Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu
Summary
Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.
Abstract
Kapsamlı çalışmalar, ikincil lenfoid organlarda murine B hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını karakterize ederek karakterizedir. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar izole edilmiş ve köklü terapötikler haline geliştirilmiştir. Murine B hücre gelişiminin, otoimmün eğilimli fareler bağlamında veya değiştirilmiş bağışıklık sistemine sahip farelerde doğrulanması, farelerde terapötik ajanlar geliştirmenin veya test etmenin önemli bir bileşenidir ve akış sitometrisinin uygun bir kullanımıdır. İyi kurulmuş B hücre akışı sitometrik parametreleri, murine periton, kemik iliği ve dalaktaki B hücre gelişimini değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bir dizi en iyi uygulamaya uyulmalıdır. Ek olarak, B hücre bölmelerinin akış sitometrik analizi de B hücre gelişiminin ek okumalarını tamamlamalıdır. Bu teknik kullanılarak üretilen veriler, vahşi tip, otoimmün eğilimli fare modelleri ve terapötik olarak antikor veya antikor benzeri moleküller üretmek için kullanılabilecek insanlaştırılmış fareler anlayışımızı daha da ileriye getirebilir.
Introduction
Monoklonal antikorlar, ana akım tıbbın bir parçası haline geldikçe birçok insan hastalığı için giderek daha fazla tercih tedavisi haline gelmiştir1,2. Daha önce, fare IgH sabitleri3,4 ile tamamen insan değişken bölgelerini barındıran antikorları verimli bir şekilde üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık. Son zamanlarda, farklı antijen bağlayıcısı olan antikor benzeri moleküller üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık5. Antikorlar B hücreleri tarafından salgılanır ve uyarlanabilir humoral bağışıklığın temelini oluşturur. B-1 ve B-2 olmak üzere iki farklı tip B hücresi vardır. Memelilerde B-1 hücreleri fetal karaciğerden kaynaklanır ve doğumdan sonra mukozal dokular ile plevral ve periton boşluklarında zenginleştirilirken, B-2 hücreleri doğumdan önce fetal karaciğerden ve daha sonra kemik iliğinde (BM) kaynaklanır. B-2 hücreleri dalak ve kan dahil sekonder lenfoid organlarda zenginleştirilir6,7,8. BM’de, B-2 hematopoetik progenitörler, Ig mu ağır zincir yeniden düzenlemesinin başlatılması üzerine B yanlısı hücrelere farklılaşmaya başlar9,10. Ig ağır zincirinin ve montajının B öncesi hücre reseptörüne (BCR öncesi) başarılı bir şekilde yeniden düzenlenmesi, sinyalizasyon ve proliferatif genişleme ile birlikte B öncesi hücrelere farklılaşmaya yol açar. B öncesi hücreler Ig kappalarını (Igφ) yeniden düzenledikten sonra veya verimsizse, Ig lambda (Igφ) ışık zincirleri, ağır μ zincirle eşleşerek yüzey IgM BCR ekspresyozunu elde ederler. IgM yüzey ekspresyonunun otoreaktivite koşullarında azaldığının bilindiğini, böylece fonksiyonel olarak yanıt vermeyen veya anjik B hücrelerinde kendine toleransa katkıda bulunduğunu belirtmek önemlidir11,12. Olgunlaşmamış B hücreleri daha sonra IgD’yi birlikte ifade etmeye ve BM’den dalağa göç etmeye başladıkları bir geçiş aşamasına girerler. Dalakta, IgD ekspresyasyonu daha da artar ve hücreler geçiş B hücrelerinin ikinci aşamasına olgunlaşır, ardından olgunlaşma durumlarının ve gelişimlerinin marjinal bölge (MZ) veya foliküler (Fol) hücrelere tamamlanması13,14,15. Yetişkin farelerde, hastalıklı olmayan bir ortamda, BM’de günlük 10-20 milyon olgunlaşmamış B hücresi üretilmesine rağmen olgun B hücrelerinin sayısı sabit kalır. Bunlardan sadece yüzde üçü olgun B hücrelerinin havuzuna girer. Periferik B hücre bölmesinin büyüklüğü, kısmen kendi kendine reaktivite ve eksik olgunlaşma dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle hücre ölümü ile kısıtlanır16,17,18. Akış sitometrik analizi, insanlarda ve farelerde birçok bağışıklık hücresi alt bölmesini karakterize etmek ve numaralandırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. İnsan ve murine B hücre bölmeleri arasında bazı benzerlikler olsa da, bu protokol sadece murine B hücrelerinin analizi için geçerlidir. Bu protokol, genetik manipülasyonun B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir. Akış sitometrisi, hücre aktivasyonu, fonksiyon, çoğalma, döngü analizi, DNA içerik analizi, apoptoz ve hücre sıralama 19,20’yi ölçmek de dahil olmak üzere birçok ek uygulamada çok popüler olmuştur.
Akış sitometrisi, dalak, BM ve kan gibi karmaşık organlar da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda çeşitli lenfosit bölmelerini karakterize etmek için tercih edilen araçtır. Akış sitometrisi için yaygın olarak bulunan fareye özgü antikor reaktifleri nedeniyle, bu teknik sadece hücre yüzey proteinlerini değil, aynı zamanda hücre içi fosfoproteinleri ve sitokinleri ve fonksiyonel okumaları araştırmak için de kullanılabilir21. Burada, akış sitometri reaktiflerinin ikincil lenfoid organlarda olgunlaştıkça ve farklılaştıkça B hücreleri alt kümelerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Boyama koşullarının optimizasyonu, numune işleme, doğru cihaz kurulumu ve veri toplama ve son olarak veri analizinden sonra, farelerdeki B hücre bölmesinin kapsamlı akış sitometrik analizi için bir protokol kullanılabilir. Bu tür kapsamlı analizler, Gelişmekte olan BM B-2 hücrelerinin B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ve IgD22 ifadelerine bağlı olarak farklı fraksiyonlara (Fraksiyon) ayrılabileceği Hardy ve meslektaşları tarafından tasarlanan onlarca yıllık bir isimlendirmeye dayanmaktadır. Hardy ve ark., B220+ CD43 BM B hücrelerinin BP-1 ve CD24 (30F1) ekspresyerine dayanarak dört alt kümeye (Fraksiyon A-C’) bölünebileceğini, B220+ CD43-(sönük ila neg) BM B hücrelerinin igd ve yüzey IgM23’ün farklı ifadesine dayanarak üç alt kümeye (Fraksiyon D-F) çözülebileceğini göstermiştir. Kesir A (B öncesi hücreler) BP-1– CD24 (30F1)–, Kesir B (erken B öncesi hücreler) BP-1– CD24 (30F1)+, Fraksiyon C (geç pro-B hücreleri) BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraksiyon C’ (erken B öncesi hücreler) ise BP-1+ ve CD24high olarak tanımlanır. Ayrıca, Kesir D (B öncesi hücreler) B220+ CD43– IgM– B hücreleri, Kesir E (yeni oluşturulan B hücreleri, olgunlaşmamış ve geçiş kombinasyonu) B220+ CD43– IgM+ B hücreleri ve Fraksiyon F (olgun, yaslanan B hücreleri) B220high CD43– IgM+ B hücreleri olarak tanımlanır. Buna karşılık dalakta bulunan naif B hücrelerinin çoğunluğu CD93, CD23 ve IgM ekspresyonuna bağlı olarak olgun (B220+ CD93–) B hücrelerine ve geçiş (T1, T2, T3) hücrelere ayrılabilir. Olgun B hücreleri, IgM ve CD21/CD35 ekspresyonuna göre marjinal bölge ve foliküler alt kümelere çözülebilir ve foliküler alt kümeler, IgM ve IgD yüzey ekspresyonlarının seviyesine bağlı olarak olgun foliküler tip I ve foliküler tip II B hücre alt kümelerine ayrılabilir24. Bu dalak B hücre popülasyonları ağırlıklı olarak Igφ ışık zincirini ifade eder. Son olarak, fetal karaciğerden kaynaklanan ve esas olarak yetişkin farelerin periton ve plevral boşluklarında bulunan B-1 B hücre popülasyonları literatürde tanımlanmıştır. Bu periton B hücreleri, CD23 ekspresyonu eksikliği ile daha önce tanımlanmış B-2 B hücrelerinden ayırt edilebilir. Daha sonra B-1a veya B-1b popülasyonlarına ayrılırlar, birincisi CD5’in varlığı ve ikincisi yokluğu25 ile tanımlanır. B-1 hücreli atalar fetal karaciğerde bol miktarda bulunur, ancak yetişkin BM’de bulunmaz. B-1a ve B-1b hücreleri farklı progenitörlerden kaynaklanırken, her ikisi de periton ve plevral boşlukları tohumlar24. B-2 hücrelerinin aksine, B-1 hücreleri benzersiz bir şekilde kendini yenileyebilir ve doğal IgM antikorlarının üretiminden sorumludur.
B hücre gelişimindeki kusurlar, BCR26,27 bileşenlerindeki eksiklikler, BCR sinyal gücünü etkileyen sinyal moleküllerinin pertürbasyonları14,28,29 veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulması dahil olmak üzere birçok durumda ortaya çıkabilir30,31 . Lenfoid bölmelerin akış sitometri analizi, bu farelerde ve diğer birçok kişide B hücre gelişim bloklarının karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. Lenfoid bölmelerin akış sitometrik analizinin bir avantajı, canlı ayrışmış dokudan elde edilen tek tek hücreler üzerinde ölçüm yapma yeteneği sunmasıdır. Reaktiflerin sürekli genişleyen bir florofor aralığında bulunması, birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, B hücrelerinin akış sitometrik analizi ile numaralandırılması, lenfoid organlarda hücre lokalizasyonunu görselleştiren immünhistokimya yöntemleri, dolaşımdaki antikor seviyelerinin humoral bağışıklık ölçüsü olarak tespiti ve B hücre yanıtlarını gerçek uzay ve zamanda ölçmek için iki foton mikroskopisi gibi diğer immünolojik tahlilleri tamamlar32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lenfoid ve lenfoid olmayan dokuların akış sitometrik analizi, 1980’lerden beri farelerde ve insanlarda B hücre alt popülasyonlarının eşzamanlı tanımlanmasını ve numaralandırmasını sağlamıştır. Mizahi bağışıklığın bir ölçüsü olarak kullanılmıştır ve B hücre işlevselliğini değerlendirmek için daha fazla uygulanabilir. Bu yöntem, nadir popülasyonlarda bile B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlayan birden fazla parametrenin eşzamanlı analizi yoluyla farelerde ve insa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Matthew Sleeman’a makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Regeneron’daki Vivarium Operations and Flow Cytometry Core bölümlerine de bu araştırmayı desteklediğimiz için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
