Summary
Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.
Abstract
Umfangreiche Studien haben die Entwicklung und Differenzierung von murinen B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen charakterisiert. Antikörper, die von B-Zellen sezerniert werden, wurden isoliert und zu etablierten Therapeutika weiterentwickelt. Die Validierung der Entwicklung von murinen B-Zellen im Zusammenhang mit autoimmunanfälligen Mäusen oder bei Mäusen mit verändertem Immunsystem ist ein entscheidender Bestandteil der Entwicklung oder Erprobung von Therapeutika bei Mäusen und eine geeignete Anwendung der Durchflusszytometrie. Gut etablierte zytometrische Parameter des B-Zell-Flusses können verwendet werden, um die B-Zell-Entwicklung im murinen Peritoneum, Knochenmark und Milz zu bewerten, aber eine Reihe von Best Practices müssen eingehalten werden. Darüber hinaus sollte die durchflusszytometrische Analyse von B-Zell-Kompartimenten auch zusätzliche Ablesungen der B-Zell-Entwicklung ergänzen. Daten, die mit dieser Technik generiert werden, können unser Verständnis von wildtypischen, autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen verbessern, die zur Erzeugung von Antikörpern oder antikörperähnlichen Molekülen als Therapeutika verwendet werden können.
Introduction
Monoklonale Antikörper sind zunehmend zur bevorzugten Therapie für viele menschliche Krankheiten geworden, da sie Teil der Schulmedizin werden1,2. Wir haben zuvor gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die effizient Antikörper produzieren, die vollständig menschliche variable Regionen mit Maus-IgH-Konstanten beherbergen3,4. Zuletzt haben wir gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die antikörperähnliche Moleküle produzieren, die eine ausgeprägte Antigenbindung aufweisen5. Antikörper werden von B-Zellen sezerniert und bilden die Grundlage der adaptiven humoralen Immunität. Es gibt zwei verschiedene Arten von B-Zellen, B-1 und B-2. Bei Säugetieren stammen B-1-Zellen aus der fetalen Leber und sind nach der Geburt im Schleimhautgewebe und in der Pleura- und Peritonealhöhle angereichert, während B-2-Zellen vor der Geburt in der fetalen Leber und danach im Knochenmark (BM) entstehen. B-2-Zellen sind in sekundären lymphatischen Organen einschließlich Milz und Blut angereichert6,7,8. In der BM beginnen B-2 hämatopoetische Vorläuferzellen mit der Initiierung der Ig mu schweren Kettenumlagerung zu Pro-B-Zellen zu differenzieren9,10. Die erfolgreiche Umlagerung der schweren Ig-Kette und ihre Montage in den Prä-B-Zell-Rezeptor (Pre-BCR) führt zusammen mit der Signalgebung und proliferativen Expansion zu einer Differenzierung zu Prä-B-Zellen. Nachdem Prä-B-Zellen ihre Ig kappa (Igκ) oder, wenn unproduktiv, Ig lambda (Igλ) leichten Ketten neu angeordnet haben, paaren sie sich mit μ schweren Kette, was zu einer Oberflächen-IgM-BCR-Expression führt. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass bekannt ist, dass die IgM-Oberflächenexpression unter Bedingungen der Autoreaktivität reduziert wird, was zur Selbsttoleranz in funktionell nicht reagierenden oder anergen B-Zellen beiträgt11,12. Unreife B-Zellen treten dann in ein Übergangsstadium ein, in dem sie beginnen, IgD mitzuexprimieren und vom BM in die Milz zu wandern. In der Milz nimmt die IgD-Expression weiter zu und die Zellen reifen zu einem zweiten Stadium von Übergangs-B-Zellen heran, gefolgt von der Vollendung ihres Reifungsstatus und der Entwicklung zu entweder marginalen Zonen( MZ) oder follikulären (Fol) Zellen13,14,15. Bei erwachsenen Mäusen bleibt die Anzahl der reifen B-Zellen in einer nicht erkrankten Umgebung konstant, obwohl täglich 10-20 Millionen unreife B-Zellen im BM erzeugt werden. Davon gelangen nur drei Prozent in den Pool der reifen B-Zellen. Die Größe des peripheren B-Zell-Kompartiments wird durch den Zelltod eingeschränkt, was zum Teil auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter Selbstreaktivität und unvollständige Reifung16,17,18. Die durchflusszytometrische Analyse wurde umfassend eingesetzt, um viele Immunzellunterkompartimente bei Menschen und Mäusen zu charakterisieren und aufzuzählen. Während es einige Ähnlichkeiten zwischen menschlichen und murinen B-Zell-Kompartimenten gibt, gilt dieses Protokoll nur für die Analyse von murinen B-Zellen. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren, um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zellentwicklung verändern würde. Die Durchflusszytometrie ist auch in vielen weiteren Anwendungen sehr beliebt, darunter bei der Messung von Zellaktivierung, Funktion, Proliferation, Zyklusanalyse, DNA-Gehaltsanalyse, Apoptose und Zellsortierung 19,20.
Die Durchflusszytometrie ist das Werkzeug der Wahl, um verschiedene Lymphozytenkompartimente bei Mäusen und Menschen zu charakterisieren, einschließlich komplexer Organe wie Milz, BM und Blut. Aufgrund der weit verbreiteten mausspezifischen Antikörperreagenzien für die Durchflusszytometrie kann mit dieser Technik nicht nur Zelloberflächenproteine, sondern auch intrazelluläre Phosphoproteine und Zytokine sowie funktionelle Auslesungen untersucht werden21. Hierin zeigen wir, wie Durchflusszytometrie-Reagenzien verwendet werden können, um B-Zell-Untergruppen zu identifizieren, wenn sie in sekundären lymphatischen Organen reifen und differenzieren. Nach der Optimierung der Färbebedingungen, der Probenhandhabung, der korrekten Geräteeinrichtung und Datenerfassung und schließlich der Datenanalyse kann ein Protokoll für die umfassende durchflusszytometrische Analyse des B-Zell-Kompartiments bei Mäusen verwendet werden. Eine solche umfassende Analyse basiert auf einer jahrzehntealten Nomenklatur, die von Hardy und Kollegen entwickelt wurde, wobei sich entwickelnde BM B-2-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Expression von B220, CD43, BP-1, CD24, IgM und IgD22 in verschiedene Fraktionen (Fraction) unterteilt werden können. Hardy et al. zeigten, dass B220+ CD43 BM B-Zellen auf der Grundlage der BP-1- und CD24(30F1)-Expression in vier Untergruppen (Fraction A-C') unterteilt werden können, während B220+ CD43-(dim to neg) BM B-Zellen basierend auf der differentiellen Expression von IgD und Oberflächen-IgM23 in drei Untergruppen (Fraction D-F') aufgelöst werden können. Fraktion A (Prä-Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1- CD24 (30F1)-, Fraktion B (frühe Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1- CD24 (30F1)+, Fraktion C (späte Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1+ CD24 (30F1)+ und Fraktion C' (frühe Prä-B-Zellen) sind als BP-1+ und CD24high definiert. Darüber hinaus sind Fraktion D (Prä-B-Zellen) definiert als B220 + CD43- IgM- B-Zellen, und Fraktion E (neu erzeugte B-Zellen, Kombination von unreifen und Übergangszellen) sind definiert als B220 + CD43- IgM + B-Zellen und Fraktion F (reife, rezirkulierende B-Zellen) sind definiert als B220high CD43- IgM + B-Zellen. Im Gegensatz dazu kann die Mehrheit der naiven B-Zellen in der Milz in reife (B220+ CD93-) B-Zellen und Übergangszellen (T1, T2, T3) unterteilt werden, abhängig von der Expression von CD93, CD23 und IgM. Reife B-Zellen können basierend auf der Expression von IgM und CD21/CD35 in Marginalzonen und follikuläre Untergruppen aufgelöst werden, und follikuläre Untergruppen können weiter in reife follikuläre Typ I und follikuläre Typ II B-Zelluntergruppen unterteilt werden, abhängig von der Ebene ihrer IgM- und IgD-Oberflächenexpression24. Diese Milz-B-Zell-Populationen exprimieren überwiegend Igκ-Leichtketten. Schließlich wurden B-1 B-Zellpopulationen, die aus der fetalen Leber stammen und hauptsächlich in den Peritoneal- und Pleurahöhlen erwachsener Mäuse vorkommen, in der Literatur beschrieben. Diese peritonealen B-Zellen können von den zuvor beschriebenen B-2 B-Zellen durch ihre fehlende CD23-Expression unterschieden werden. Sie werden dann weiter in B-1a- oder B-1b-Populationen unterteilt, wobei erstere durch das Vorhandensein von CD5 und letztere durch sein Fehlen definiert werden25. B-1-Zell-Vorläufer sind in der fetalen Leber reichlich vorhanden, werden aber nicht in erwachsenen BM gefunden. Während B-1a- und B-1b-Zellen von verschiedenen Vorläuferzellen stammen, säen beide die Peritoneal- und Pleurahöhle24. Im Gegensatz zu B-2-Zellen sind B-1-Zellen einzigartig in der Lage, sich selbst zu erneuern und sind für die Produktion natürlicher IgM-Antikörper verantwortlich.
Defekte in der B-Zell-Entwicklung können in vielen Fällen auftreten, einschließlich Mängel in den Komponenten des BCR26,27, Störungen von Signalmolekülen, die die BCR-Signalstärke beeinflussen14,28,29, oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen modulieren30,31 . Die durchflusszytometrische Analyse der lymphatischen Kompartimente hat zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklungsblöcke bei diesen Mäusen und vielen anderen beigetragen. Ein Vorteil der durchflusszytometrischen Analyse von lymphatischen Kompartimenten besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, Messungen an einzelnen Zellen durchzuführen, die aus lebendem dissoziiertem Gewebe gewonnen werden. Die Verfügbarkeit von Reagenzien in einem ständig wachsenden Spektrum von Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Darüber hinaus ergänzt die Aufzählung von B-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse andere immunologische Assays wie immunhistochemische Methoden, die die Zelllokalisierung in lymphatischen Organen visualisieren, den Nachweis zirkulierender Antikörperspiegel als Maß für die humorale Immunität sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Messung von B-Zell-Antworten in realem Raum und Zeit32.
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Protocol
Alle Mausstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Regeneron überwacht und genehmigt. Das Experiment wurde an Geweben von drei weiblichen C57BL/6J-Mäusen (17 Wochen) der Jackson Laboratories durchgeführt. Titrieren Sie alle Antikörper vor Beginn des Experiments, um die ideale Konzentration zu bestimmen. Wenn Sie Kompensationsperlen für die einfarbige Kompensation verwenden, stellen Sie sicher, dass sie so hell oder heller färben als Ihre Proben. Bewahren Sie alle Puffer, Antikörper und Zellen auf Eis oder bei 4 °C auf. Führen Sie nach Zugabe von Lebensfähigkeitsfarbstoff alle Schritte und Inkubationen bei 4 ° C entweder bei schwachem Licht oder im Dunkeln durch.
1. Peritoneale Zellernte und Einzelzellisolierung
- Die Maus wird mit CO2 oder nach zugelassenem Protokoll eingeschläfert.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken, sprühen Sie mit 70% Ethanol und schneiden Sie die äußere Bauchhaut mit einer Schere ab, wobei Sie darauf achten, das Peritoneum nicht zu schneiden.
- 3 ml eisgekühlter Waschpuffer (0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS [vol/vol]) werden mit einer 3 ml Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel versehen ist, in die Peritonealhöhle injiziert.
- Massieren Sie das Peritoneum sanft mit den Fingerspitzen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4.
- Führen Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 18-G-Nadel durch das Peritoneum ein und achten Sie darauf, Organe und Fett zu vermeiden.
- Extrahieren Sie den Waschpuffer, der jetzt Peritonealzellen enthält, und übertragen Sie ihn auf 15 ml konisches Rohr auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4.
- Schneiden Sie ein kleines Loch in das Peritoneum, während Sie mit einer Pinzette halten.
- Führen Sie eine Einweg-Transferpipette in das Loch ein und sammeln Sie den verbleibenden Waschpuffer ein, wobei Sie erneut Fett und Organe vermeiden.
- Übertragen Sie die gesammelten verbleibenden Peritonealzellen in das 15 ml lange konische Rohr auf Eis.
HINWEIS: Verwerfen Sie die Probe, wenn eine Blutkontamination offensichtlich ist. - Inkubieren Sie die Zellen auf Eis, bis die Milz- und Knochenextraktion abgeschlossen ist.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Waschpuffer.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.
2. Milzernte und Einzelzellisolierung
- Legen Sie die Maus auf den Bauch und schneiden Sie das Peritoneum auf der linken Rückseite mit einer sauberen Schere durch. Schneiden Sie die Milz aus und entfernen Sie Fett und Bindegewebe.
- Geben Sie die Milz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Waschpuffer auf Eis.
- Inkubieren Sie die Milz auf Eis, bis die Knochenextraktion abgeschlossen ist.
- Bewegen Sie die Milz in einen automatisierten Dissoziationsschlauch mit 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen. Legen Sie den Schlauch auf das Gewebedissoziatorinstrument und dissoziieren Sie für 60 s, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen.
HINWEIS: Es ist auch zulässig, andere Routinemethoden zur Gewinnung einzelliger Milzsuspensionen anzuwenden, z. B. das Zertrümmern zwischen Milchglasobjektträgern im Waschpuffer. Wenn eine andere Methode der Dissoziation verwendet wird, folgen Sie der Dissoziation mit Zentrifugation, Aspiration und dann Resuspension in 5 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen, bevor Sie mit Schritt 2.5 fortfahren. - Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 3 min.
- Fügen Sie 10 ml 4 °C Waschpuffer mit 2 mM EDTA hinzu.
- In ein sauberes konisches 15-ml-Rohr geben.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL 4 °C Waschpuffer.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.
3. BM-Ernte und Einzelzellisolierung
- Entfernen Sie die Haut von der unteren Hälfte des Mauskörpers. Schneiden Sie den überschüssigen Muskel vom Bein ab. Entfernen Sie das gesamte Bein mit einer Schere und achten Sie darauf, den Oberschenkelknochen nicht zu schneiden. Reinigen Sie den Femur und die Tibia, indem Sie die verbleibenden Muskeln, Fett und Füße entfernen.
- Übertragen Sie die Knochen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Waschpuffer auf Eis.
- Perforieren Sie den Boden eines 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens und lassen Sie ein Loch zurück, das klein genug ist, damit die Beinknochen nicht hervorstehen. Führen Sie das 0,5 ml Röhrchen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen ein. Schneiden Sie das Ende des Femurs und der Tibia proximal zum Knie ab und legen Sie die geschnittenen Enden nach unten in die 0,5 ml Röhre.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.780 x g für 2 min bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen und übertragen Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das zusätzliche 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen enthält.
- Bei Raumtemperatur 3 Min. inkubieren.
- Fügen Sie 10 ml 4 °C Waschpuffer mit 2 mM EDTA hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml 4 °C Waschpuffer.
- Filtern Sie Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.
4. Färben Sie Zellen und bereiten Sie den Ausgleich vor
- Aliquot 106 Zellen jedes Zelltyps von jedem Tier zu einer 96 Well U Bodenplatte.
- Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Vertiefungen für alle Proben und Kontrollen enthalten, einschließlich Vollfärbung, Fluoreszenz-Minus-Eins (FMO), ungefärbt und schließlich die optionale einfarbige Kompensation für jeden verwendeten Fluorophor.
- Für das BM-Reifungspanel und das Milzreifungspanel aliquote Zellen in 2 Vertiefungen, 106 Zellen pro Vertiefung, für jede vollständige Färbeprobe. Für die einfarbigen Kompensationsfähigkeitssteuerungen fügen Sie 2 x 106 Zellen jedes Zelltyps zu einzelnen Vertiefungen hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL DPBS (ohne BSA oder FBS). Dieser Schritt ist wichtig, um Protein vor der Färbung mit aminreaktivem Lebensfähigkeitsfarbstoff zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL Lebensfähigkeitsfarbstoff verdünnt 1:1.000 in DPBS.
HINWEIS: Wenn Sie Zellen für die einfarbige Kompensation verwenden, fügen Sie diesen Vertiefungen keinen Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu.- Lassen Sie für jedes Fleckenset mehrere ungefärbte Vertiefungen für eine vollständig ungefärbte Probe und alle anderen Kontrollen, die Sie möglicherweise benötigen.
- Lassen Sie für jedes Fleckenset eine zusätzliche unbefleckte Vertiefung für die FMO-Kontrolle der Lebensfähigkeit.
- Für die einfarbigen Lebensfähigkeitskompensationskontrollen: Resuspendieren Sie die 2 x 106 Zellen, aliquoted in Schritt 4.1, in 200 μL verdünntem Lebensfähigkeitsfarbstoff. Übertragen Sie 100 μL Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, erwärmen Sie die Zellen für 5 minuten bei 65 ° C und übertragen Sie die 100 μL wärmegetöteten Zellen zurück in den ursprünglichen Brunnen mit den verbleibenden 100 μL lebenden Zellen.
- Inkubieren Sie Zellen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL DPBS (ohne BSA oder FBS).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.9.
- Wiederholen Sie Schritt 4.8.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL Fc-Block verdünnt 1:50 (Endkonzentration = 10 μg / ml) in Fleckenpuffer (0,5% BSA in DPBS [vol / vol]).
- Für Peritonealzellen - fügen Sie auch 5 μL Monozytenblocker hinzu, um unspezifische Färbungen zu reduzieren.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 15 min.
- Bereiten Sie vollständige Flecken-Master-Mischungen und FMOs im Fleckenpuffer für ein Endvolumen von 100 μl pro 106 Zellen vor. Die Antikörperlisten finden Sie in Tabelle 1-Tabelle 4 .
HINWEIS: FMOs werden hergestellt, indem alle Antikörper bis auf einen in ein Fleckenset aufgenommen werden. Bereiten Sie für jeden Antikörper in einem Fleckenset eine FMO vor. Wenn ein Fleckenset mehrere Brillantefarbstoffe enthält, ersetzen Sie 50 μL Brillantfleckenpuffer durch Fleckenpuffer pro Probe - Ohne den Fc-Block zu entfernen, fügen Sie 100 μL vollständige Fleckenmischungen und FMOs zu ausgewählten Vertiefungen hinzu.
- Bereiten Sie einfarbige Kompensationskontrollen für jeden Antikörper in einem Fleckenset vor.
- Wenn Sie Kompensationsperlen verwenden, befolgen Sie die Gebrauchsanweisung des Herstellers.
- Wenn Sie Zellen verwenden, geben Sie titrierten Antikörper zu 106 Zellen, die zuvor in Schritt 4.6.1 ohne Lebensfähigkeitsfarbstoff reserviert waren, in 100 μL Fleckenpuffer. Wenn alle Zellen in der Probe positiv für einen bestimmten Marker sind, legen Sie nicht gefärbte Zellen beiseite, die bei der Erfassung von Kompensationsdaten auf dem Durchflusszytometer verwendet werden sollen.
- Inkubieren Sie die Zellen und Kügelchen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
- Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 μL Fleckenpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.18 und 4.19 zweimal.
- Wiederholen Sie Schritt 4.18.
- Um die Proben für die Analyse innerhalb von 48 h zu fixieren, resuspend Zellen und Kügelchen in 200 μL 2% Paraformaldehyd in DPBS.
VORSICHT: Parafomaldehyd ist ein ernstes Gesundheitsrisiko und brennbar. Lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt. - Inkubieren Sie die Zellen und Kügelchen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.18 und 4.19 zweimal.
- Legen Sie eine Filterplatte über eine saubere 96-Well-U-Bodenplatte. Mit einer Multipipette wird jede Probe in eine Vertiefung der Filterplatte gegeben.
- Zentrifugieren Sie die Filterplatte-96 Well U-Bodenplatte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Filterplatte und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Vertiefungen nicht kreuzkontaminiert werden.
- Für die BM- und Milzreifungsplatten resuspen die vollständig gefärbten Zellen in 100 μL Fleckenpuffer. Kombinieren Sie die 2 Vertiefungen für jedes Tier zu 1 Vertiefung. Resuspendieren Sie die verbleibenden Panels, FMOs und Kontrollen in 200 μL Fleckenpuffer.
- Fixierte Zellen und Kügelchen bei 4 °C, lichtgeschützt, über Nacht inkubieren.
5. Durchflusszytometrische Datenerfassung
- Initialisieren und QC des Durchflusszytometers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Laden Sie die für jeden Bereich spezifische Vorlage.
- Stellen Sie vor dem Aufzeichnen der Daten sicher, dass alle Ereignisse für jede Stichprobe maßstabsgetreu und auf den Punktdiagrammen sichtbar sind.
- Zeichnen Sie die Kompensationskontrollen für jedes Fleckenpanel mit einzelnen Fleckenkompensationen auf, die in Schritt 4.16 vorbereitet wurden. Legen Sie positive und negative Gatter für jede Probe fest. Lassen Sie die Software die Vergütungsmatrix berechnen.
- Beginnen Sie mit der Erfassung der ersten Probe und stellen Sie sicher, dass die Gates entsprechend festgelegt sind.
- Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie mindestens 50.000 B-Zellereignisse für das peritoneale B-Zellpanel und das Milz-Igκ- und Igλ-Panel aufzeichnet. 150.000 B-Zell-Events für das BM-Reifungspanel; und 300.000 B-Zellereignisse für das Milzreifungspanel.
- Führen Sie für jede Fleckenplatte die vollständig gefärbten Proben für jedes Tier, eine nicht gefärbte Probe und die FMOs aus und zeichnen Sie sie auf.
6. Daten analysieren
- Fahren Sie mit der Datenanalyse mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware fort. Befolgen Sie die in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 beschriebenen Gating-Strategien.
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Representative Results
Hier stellen wir die Gating-Strategie zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklung in Mausperitoneum, BM und Milz vor. Die Grundlage der Analyse bildet das Konzept der Färbung mit Lebensfähigkeitsfarbstoff, dann das Ausstecken von Dubletten basierend auf der Forward-Scatter-Area (FSC-A) und Forward-Scatter-Height (FSC-H) und schließlich das Ausgleiten von Trümmern durch Auswahl von Zellen nach ihren FSC-A- und Side-Scatter-Area (SSC-A) -Eigenschaften, hier als Größengatter bezeichnet, die die relative Zellgröße und Zellgranularität widerspiegeln. vor dem Gating auf population of interest.
Die durchflusszytometrische Analyse von peritonealen B-Zellen zeigt die Häufigkeiten lebensfähiger Peritonealzellen, Gesamt-B-Zellen, B-1- und B-2-Untergruppen sowie B-1a- und B-1b-Zellen in C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 1) unter Verwendung eines in Tabelle 1 dargestellten Färbepanels. Die durchschnittliche absolute Zellzahl dieser Frequenzen ist in Tabelle 5 dargestellt. Störungen in B-1-Zellen könnten durch die Verteilung der Zelluntergruppen abgegrenzt werden, entweder durch die Zellfrequenz oder die absolute Zellzahl pro Maus.
Die durchflusszytometrische Analyse von BM-B-Zellen zeigt die Häufigkeiten von lebensfähigen BM-Zellen, Gesamt-B-Zellen, Fraktion A (Prä-Pro-B-Zellen und kontaminierende Lymphozyten), Prä-Pro-B-Zellen, Fraktion B, Fraktion C', Fraktion D, unreif (Untergruppe in Fraktion E), Übergangszellen (Untergruppe in Fraktion E) und Fraktion F B-Zellen in C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 2) unter Verwendung eines in Tabelle 2 beschriebenen Färbepanels. Die durchschnittliche absolute Zellzahl dieser Frequenzen ist in Tabelle 6 dargestellt. Störungen in BM B-Zellen könnten durch die Verteilung der Zelluntergruppen abgegrenzt werden, entweder durch Zellfrequenz oder absolute Zellzahl pro Bein(en).
Die durchflusszytometrische Analyse von Milz-B-Zellen zeigt die Häufigkeiten von lebensfähigen Milzzellen, Gesamt-B-Zellen, Übergangs-B-Zellen, T1, T2, T3-Zellen, reifen B-Zellen, follikulären I-Zellen (Fol I), follikulären II(Fol II)-Zellen, Marginalzonen-Vorläuferzellen (MZ), reifen MZ-Zellen und B-1-Zellen in C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 3) unter Verwendung eines in Tabelle 3 dargestellten Färbepanels. Die durchschnittliche absolute Zellzahl dieser Frequenzen ist in Tabelle 7 dargestellt. Störungen in Milz-B-Zellen könnten durch verteilung der Zelluntergruppen abgegrenzt werden, entweder durch Zellfrequenz oder absolute Zellzahl pro Milz.
In ähnlicher Weise zeigt die durchflusszytometrische Analyse der Milz die Häufigkeiten von Igκ+- und Igλ+-B-Zellen bei C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 4) unter Verwendung eines in Tabelle 4 dargestellten Färbepanels. Die durchschnittliche absolute Zellzahl dieser Frequenzen ist in Tabelle 8 dargestellt. Störungen in Igκ+- und Igλ+- Bzellen könnten durch die Verteilung der Zelluntergruppen abgegrenzt werden, entweder durch Zellfrequenz oder absolute Zellzahl pro Milz.
| Antikörper | Fluorophor | klonen |
| CD-19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD11b | BV711 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
Tabelle 1: Peritoneal-B-Zellpanel
| Antikörper | Fluorophor | klonen |
| CD-19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | Nr. 1B11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-Formel 1 |
| C-Kit | BUV395 | 2B8 |
| BP-1 | BV786 | BP-1 |
| CD93 | BV711 | AA4.1 |
| Dump-Kanal | ||
| CD3 | AF700 | 17 bis A2 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | AF700 | RB6-8C5 |
| Ter119 | AF700 | TER-119 |
Tabelle 2: Knochenmarkreifungspanel
| Antikörper | Fluorophor | klonen |
| CD-19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD21/35 | BV421 | 7G6 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
| CD93 | PE | AA4.1 |
Tabelle 3: Milzreifungspanel
| Antikörper | Fluorophor | klonen |
| CD-19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5,5 | 11-26c.2a |
| CD3 | PB | 17 bis A2 |
| Kappa | FITC | 187.1 |
| Lambda | PE | RML-42 |
Tabelle 4: Milz Igκ und Igλ Panel
Abbildung 1: Charakterisierung von B-Zell-Populationen im Peritoneum. Lebensfähige, einzellige, größengesteuerte peritoneale B-Zellen werden zunächst durch Gating auf IgM+-Zellen von kontaminierenden Zellen getrennt. B-1- und B-2-Zellen werden dann durch Abwesenheit (B-1) oder Vorhandensein von CD23 (B-2) voneinander unterschieden. Der nächste CD5-Ausdruck wird verwendet, um B-1a-Zellen (CD5+) von B-1b-Zellen (CD5-) abzugrenzen. FMOs wurden verwendet, um empirisch zu bestimmen, wo Tore zu ziehen sind. Zahlen sind Prozentsätze jeder Population innerhalb desselben Dichtediagramms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung von B-Zell-Untergruppen im BM. Lebensfähige, einzellige BM B-Zellen werden von Nicht-B-Zellen getrennt, indem sie auf B220 + -Dump-Zellen (wobei sich Dump auf CD3 / GR-1 / CD11b / TER119 bezieht) gating werden. Der CD43- und B220-Ausdruck definiert den Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) und den Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++). Der Bruch A-C' ist weiter durch die Expression von BP-1 und CD24 getrennt. Fraktion A (BP-1- CD24-) entspricht Prä-Pro-B-Zellen zusammen mit kontaminierenden Zellen. Um Prä-Pro-B-Zellen von kontaminierenden Zellen in Fraktion A zu trennen, werden die Expression von CD93 und das Fehlen von CD19 genutzt. Fraktion B (BP-1- CD24int) und Fraktion C (BP-1+ CD24int) entsprechen frühen bzw. späten Pro-B-Zellen und Fraktion C' (BP-1+/- CD24+) entspricht frühen Prä-B-Zellen. Zur Trennung der Fraktion D-F wird die Expression von IgM und IgD verwendet. Fraktion D entspricht späten Prä-B-Zellen (IgM-/Low IgD-); Fraktion E (blue gate, IgMint/high IgD-) sowohl für unreife (Imm, IgMint IgD-) als auch für Übergangszellen (Tran, IgMhigh IgD-) B-Zellen; und Fraktion F (IgMint/high IgD+) zu rezirkulierenden reifen B-Zellen. FMOs wurden verwendet, um empirisch zu bestimmen, wo Tore zu ziehen sind. Zahlen sind Prozentsätze jeder Population innerhalb desselben Dichtediagramms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Charakterisierung der Milz-B-Zell-Reifung. Lebensfähige, einzellige, größenangeignete Milz-B-Zellen werden von Nicht-B-Zellen durch Gating auf B220+ Zellen getrennt. Um die B-1-Untergruppe zu identifizieren, werden CD23-CD19+ Zellen identifiziert und durch Expression von CD43 definiert. Um B-2-Populationen zu klassifizieren, werden CD19+ Zellen in Übergangszellen (CD93+ B220+) und reife (CD93- B220+) B-Zellen unterteilt. Übergangszellen (CD93+ B220+) werden weiter in T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) und T3 (IgMint CD23+) Populationen unterteilt. Reife (CD93- B220+) Zellen werden in marginale Zonen (CD21/35+ IgM+) und follikuläre (CD21/35int IgMint/+) B-Zellen getrennt. Die Expression von CD23 wird weiter verwendet, um MZ-Vorläuferzellen (CD23+ B220+) von reiferen MZ-Zellen (CD23-B220+) zu trennen. Follikuläre Populationen werden dann in Fol I (IgD+ IgMint) und Fol II (IgD+ IgM+) Zellen abgegrenzt. FMOs wurden verwendet, um empirisch zu bestimmen, wo Tore zu ziehen sind. Zahlen sind Prozentsätze jeder Bevölkerung innerhalb des gleichen Dichtediagramms Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl anzuzeigen.
Abbildung 4: Igκ- und Igλ-Expression von Milz-B-Zellen. Lebensfähige, einzellige, größengebundene Milz-B-Zellen werden von Nicht-B-Zellen durch Gating auf B220+ CD3-Zellen getrennt. B-Zellen werden dann durch die Expression von Igλ und Igκ unterschieden. Zahlen sind Prozentsätze jeder Population innerhalb desselben Dichtediagramms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Absolute Zellennummer | |||||
| Tiernummer | Lebensfähige Peritonealzellen | B-Zellen | B-1a Zellen | B-1b Zellen | B-2 Zellen |
| 1 | 1.02E+07 | 4.67E+06 | 1.28E+06 | 8.95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92E+06 | 4.52E+06 | 1.49E+06 | 9.60E+05 | 1.91E+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56E+06 | 1.71E+06 | 9.19E+05 | 1.78E+06 |
| Durchschnitt | 1.05E+07 | 4.58E+06 | 1.49E+06 | 9.25E+05 | 2.01E+06 |
Tabelle 5: Absolute Zellzahlen von peritonealen B-Zell-Untergruppen
| Absolute Zellennummer | |||||||||||
| Tiernummer | Lebensfähige Knochenmarkzellen | B-Zellen | Bruch A | Vor-Profi | Fraktion B | Fraktion C | Fraktion C' | Fraktion D | Unreif | Übergangs | Bruch F |
| 1 | 5.05E+07 | 9.70E+06 | 1.13E+06 | 1.95E+05 | 2.22E+05 | 9.14E+04 | 6.31E+05 | 1.59E+06 | 4.56E+05 | 7.81E+05 | 4.03E+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03E+07 | 1.14E+06 | 2.29E+05 | 2.89E+05 | 1.22E+05 | 8.40E+05 | 2.11E+06 | 5.39E+05 | 8.07E+05 | 3.67E+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1.01E+07 | 1.10E+06 | 2.12E+05 | 2.84E+05 | 1.05E+05 | 9.02E+05 | 2.72E+06 | 5.94E+05 | 7.62E+05 | 2.59E+06 |
| Durchschnitt | 5.46E+07 | 1.00E+07 | 1.12E+06 | 2.12E+05 | 2.65E+05 | 1.06E+05 | 7.91E+05 | 2.14E+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43E+06 |
Tabelle 6: Absolute Zellzahlen von Knochenmark-B-Zell-Subsets
| Absolute Zellennummer | ||||||||||||
| Tiernummer | Lebensfähige Milzzellen | B-Zellen | Übergangs-B-Zellen | T1-Zellen | T2-Zellen | T3-Zellen | Reife B-Zellen | Follikuläre I Zellen | Follikuläre II Zellen | Vorläufer-Randzonenzellen | Reife Randzonenzellen | B-1 Zellen |
| 1 | 9.16E+07 | 4.61E+07 | 3.66E+06 | 1.55E+06 | 1.10E+06 | 7.16E+05 | 4.06E+07 | 2.39E+07 | 5.27E+06 | 2.17E+06 | 3.98E+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.18E+07 | 4.88E+06 | 1.97E+06 | 1.57E+06 | 1,00E+06 | 4.49E+07 | 2.68E+07 | 7.33E+06 | 3.42E+06 | 3.84E+06 | 8.15E+05 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.34E+07 | 4.64E+06 | 1.98E+06 | 1.41E+06 | 8.54E+05 | 4.62E+07 | 2.81E+07 | 5.84E+06 | 3.58E+06 | 4.02E+06 | 1.01E+06 |
| Durchschnitt | 9.77E+07 | 5.04E+07 | 4.39E+06 | 1.83E+06 | 1.36E+06 | 8.58E+05 | 4.39E+07 | 2.63E+07 | 6.15E+06 | 3.06E+06 | 3.94E+06 | 9.02E+05 |
Tabelle 7: Absolute Zellzahlen von Milz-B-Zell-Teilmengen
| Absolute Zellennummer | ||||
| Tiernummer | Lebensfähige Milzzellen | B-Zellen | Igκ+ B Zellen | Igλ+ B Zellen |
| 1 | 9.16E+07 | 4.97E+07 | 4.51E+07 | 2.46E+06 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.63E+07 | 5.08E+07 | 3.16E+06 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.91E+07 | 5.33E+07 | 3.24E+06 |
| Durchschnitt | 9.77E+07 | 5.50E+07 | 4.97E+07 | 2.95E+06 |
Tabelle 8: Absolute Zellzahlen von Igκ- und Igλ B-Zellteilmengen
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Discussion
Die durchflusszytometrische Analyse von lymphatischem und nicht-lymphatischem Gewebe ermöglicht seit den 1980er Jahren die gleichzeitige Identifizierung und Zählung von B-Zell-Subpopulationen bei Mäusen und Menschen. Es wurde als Maß für die humorale Immunität verwendet und kann weiter angewendet werden, um die B-Zell-Funktionalität zu bewerten. Diese Methode nutzt die Verfügbarkeit von Reagenzien, um verschiedene Stadien der B-Zell-Reifung bei Mäusen und Menschen durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter zu bewerten, die die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität auch in seltenen Populationen ermöglichen. Wenn es zur Messung komplexer heterogener Proben verwendet wird, kann es innerhalb von Minuten Subpopulationen auf einzelnen Zellen nachweisen33. Die sequentielle Gating-Analysestrategie, die am häufigsten auf die durchflusszytometrische Analyse angewendet wird, kann einfach und intuitiv sein, wenn eine bestimmte Population identifiziert werden muss34. Schließlich besteht ein weiterer Vorteil der Durchflusszytometrie darin, dass sie in den meisten akademischen Labors unter Anleitung erfahrener Benutzer leicht anpassbar ist. Unser Protokoll beschreibt erfolgreich die Beurteilung von B-Zell-Populationen im Peritoneum, BM und Milz von Mäusen, indem es B-1-Populationen beschreibt und aufzählt und sich mit der Entwicklung von B-2-Pro-B-Zellen, Prä-B-Zellen, unreifen, Übergangs- und reifen B-Zellen sowie deren Oberflächenexpression von Igκ- oder Igλ-Lichtketten befasst. Die Durchflusszytometrie ist die am weitesten verbreitete und am einfachsten anzuwendende Methode bei der Untersuchung der B-Zell-Entwicklung bei Mäusen.
Während die Durchflusszytometrie unschätzbare Daten generiert, gibt es einige Grenzen für diese Technologie, wenn sie zur Untersuchung der Heterogenität des Immun-B-Zell-Kompartiments eingesetzt wird. Riesige Datensätze können überwältigend sein, da 10 Farbfärbungen die Erkennung von mehr als 1.024 verschiedenen Zellpopulationen ermöglichen34. Man muss berücksichtigen, dass sich einige häufig verwendete lymphatische Zellmarker als weniger spezifisch erwiesen haben als ursprünglich angenommen. Dies kann gelöst werden, indem eine Vielzahl von Zelloberflächenmarkern verwendet wird, um das Gating auf gewünschten Populationen zu bestimmen. Während die durchflusszytometrische Analyse einfach und intuitiv sein kann, besteht eine weitere Einschränkung der durchflusszytometrischen Analyse darin, dass sie in der Regel nur die Visualisierung von zwei Parametern gleichzeitig ermöglicht, obwohl Datenvisualisierungstools wie t-SNE verwendet werden können, um Zellpopulationen effizienter zu clustern, wenn die Durchflusszytometrie mit hohen Parametern verwendet wird. Eine weitere wichtige Einschränkung besteht darin, dass die Gatter, die sowohl bei der Erfassung als auch bei der Analyse verwendet werden, manchmal von der Subjektivität des Bedieners abhängen.
Für eine erfolgreiche Anpassung oder Replikation dieses Protokolls gibt es mehrere kritische Parameter, die berücksichtigt werden müssen35. Das Paneldesign und die Auswahl des Fluorochroms müssen sorgfältig berücksichtigt werden. Es ist unerlässlich, schwache oder wichtige Antigene mit hellen Fluorochromen zu kombinieren. Die Antikörpertitration muss durchgeführt werden, um eine übermäßige Antikörperbindung an Zellen unspezifisch zu vermeiden, was möglicherweise die Hintergrundfärbung erhöht und die Auflösung verringert. Die Antikörpertitration erfolgt durch Färbung einer bekannten Anzahl von Zellen mit abnehmenden Antikörperkonzentrationen, um den besten Trennindex zu bestimmen36. Dies sollte für jede Menge Antikörper wiederholt werden. Während der Probenvorbereitung und Färbung ist es wichtig, eine Einzelzellsuspension sicherzustellen, indem Ca++ und Mg++ vermieden werden. Darüber hinaus kann die Zugabe von EDTA dazu beitragen, zellaggregation und enzymatische Aktivität zu verhindern, was zu einer Antikörper-vermittelten Stimilulation und Internalisierung von markierten Markern führen kann. Vor der Datenerfassung müssen die Proben ordnungsgemäß suspendiert, gefiltert und frei von Aggregaten sein. Das Übergreifen des Signals von einem Parameter auf einen anderen wird durch die Verwendung von Kompensationskontrollen in Form von einzelnen gefärbten Zellen oder kommerziell erhältlichen Kompensationsperlen aufgelöst35. Eine weitere wichtige Überlegung ist, in jedem Experiment über geeignete Kontrollen zu verfügen. Ungefärbte Zellen bilden die Grundlinie der Autofluoreszenz. Isotype-Kontrollen werden aufgrund unspezifischer Bindung nicht mehr als geeignete Kontrollen für das Gating angesehen. Der wichtigste Schritt, um genaue Gatter herzustellen, ist die Verwendung von FMO-Kontrollen. Bei einer FMO-Kontrolle sind alle konjugierten Antikörper in der Färbung vorhanden, mit Ausnahme desjenigen, für den kontrolliert wird. FMO-Steuerungen ermöglichen die Messung der Ausbreitung aller Fluorophore in den fehlenden Kanal und ermöglichen so das entsprechende Einrichten von Gattern. Es ist wichtig, dass genügend Zellen für eine zusätzliche Genauigkeit erworben werden. Als Faustregel gilt, dass mindestens 2.000 Ereignisse der interessierenden Bevölkerung gesammelt werden sollten. Schließlich sollten Kompensationskontrollen, ob Perlen oder Zellen, genau auf die verwendeten Fluorochrome abgestimmt sein, und die Kontrollen müssen mindestens so hell sein wie die experimentellen Proben37.
Insgesamt ist die niedrige zytometrische Analyse von B-Zell-Kompartimenten im Bereich der Immunologie weit verbreitet. Diese Technik kann verwendet werden, um Störungen in der humoralen Immunität sowohl bei Wildtyp- als auch bei genetisch veränderten Mäusen, unter Nicht-Krankheitszuständen und bei immunologischen Herausforderungen zu untersuchen.
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Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter und Aktionäre von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Wir danken Matthew Sleeman für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch den Kernabteilungen Vivarium Operations und Flow Cytometry bei Regeneron für die Unterstützung dieser Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
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