 3 ml met een naald van 18 G door het peritoneum, waarbij u voorzichtig bent om organen en vet te vermijden.
- Extraheer de wasbuffer, die nu peritoneale cellen bevat, en breng over naar 15 ml conische buis op ijs.
- Herhaal stap 1.3 en 1.4.
- Knip een klein gaatje in het buikvlies terwijl je het met een pincet omhoog houdt.
- Plaats een wegwerptransferpipet in het gat en verzamel de resterende wasbuffer, waarbij u opnieuw vet en organen vermijdt.
- Breng de verzamelde resterende peritoneale cellen over naar de conische buis van 15 ml op ijs.
OPMERKING: Gooi het monster weg als bloedverontreiniging duidelijk is. - Incubeer de cellen op ijs totdat de milt- en botextractie zijn voltooid.
- Centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Aspirateer de supernatant.
- Resuspend de celkorrel in 1 ml wasbuffer.
- Filtreer de cellen door een celzeef van 70 μM in een schone conische buis van 15 ml op ijs.
- Bepaal de celconcentratie met behulp van een celtellerinstrument of hemocytometer.
2. Miltoogst en eencellige isolatie
- Leg de muis op zijn buik en knip met een schone schaar door het buikvlies aan de linkerkant. Knip de milt uit en verwijder vet en bindweefsel.
- Breng de milt over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml wasbuffer op ijs.
- Incubeer de milt op ijs totdat de botextractie is voltooid.
- Verplaats de milt naar de geautomatiseerde dissociatiebuis met 5 ml rode bloedcellysisbuffer. Plaats de buis op het weefseldissociatorinstrument en dissociëer gedurende 60 s om een enkele celsuspensie te creëren.
OPMERKING: Het is ook toegestaan om andere routinemethoden te gebruiken voor het verkrijgen van miltsuspensies met één cel, zoals het breken tussen matglazen glijden in de wasbuffer. Als een andere methode van dissociatie wordt gebruikt, volg dan de dissociatie met centrifugatie, aspiratie en vervolgens resuspensie in 5 ml lysisbuffer van rode bloedcellen voordat u doorgaat naar stap 2.5. - Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Voeg 10 ml wasbuffer van 4 °C toe met 2mM EDTA.
- Breng over op een schone conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Aspirateer de supernatant.
- Resuspend de celkorrel in 5 ml wasbuffer van 4 °C.
- Filtreer de cellen door een celzeef van 70 μM in een schone conische buis van 15 ml op ijs.
- Bepaal de celconcentratie met behulp van een celtellerinstrument of hemocytometer.
3. BM-oogst en eencellige isolatie
- Verwijder de huid van de onderste helft van het muizenlichaam. Trim de overtollige spier van het been. Verwijder het hele been met een schaar en pas op dat u het dijbeen niet doorknipt. Reinig het dijbeen en scheenbeen door resterende spieren, vet en voeten te verwijderen.
- Breng de botten over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml wasbuffer op ijs.
- Perforeer de bodem van een microcentrifugebuis van 0,5 ml en laat een gat achter dat klein genoeg is om beenbotten niet te laten uitsteken. Plaats de buis van 0,5 ml in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml. Knip het uiteinde van het dijbeen en het scheenbeen proximaal tot aan de knie af en plaats de afgesneden uiteinden naar beneden in de buis van 0,5 ml.
- Centrifugeer de cellen bij 6.780 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Resuspend de celkorrel in 1 ml rode bloedcellysisbuffer en breng over naar een conische buis van 15 ml met een extra 3 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
- Voeg 10 ml wasbuffer van 4 °C toe met 2mM EDTA.
- Centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Aspirateer de supernatant.
- Resuspend de celkorrel in 3 ml wasbuffer van 4 °C.
- Filter cellen door een celzeef van 70 μM in een schone conische buis van 15 ml op ijs.
- Bepaal de celconcentratie met behulp van een celtellerinstrument of hemocytometer.
4. Kleur cellen en bereid compensatie voor
- Aliquot 106 cellen van elk celtype van elk dier tot een 96 put U bodemplaat.
- Zorg ervoor dat u voldoende putten opneemt voor alle monsters en controles, inclusief volledige vlek, fluorescentie-minus-één (FMO), ongekleurd en ten slotte de optionele eenkleurige compensatie voor elke gebruikte fluorofoor.
- Voor het BM-rijpingspaneel en het miltrijpingspaneel, aliquot cellen in 2 putten, 106 cellen per put, voor elk volledig vlekmonster. Voor de eenkleurige compensatie-levensvatbaarheidsbesturingselementen voegt u 2 x 106 cellen van elk celtype toe aan afzonderlijke putten.
- Centrifugeer de plaat bij 845 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovennatuurlijke door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u voorzichtig bent om putten niet te besmetten.
- Resuspend de cellen in 200 μL DPBS (zonder BSA of FBS). Deze stap is belangrijk om eiwitten te verwijderen voordat ze worden gekleurd met amine-reactieve levensvatbaarheidskleurstof.
- Herhaal stap 4.2 en 4.3.
- Herhaal stap 4.2.
- Resuspend de cellen in 100 μL levensvatbaarheid kleurstof verdund 1:1.000 in DPBS.
OPMERKING: Als u cellen gebruikt voor eenkleurige compensatie, voeg dan geen levensvatbaarheidskleurstof toe aan die putten.- Laat voor elke vlekkenset verschillende onbevlekte putten achter voor een volledig onbevlekt monster en eventuele andere controles die u nodig heeft.
- Laat voor elke vlekkenset een extra onbevlekte put achter voor de levensvatbaarheid FMO-controle.
- Voor de eenkleurige levensvatbaarheidscompensatiecontroles: Resuspend de 2 x 106 cellen, aliquoteerd in stap 4.1, in 200 μL verdunde levensvatbaarheidskleurstof. Breng 100 μL cellen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml, verwarm cellen gedurende 5 minuten bij 65 °C en breng de 100 μL warmtegedode cellen terug naar de oorspronkelijke put met de resterende levende cellen van 100 μL.
- Incubeer cellen bij 4 °C, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de plaat bij 845 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovennatuurlijke door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u voorzichtig bent om putten niet te besmetten.
- Resuspend de cellen in 200 μL DPBS (zonder BSA of FBS).
- Herhaal stap 4.8 en 4.9.
- Herhaal stap 4.8.
- Resuspend de cellen in 50 μL Fc-blok verdund 1:50 (eindconcentratie = 10 μg / ml) in vlekbuffer (0,5% BSA in DPBS [vol / vol]).
- Voor peritoneale cellen - voeg ook 5 μL monocytenblokker toe om niet-specifieke kleuring te verminderen.
- Incubeer de cellen bij 4 °C, beschermd tegen licht, gedurende 15 minuten.
- Bereid volledige vlekmastermengsels en FMO's in vlekbuffer voor een eindvolume van 100 μl per 106 cellen. Zie tabel 1-tabel 4 voor de antilichaamlijsten.
OPMERKING: FMO's worden gemaakt door alle antilichamen in een vlekkenset op te nemen, behalve één. Bereid een FMO voor elk antilichaam in een vlekkenset. Wanneer een vlekkenset meerdere briljante kleurstoffen bevat, vervang dan 50 μL briljante vlekbuffer voor vlekbuffer per monster - Zonder het Fc-blok te verwijderen, voegt u 100 μL volledige vlekmengsels en FMO's toe aan geselecteerde putten.
- Bereid eenkleurige compensatiecontroles voor elk antilichaam in een vlekkenset voor.
- Volg bij gebruik van compensatiekralen de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
- Voeg bij gebruik van cellen getitreerde antilichamen toe aan 106 cellen, eerder gereserveerd in stap 4.6.1 zonder levensvatbaarheidskleurstof, in vlekbuffer van 100 μL. Als alle cellen in het monster positief zijn voor een bepaalde marker, zet dan niet-gekleurde cellen opzij om te worden gebruikt bij het verkrijgen van compensatiegegevens op de flowcytometer.
- Incubeer de cellen en kralen bij 4 °C, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de plaat bij 845 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovennatuurlijke door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u voorzichtig bent om putten niet te besmetten.
- Resuspend de cellen en kralen in 200 μL vlekbuffer.
- Herhaal stap 4.18 en 4.19 twee keer.
- Herhaal stap 4.18.
- Om de monsters binnen 48 uur voor analyse te fixeren, resuspend cellen en kralen in 200 μL 2% paraformaldehyde in DPBS.
LET OP: Parafomaldehyde is een ernstig gevaar voor de gezondheid en ontvlambaar. Raadpleeg voor gebruik het Safty-gegevensblad. - Incubeer de cellen en kralen bij 4 °C, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten.
- Herhaal stap 4.18 en 4.19 twee keer.
- Plaats een filterplaat over een schone 96 well U-bodemplaat. Breng met behulp van een multipipet elk monster over naar een put van de filterplaat.
- Centrifugeer de filterplaat-96 put U-bodemplaatopstelling op 845 x g gedurende 2 min bij 4 °C. Verwijder de filterplaat en decanteer het supernatant door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u voorzichtig bent om putten niet te vervuilen.
- Voor de BM en miltrijping panelen resuspend de volledig gekleurde cellen in 100 μL vlekbuffer. Combineer de 2 putjes voor elk dier in 1 put. Resuspend de resterende panelen, FMO's en controles in 200 μL vlekbuffer.
- Incubeer vaste cellen en kralen bij 4 °C, beschermd tegen licht, 's nachts.
5. Flowcytometrische data-acquisitie
- Initialiseer en QC de flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant.
- Laad de sjabloon die specifiek is voor elk deelvenster.
- Voordat u gegevens registreert, moet u ervoor zorgen dat alle gebeurtenissen voor elk monster op schaal zijn en zichtbaar zijn op de puntplots.
- Registreer compensatiecontroles voor elk vlekpaneel met behulp van enkele vlekcompensaties die zijn voorbereid in stap 4.16. Stel positieve en negatieve poorten in voor elk monster. Laat de software de compensatiematrix berekenen.
- Begin met het verkrijgen van het eerste monster en zorg ervoor dat de poorten op de juiste manier zijn ingesteld.
- Stel de machine in op het registreren van ten minste 50.000 B-celgebeurtenissen voor het peritoneale B-celpaneel en het milt Igκ- en Igλ-paneel; 150.000 B celgebeurtenissen voor het BM-rijpingspaneel; en 300.000 B-celgebeurtenissen voor het miltrijpingspaneel.
- Voer voor elk vlekpaneel de volledig gekleurde monsters voor elk dier, een onbevlekt monster en de FMO's uit en noteer deze.
6. Gegevens analyseren
- Ga verder met gegevensanalyse met behulp van flowcytometrie-analysesoftware. Volg gatingstrategieën beschreven in figuur 1, figuur 2, figuur 3, figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we de gating-strategie voor het karakteriseren van B-celontwikkeling in muisperitoneum, BM en milt. De basis van de analyse wordt gevormd rond het concept van kleuring met levensvatbaarheidskleurstof, vervolgens het uitzetten van doubletten op basis van de Forward-Scatter-Area (FSC-A) en Forward-Scatter-Height (FSC-H), en ten slotte het uitzetten van puin door cellen te selecteren op basis van hun FSC-A en Side-Scatter-Area (SSC-A) kenmerken, hier aangeduid als de size gate, die een weerspiegeling zijn van relatieve celgrootte en celkorreligheid, voordat gating op populatie van belang.
Flowcytometrische analyse van peritoneale B-cellen toont de frequenties van levensvatbare peritoneale cellen, totale B-cellen, B-1- en B-2-subsets, evenals B-1a- en B-1b-cellen in C57BL / 6J-muizen (figuur 1), met behulp van een kleuringspaneel beschreven in tabel 1. Het gemiddelde absolute celaantal van deze frequenties is weergegeven in tabel 5. Verstoringen in B-1-cellen kunnen worden afgebakend door de verdeling van celsubsets, hetzij door celfrequentie of absoluut aantal cellen per muis.
Flowcytometrische analyse van BM B-cellen toont de frequenties van levensvatbare BM-cellen, totale B-cellen, Fractie A (pre-pro-B-cellen en contaminerende lymfocyten), pre-pro-B-cellen, Fractie B, Fractie C', Fractie D, onrijp (subset in Fractie E), overgangscellen (subset in Fractie E) en Fractie F B-cellen in C57BL/6J-muizen (figuur 2), met behulp van een kleuringspaneel in tabel 2. Het gemiddelde absolute celaantal van deze frequenties is weergegeven in tabel 6. Verstoringen in BM B-cellen kunnen worden afgebakend door de verdeling van celsubsets, hetzij door celfrequentie of door het absolute aantal cellen per been(en).
Flowcytometrische analyse van milt B-cellen toont de frequenties van levensvatbare miltcellen, totale B-cellen, overgangs-B-cellen, T1, T2, T3-cellen, volwassen B-cellen, folliculaire I-cellen (Fol I), folliculaire II (Fol II) cellen, marginale zone (MZ) voorlopercellen, volwassen MZ-cellen en B-1-cellen in C57BL / 6J-muizen (figuur 3), met behulp van een kleuringspaneel beschreven in tabel 3. Het gemiddelde absolute celaantal van deze frequenties is weergegeven in tabel 7. Verstoringen in milt B-cellen kunnen worden afgebakend door de verdeling van celsubsets, hetzij door celfrequentie of absoluut aantal cellen per milt.
Evenzo toont flowcytometrische analyse van de milt de frequenties van Igκ+ en Igλ+ B-cellen in C57BL/6J-muizen (figuur 4), met behulp van een kleuringspaneel dat wordt beschreven in tabel 4. Het gemiddelde absolute celaantal van deze frequenties is weergegeven in tabel 8. Verstoringen in Igκ+ en Igλ+ Bcells kunnen worden afgebakend door de verdeling van celsubsets, hetzij door celfrequentie of absoluut aantal cellen per milt.
| Antistof | Fluorofoor | kloon |
| cd19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | Ra3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| cd43 | Fitc | S7 |
| cd23 | Buv395 | B3B4 |
| cd11b | Bv711 | M1/70 |
| cd5 | Bv605 | 53-7.3 |
Tabel 1: Peritoneaal B-celpaneel
| Antistof | Fluorofoor | kloon |
| cd19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | Ra3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| cd43 | Fitc | 1b11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-F1 |
| C-kit | Buv395 | 2b8 |
| BP-1 | Bv786 | BP-1 |
| cd93 | Bv711 | AA4,1 |
| dump kanaal | ||
| cd3 | Af700 | 17-A2 |
| cd11b | Af700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | Af700 | RB6-8C5 |
| Ter119 | Af700 | TER-119 |
Tabel 2: Beenmergrijpingspaneel
| Antistof | Fluorofoor | kloon |
| cd19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | Ra3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| cd43 | Fitc | S7 |
| cd23 | Buv395 | B3B4 |
| cd21/35 | Bv421 | 7g6 |
| cd11b | Af700 | M1/70 |
| cd5 | Bv605 | 53-7.3 |
| cd93 | PE | AA4,1 |
Tabel 3: Miltrijpingspaneel
| Antistof | Fluorofoor | kloon |
| cd19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | Ra3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| cd3 | Pb | 17-A2 |
| Kappa | Fitc | 187.1 |
| Lambda | PE | RML-42 |
Tabel 4: Milt Igκ en Igλ Paneel
Figuur 1: Karakterisering van B-celpopulaties in het peritoneum. Levensvatbare, eencellige, grootte gated peritoneale B-cellen worden eerst gescheiden van contaminerende cellen door gating op IgM + -cellen. B-1- en B-2-cellen worden dan van elkaar onderscheiden door afwezigheid (B-1) of aanwezigheid van CD23 (B-2). Volgende CD5-expressie wordt gebruikt om B-1a-cellen (CD5+) af te bakenen van B-1b-cellen (CD5-). FMO's werden gebruikt om empirisch te bepalen waar poorten moesten worden getrokken. Getallen zijn percentages van elke populatie binnen dezelfde dichtheidsplot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van B-celsubsets in de BM. Levensvatbare, single cell, size gated BM B-cellen worden gescheiden van niet-B-cellen door gating op B220+ dump- (waarbij dump verwijst naar CD3/GR-1/CD11b/TER119) cellen. CD43 en B220 expressie definieert verder Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) en Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++). Fractie A-C' wordt verder gescheiden door expressie van BP-1 en CD24. Fractie A (BP-1- CD24-) komt overeen met pre-pro-B cellen samen met contaminerende cellen. Om pre-pro-B-cellen te scheiden van contaminerende cellen in fractie A, worden de expressie van CD93 en de afwezigheid van CD19 gebruikt. Fractie B (BP-1- CD24int) en Fractie C (BP-1+ CD24int) komen respectievelijk overeen met vroege en late pro-B cellen, en Fractie C' (BP-1+/- CD24+) komt overeen met vroege pre-B cellen. Om fractie D-F te scheiden, wordt expressie van IgM en IgD gebruikt. Fractie D komt overeen met late pre-B cellen (IgM-/lage IgD-); Fractie E (blauwe poort, IgMint/hoge IgD-) naar zowel onrijpe (Imm, IgMint IgD-) als overgangscellen (Tran, IgMhigh IgD-) B-cellen; en Fractie F (IgMint/hoog IgD+) naar recirculerende volwassen B-cellen. FMO's werden gebruikt om empirisch te bepalen waar poorten moesten worden getrokken. Getallen zijn percentages van elke populatie binnen dezelfde dichtheidsplot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van milt B-celrijping. Levensvatbare, eencellige, grootte gated milt B-cellen worden gescheiden van niet-B-cellen door gating op B220 + cellen. Om de B-1-subset te identificeren, worden CD23- CD19+ cellen geïdentificeerd en gedefinieerd door expressie van CD43. Om B-2 populaties te classificeren, worden CD19+ cellen gescheiden in overgangscellen (CD93+ B220+) en volwassen (CD93- B220+). Overgangscellen (CD93+ B220+) worden verder onderverdeeld in T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) en T3 (IgMint CD23+) populaties. Volwassen (CD93- B220+) cellen worden gescheiden in marginale zone (CD21/35+ IgM+) en folliculaire (CD21/35int IgMint/+) B-cellen. De expressie van CD23 wordt verder gebruikt om MZ precursor (CD23+ B220+) cellen te scheiden van meer volwassen MZ (CD23- B220+) cellen. Folliculaire populaties worden vervolgens afgebakend in Fol I (IgD+ IgMint) en Fol II (IgD+ IgM+) cellen. FMO's werden gebruikt om empirisch te bepalen waar poorten moesten worden getrokken. Getallen zijn percentages van elke populatie binnen dezelfde dichtheid plot Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Igκ- en Igλ-expressie van milt B-cellen. Levensvatbare, eencellige, grootte gated milt B-cellen worden gescheiden van niet-B-cellen door gating op B220+ CD3-cellen. B-cellen onderscheiden zich dan door de uitdrukking van Igλ en Igκ. Getallen zijn percentages van elke populatie binnen dezelfde dichtheidsplot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Absoluut celnummer | |||||
| Dier nummer | Levensvatbare peritoneale cellen | B-cellen | B-1a cellen | B-1b cellen | B-2 cellen |
| 1 | 1,02E+07 | 4,67E+06 | 1,28E+06 | 8,95E+05 | 2,35E+06 |
| 2 | 9,92E+06 | 4,52E+06 | 1,49E+06 | 9,60E+05 | 1,91E+06 |
| 3 | 1,15e+07 | 4,56E+06 | 1,71E+06 | 9,19E+05 | 1,78E+06 |
| Gemiddeld | 1,05E+07 | 4,58E+06 | 1,49E+06 | 9,25E+05 | 2,01E+06 |
Tabel 5: Absolute celaantallen van peritoneale B-celsubsets
| Absoluut celnummer | |||||||||||
| Dier nummer | Levensvatbare beenmergcellen | B-cellen | Fractie A | Pre-pro | Fractie B | Fractie C | Breuk C' | Fractie D | Onvolwassen | Overgangs | Breuk F |
| 1 | 5,05E+07 | 9,70E+06 | 1,13E+06 | 1,95E+05 | 2,22E+05 | 9,14E+04 | 6,31E+05 | 1,59E+06 | 4,56E+05 | 7,81E+05 | 4,03E+06 |
| 2 | 5,39E+07 | 1,03E+07 | 1,14E+06 | 2,29E+05 | 2,89E+05 | 1,22E+05 | 8,40E+05 | 2,11E+06 | 5,39e+05 | 8,07e+05 | 3,67E+06 |
| 3 | 5,93E+07 | 1,01E+07 | 1,10e+06 | 2,12E+05 | 2,84E+05 | 1,05E+05 | 9,02E+05 | 2,72E+06 | 5,94E+05 | 7,62E+05 | 2,59e+06 |
| Gemiddeld | 5,46E+07 | 1,00E+07 | 1,12E+06 | 2,12E+05 | 2,65E+05 | 1,06E+05 | 7,91E+05 | 2,14E+06 | 5,29E+05 | 7,83E+05 | 3,43E+06 |
Tabel 6: Absolute celaantallen van beenmerg B-celsubsets
| Absoluut celnummer | ||||||||||||
| Dier nummer | Levensvatbare miltcellen | B-cellen | Overgangscellen B | T1-cellen | T2-cellen | T3-cellen | Volwassen B-cellen | Folliculaire I-cellen | Folliculaire II-cellen | Voorloper marginale zone cellen | Volwassen marginale zonecellen | B-1 cellen |
| 1 | 9,16E+07 | 4,61E+07 | 3,66E+06 | 1,55E+06 | 1,10e+06 | 7,16e+05 | 4,06e+07 | 2,39e+07 | 5,27E+06 | 2,17e+06 | 3,98e+06 | 8,83E+05 |
| 2 | 9,97E+07 | 5,18e+07 | 4,88e+06 | 1,97E+06 | 1,57E+06 | 1,00E+06 | 4,49E+07 | 2,68e+07 | 7,33E+06 | 3,42E+06 | 3,84E+06 | 8,15E+05 |
| 3 | 1,02E+08 | 5,34e+07 | 4,64E+06 | 1,98E+06 | 1,41E+06 | 8,54E+05 | 4,62E+07 | 2,81E+07 | 5,84E+06 | 3,58E+06 | 4,02E+06 | 1,01E+06 |
| Gemiddeld | 9,77E+07 | 5,04E+07 | 4,39e+06 | 1,83E+06 | 1,36e+06 | 8,58E+05 | 4,39e+07 | 2,63E+07 | 6,15E+06 | 3,06E+06 | 3,94E+06 | 9,02E+05 |
Tabel 7: Absolute celaantallen van milt-B-celsubsets
| Absoluut celnummer | ||||
| Dier nummer | Levensvatbare miltcellen | B-cellen | Igκ+ B-cellen | Igλ+ B-cellen |
| 1 | 9,16E+07 | 4,97E+07 | 4,51E+07 | 2,46E+06 |
| 2 | 9,97E+07 | 5,63E+07 | 5,08E+07 | 3,16e+06 |
| 3 | 1,02E+08 | 5,91E+07 | 5,33E+07 | 3,24E+06 |
| Gemiddeld | 9,77E+07 | 5,50E+07 | 4,97E+07 | 2,95E+06 |
Tabel 8: Absolute celaantallen van Igκ- en Igλ B-celsubsets
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flowcytometrische analyse van lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels heeft sinds de jaren 1980 gelijktijdige identificatie en opsomming van B-celsubpopulaties bij muizen en mensen mogelijk gemaakt. Het is gebruikt als een maat voor humorale immuniteit en kan verder worden toegepast om de functionaliteit van de B-cel te evalueren. Deze methode maakt gebruik van de beschikbaarheid van reagens om verschillende stadia van B-celrijping bij muizen en mensen te beoordelen, door middel van gelijktijdige analyse van meerdere parameters die de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk maken, zelfs in zeldzame populaties. Als het wordt gebruikt om complexe heterogene monsters te meten, kan het subpopulaties binnen enkele minuten detecteren, op individuele cellen33. Sequentiële gating-analysestrategie, meestal toegepast op flowcytometrische analyse, kan eenvoudig en intuïtief zijn wanneer een specifieke populatie moet worden geïdentificeerd34. Ten slotte is een ander voordeel van flowcytometrie dat het gemakkelijk kan worden aangepast in de meeste academische laboratoria, terwijl het onder begeleiding staat van ervaren gebruikers. Ons protocol beschrijft met succes de beoordeling van B-celpopulaties in het peritoneum, BM en milt van muizen, door B-1-populaties te beschrijven en op te sommen en zich te verdiepen in de ontwikkeling van B-2 pro-B-cellen, pre-B-cellen, onrijpe, overgangs- en volwassen B-cellen, evenals hun oppervlakte-expressie van Igκ- of Igλ-lichte ketens. Flowcytometrie is de meest gebruikte en gemakkelijkste methode om toe te passen bij het onderzoeken van de ontwikkeling van B-cellen bij muizen.
Hoewel flowcytometrie waardevolle gegevens genereert, zijn er enkele grenzen aan deze technologie wanneer deze wordt gebruikt om de heterogeniteit van het immuun B-celcompartiment te onderzoeken. Enorme datasets kunnen overweldigend zijn omdat 10 kleurkleuring de herkenning van meer dan 1.024 verschillende celpopulaties mogelijk maakt34. Men moet er rekening mee houden dat sommige veelgebruikte lymfoïde celmarkers minder specifiek zijn gebleken dan oorspronkelijk werd gedacht. Dit kan worden opgelost door een veelheid aan celoppervlakmarkers te gebruiken om de gating op gewenste populaties vast te stellen. Hoewel flowcytometrische analyse eenvoudig en intuïtief kan zijn, is een andere beperking voor flowcytometrische analyse dat het meestal de visualisatie van slechts twee parameters tegelijk mogelijk maakt, hoewel datavisualisatietools zoals t-SNE kunnen worden gebruikt om celpopulaties efficiënter te clusteren bij gebruik van flowcytometrie met hoge parameters. Een andere belangrijke beperking is dat de poorten die worden gebruikt tijdens zowel de acquisitie als de analyse soms afhankelijk zijn van de subjectiviteit van de operator.
Voor een succesvolle aanpassing of replicatie van dit protocol zijn er verschillende kritische parameters waarmee rekening moet worden gehouden35. Zorgvuldige overweging moet worden genomen bij het ontwerp van het paneel en de selectie van fluorochroom. Het is noodzakelijk om zwakke of belangrijke antigenen te koppelen aan heldere fluorochchromen. Antilichaamtitratie moet worden uitgevoerd om te voorkomen dat overtollige antilichaambinding aan cellen niet-specifiek is, waardoor de achtergrondkleuring mogelijk toeneemt en de resolutie afneemt. Antilichaamtitratie wordt uitgevoerd door een bekend aantal cellen te kleuren met afnemende concentraties antilichamen, om de beste scheidingsindex te bepalen36. Dit moet worden herhaald voor elke partij antilichaam. Tijdens de monstervoorbereiding en kleuring is het belangrijk om een suspensie met één cel te garanderen door Ca ++ en Mg ++ te vermijden. Bovendien kan toevoeging van EDTA helpen bij het voorkomen van celaggregatie en enzymatische activiteit, wat kan leiden tot antilichaamgemedieerde stimilulatie en internalisatie van gelabelde markers. Voorafgaand aan gegevensverzameling moeten monsters op de juiste manier worden gesuspendeerd, gefilterd en vrij van aggregaten. Spillover van signaal van de ene parameter naar de andere wordt opgelost door compensatiecontroles te gebruiken, in de vorm van enkele gekleurde cellen of commercieel beschikbare compensatieparels35. Een andere belangrijke overweging is om in elk experiment de juiste controles te hebben. Niet-gekleurde cellen bepalen de basislijn van autofluorescentie. Isotypecontroles worden niet langer beschouwd als geschikte controles voor gating vanwege niet-specifieke binding. De belangrijkste stap in het helpen maken van nauwkeurige poorten is het gebruik van FMO-bedieningselementen. In een FMO-controle zijn alle geconjugeerde antilichamen aanwezig in de vlek, behalve degene waarvoor wordt gecontroleerd. FMO-regelaars maken het mogelijk om de verspreiding van alle fluoroforen in het ontbrekende kanaal te meten en maken het dus mogelijk om poorten dienovereenkomstig in te stellen. Het is van cruciaal belang dat er voldoende cellen worden verkregen voor extra nauwkeurigheid. Als vuistregel moeten ten minste 2.000 gebeurtenissen van de bevolking van belang worden verzameld. Ten slotte moeten compensatiecontroles, of het nu kralen of cellen zijn, exact worden afgestemd op de fluorchromen die worden gebruikt en moeten de controles minstens zo helder zijn als de experimentele monsters37.
Over het algemeen wordt lage cytometrische analyse van B-celcompartimenten veel gebruikt op het gebied van immunologie. Deze techniek kan worden gebruikt om verstoringen in humorale immuniteit te onderzoeken bij zowel wilde als genetisch gemodificeerde muizen, onder niet-ziektetoestanden en bij immunologische uitdaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
We danken Matthew Sleeman voor het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken ook de afdelingen Vivarium Operations en Flow Cytometry Core van Regeneron voor het ondersteunen van dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H.
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S.
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M.
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S.
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K.
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P.
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B.
