Summary
Vi beskriver häri en enkel analys av heterogeniteten hos murin immun B cell facket i bukhinnan, mjälte och benmärg vävnader genom flöde cytometry. Protokollet kan anpassas och utvidgas till andra musvävnader.
Abstract
Omfattande studier har kännetecknat utveckling och differentiering av murin B-celler i sekundära lymfoida organ. Antikroppar som utsöndras av B-celler har isolerats och utvecklats till väletablerade terapier. Validering av murin B-cellutveckling, i samband med autoimmuna benägen möss, eller hos möss med modifierat immunsystem, är en avgörande komponent för att utveckla eller testa terapeutiska medel hos möss och är en lämplig användning av flödescytometri. Väletablerade B-cellflöde cytometriska parametrar kan användas för att utvärdera B-cellutveckling i murin bukhinnan, benmärgen och mjälten, men ett antal bästa metoder måste följas. Dessutom bör flödescytometrisk analys av B-cellfack också komplettera ytterligare avläsningar av B-cellutveckling. Data som genereras med denna teknik kan främja vår förståelse av vilda typer, autoimmuna benägen musmodeller samt humaniserade möss som kan användas för att generera antikropps- eller antikroppsliknande molekyler som terapier.
Introduction
Monoklonala antikroppar har i allt högre grad blivit valterapi för många mänskliga sjukdomar när de blir en del av mainstreammedicin1,2. Vi har tidigare beskrivit genetiskt konstruerade möss som effektivt producerar antikroppar som hyser helt mänskliga variabla regioner med mus IgH konstanter3,4. Senast har vi beskrivit genetiskt modifierade möss som producerar antikroppsliknande molekyler som har distinkt antigenbindning5. Antikroppar utsöndras av B-celler och utgör grunden för adaptiv humoral immunitet. Det finns två distinkta typer av B-celler, B-1 och B-2. Hos däggdjur har B-1 celler sitt ursprung i fostrets lever och berikas i slemhinnan vävnader och pleura- och peritonealhåligheterna efter födseln, medan B-2-celler har sitt ursprung i fostrets lever före födseln och därefter i benmärgen (BM). B-2 celler berikas i sekundära lymfoida organ inklusive mjälte och blod6,7,8. I BM börjar B-2 hematopoetiska stamceller differentiera till pro-B-celler vid inledandet av Ig mu tung kedja omorganisering9,10. Framgångsrik omorganisering av Ig tung kedja och dess sammansättning i pre-B cell receptorn (pre-BCR), tillsammans med signalering och proliferative expansion, leder till differentiering till pre-B celler. Efter pre-B celler omorganisera sin Ig kappa (Igκ), eller om improduktiva, Ig lambda (Igλ) ljuskedjor, de paras med μ tung kedja, vilket resulterar i yta IgM BCR uttryck. Det är viktigt att påpeka att IgM ytuttryck är känt för att minskas under förhållanden av autoreaktivitet, vilket bidrar till självtolerans i funktionellt svarslösa eller anergiska B-celler11,12. Omogna B-celler går sedan in i ett övergångsstadium, där de börjar uttrycka IgD och migrera från BM till mjälten. I mjälten ökar IgD-uttrycket ytterligare och cellerna mognar till ett andra steg av övergångs B-celler, följt av slutförande av deras mognadsstatus och utveckling till antingen marginella zoner (MZ) eller follikulära (Fol) celler13,14,15. Hos vuxna möss, i en icke-sjuk miljö, förblir antalet mogna B-celler konstant trots att 10-20 miljoner omogna B-celler genereras dagligen i BM. Av dessa kommer endast tre procent in i poolen med mogna B-celler. Storleken på det perifera B-cellfacket begränsas av celldöd, delvis på grund av flera faktorer, inklusive självreaktivitet och ofullständig mognad16,17,18. Flödescytometrisk analys har använts i stor utsträckning för att karakterisera och räkna upp många immuncellsunderfack hos människor och möss. Även om det finns vissa likheter mellan mänskliga och murin B cell fack, detta protokoll gäller endast analys av murin B celler. Detta protokoll utvecklades i syfte att fenotypning genetiskt konstruerade möss, för att avgöra om genetisk manipulation skulle förändra B-cellutveckling. Flödescytometri har också varit enormt populärt i många ytterligare tillämpningar, bland annat vid mätning av cellaktivering, funktion, spridning, cykelanalys, DNA-innehållsanalys, apoptos och cellsortering 19,20.
Flödescytometri är det verktyg som valts för att karakterisera olika lymfocytfack hos möss och människor, inklusive i komplexa organ som mjälte, BM och blod. På grund av allmänt tillgängliga musspecifika antikroppsreagenser för flödescytometri kan denna teknik användas för att undersöka inte bara cellytans proteiner utan också intracellulära fosfoproteiner och cytokiner, liksom funktionella avläsningar21. Häri visar vi hur flöde cytometri reagenser kan användas för att identifiera B-celler undergrupper som de mognar och differentierar i sekundära lymfoida organ. Efter optimering av färgningsförhållanden, provhantering, korrekt instrumentuppsättning och datainsamling, och slutligen dataanalys, kan ett protokoll för omfattande flödescytometrisk analys av B-cellutrymmet hos möss användas. En sådan omfattande analys är baserad på en årtionden gammal nomenklatur som utarbetats av Hardy och kollegor, där utveckling av BM B-2-celler kan delas in i olika fraktioner (Fraktion) beroende på deras uttryck av B220, CD43, BP-1, CD24, IgM och IgD22. Hardy et al., visade att B220 + CD43 BM B celler kan delas in i fyra delmängder (Fraktion A-C') på grundval av BP-1 och CD24 (30F1) uttryck, medan B220 + CD43-(dim till neg) BM B celler kan lösas i tre delmängder (Fraktion D-F) baserat på differentiell uttryck av IgD och ytan IgM23. FraktA B (pre-pro-B-celler) definieras som BP-1- CD24 (30F1)-, Frakt B (tidiga pro-B-celler) definieras som BP-1- CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C' (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C' (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C' (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B- Dessutom definieras fraktion D (pre-B-celler) som B220+ CD43- IgM- B-celler, och Fraktion E (nygenererade B-celler, kombination av omogna och övergångsceller) definieras som B220+ CD43- IgM+ B-celler och Fraktion F (mogna, omsända B-celler) definieras som B220high CD43- IgM + B-celler. Däremot kan majoriteten av naiva B-celler som finns i mjälten delas in i mogna (B220+ CD93-) B-celler och övergångsceller (T1, T2, T3) beroende på uttryck av CD93, CD23 och IgM. Mogna B-celler kan lösas i marginell zon och follikulära delmängder baserat på uttryck av IgM och CD21/CD35, och follikulära delmängder kan ytterligare delas in i mogna follikulära typ I och follikulära typ II B cell subsets beroende på nivån på deras IgM och IgD ytan uttryck24. Dessa splenic B cell populationer uttrycker främst Igκ ljus kedja. Slutligen har B-1 B cell populationer, som har sitt ursprung i fetala lever och finns främst i peritoneal och pleura håligheter hos vuxna möss, beskrivits i litteraturen. Dessa peritoneal B celler kan särskiljas från de tidigare beskrivna B-2 B celler genom deras brist på CD23 uttryck. De delas sedan vidare in i B-1a- eller B-1b-populationer, där den förstnämnda definieras av förekomsten av CD5 och den senare genom dess frånvaro25. B-1 cell föregångare är rikliga i fetala levern, men finns inte i vuxna BM. Medan B-1a och B-1b celler härstammar från olika stamceller, de båda frö peritoneal och pleura håligheter24. Till skillnad från B-2-celler är B-1-celler unikt kapabla till självförnyelse och ansvarar för produktion av naturliga IgM-antikroppar.
Defekter i B-cellsutveckling kan uppstå i många fall, inklusive brister i komponenterna i BCR26,27, störningar av signalmolekyler som påverkar BCR-signalstyrkan14,28,29, eller störning av cytokiner som modulerar B-cellsöverlevnad30,31 . Flöde cytometri analys av lymfoida fack har bidragit till karakteriseringen av B-cells utvecklingsblocken i dessa möss och många andra. En fördel med flödescytometrisk analys av lymfoida fack är att det erbjuder förmågan att göra mätningar på enskilda celler som erhållits från levande dissocierad vävnad. Tillgången till reagenser i ett ständigt växande utbud av fluoroforer möjliggör samtidig analys av flera parametrar och möjliggör bedömning av B-cells heterogenitet. Dessutom kompletterar uppräkning av B-celler genom flödescytometrisk analys andra immunologiska analyser såsom immunohistokemiska metoder som visualiserar celllokalisering inom lymfoida organ, detektion av cirkulerande antikroppsnivåer som ett mått på humoral immunitet, samt två fotonmikroskopi för att mäta B-cellssvar i verkliga rymden och tiden32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musstudier övervakades och godkändes av Regenerons institutional animal care and use committee (IACUC). Experimentet utfördes på vävnader från tre C57BL/6J honmöss (17 veckor) från Jackson Laboratories. Titrera alla antikroppar innan experimentet påbörjas för att bestämma idealisk koncentration. När du använder kompensationspärlor för enfärgskompensation, se till att de färgar så ljusa eller ljusare än dina prover. Håll alla buffertar, antikroppar och celler på is eller vid 4 °C. Efter tillsats av livskraft färgämne, utför alla steg och inkubationer vid 4 °C i antingen svagt ljus eller i mörkret.
1. Peritoneal cell skörd och encellsisolering
- Avliva musen med co2 eller enligt godkänt protokoll.
- Lägg musen på ryggen, spraya med 70% etanol och skär yttre bukhud med sax, var försiktig så att du inte skär bukhinnan.
- Injicera 3 ml iskall tvättbuffert (0,5 % bovint serumalbumin (BSA) i DPBS [vol/vol]) i bukhinnans hålighet med en 3 ml spruta utrustad med en 25 gauge nål.
- Massera försiktigt bukhinnan med fingertopparna.
- Upprepa steg 1.3 och 1.4.
- Sätt in en 3 ml spruta utrustad med en 18 G nål genom bukhinnan, var försiktig så att du undviker organ och fett.
- Extrahera tvättbufferten, som nu innehåller peritoneala celler, och överför till 15 ml koniskt rör på is.
- Upprepa steg 1.3 och 1.4.
- Skär ett litet hål i bukhinnan medan du håller upp med pincett.
- Sätt in en engångsöverföringspipett i hålet och samla den återstående tvättbufferten, återigen undvika fett och organ.
- Överför de insamlade återstående peritoneala cellerna till 15 ml koniskt rör på is.
OBS: Kassera provet om blodkontamineringen är uppenbar. - Inkubera cellerna på is tills mjälten och benuttaget är klart.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera på supernatanten.
- Återsuspend cellpelleten i 1 ml tvättbuffert.
- Filtrera cellerna genom en 70 μM cellsil till ett rent koniskt rör på 15 ml på is.
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av ett cellräknareinstrument eller hemocytometer.
2. Mjälteskörd och isolering av encelliga celler
- Lägg musen på magen och skär genom bukhinnan på vänster baksida med ren sax. Skär ut mjälten, ta bort fett och bindväv.
- Överför mjälten till ett 1,5 ml mikrocentrifugerör som innehåller 1 ml tvättbuffert på is.
- Inkubera mjälten på is tills benuttaget är klart.
- Flytta mjälten till automatiserad dissociationsrör med 5 ml röd blodcelllysbuffert. Placera röret på vävnadsavsocieringsinstrumentet och separera i 60 s för att skapa en enda cellfjädring.
OBS: Det är också tillåtet att använda andra rutinmetoder för att erhålla encelliga mjälteupphängningar som att krossa mellan frostade glasrutschbanor i tvättbuffert. Om en annan dissociationsmetod används, följ dissociationen med centrifugering, aspiration och sedan resuspension i 5 ml rödblodslysbuffert innan du fortsätter att steg 2,5. - Inkubera cellerna vid rumstemperatur i 3 min.
- Tillsätt 10 ml 4 °C tvättbuffert som innehåller 2mM EDTA.
- Överför till ett rent koniskt rör på 15 ml.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera på supernatanten.
- Återanvänd cellpelleten i 5 ml 4 °C tvättbuffert.
- Filtrera cellerna genom en 70 μM cellsil till ett rent koniskt rör på 15 ml på is.
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av ett cellräknareinstrument eller hemocytometer.
3. BM-skörd och isolering av encelliga celler
- Ta bort huden från den nedre halvan av muskroppen. Trimma överskottsmuskeln från benet. Ta bort hela benet med sax, var försiktig så att du inte skär lårbenet. Rengör lårbenet och skenbenet genom att ta bort återstående muskler, fett och fötter.
- Överför benen till ett 1,5 ml mikrocentrifugerör som innehåller 1 ml tvättbuffert på is.
- Perforera botten av ett 0,5 mL microcentrifuge-rör och lämna ett hål som är tillräckligt litet för att benbenen inte ska sticka ut. Sätt in 0,5 ml-röret i ett rent 1,5 mL microcentrifuge-rör. Klipp av lårbenets ände och skenbenet proximalt mot knäet och placera de skurna ändarna vända nedåt i 0,5 ml-röret.
- Centrifugera cellerna vid 6 780 x g i 2 min vid 4 °C.
- Återsuspend cellpelleten i 1 ml röd blodcellslysbuffert och överför till ett koniskt rör på 15 ml som innehåller ytterligare 3 ml lysbuffert i röda blodkroppar.
- Inkubera vid rumstemperatur i 3 min.
- Tillsätt 10 ml 4 °C tvättbuffert som innehåller 2mM EDTA.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 8 min vid 4 °C. Aspirera på supernatanten.
- Återsuspend cellpelleten i 3 ml 4 °C tvättbuffert.
- Filtrera celler genom en 70 μM cellsil till ett rent koniskt rör på 15 ml på is.
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av ett cellräknareinstrument eller hemocytometer.
4. Fläckceller och förbered ersättning
- Aliquot 106 celler av varje celltyp från varje djur till en 96 brunn U bottenplatta.
- Se till att inkludera tillräckligt med brunnar för alla prover och kontroller, inklusive full fläck, fluorescens-minus-en (FMO), oförståelig och slutligen den valfria enfärgskompensationen för varje fluorofor som används.
- För BM mognadspanelen och mjältens mognadspanel, alikvotceller i 2 brunnar, 106 celler per brunn, för varje fullständigt fläckprov. Lägg till 2 x 106 celler av varje celltyp i enskilda brunnar för enfärgskontrollerna för kompensationsvinabilitet.
- Centrifugera plattan vid 845 x g i 2 min vid 4 °C. Dekantera supernatanten genom att snabbt invertera och snärta plattan över ett handfat, var försiktig så att du inte korskontaminerar brunnar.
- Återanvänd cellerna i 200 μL DPBS (utan BSA eller FBS). Detta steg är viktigt för att ta bort protein före färgning med aminreaktivt livskraftfärgämne.
- Upprepa steg 4.2 och 4.3.
- Upprepa steg 4.2.
- Återanvänd cellerna i 100 μL-bärkraftsfärg utspädd 1:1 000 i DPBS.
OBS: Om du använder celler för enfärgskompensation ska du inte tillsätta livskraftfärg till dessa brunnar.- För varje fläckuppsättning, lämna flera oförstudade brunnar för ett helt oförstämt prov och andra kontroller du kan behöva.
- För varje fläckuppsättning, lämna en extra oförståelig brunn för livskraften FMO-kontrollen.
- För enfärgskompensationskontrollerna: Återanvänd de 2 x 106 cellerna, alikvoterade i steg 4.1, i 200 μL utspädd livskraft. Överför 100 μL celler till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör, värm celler i 5 min vid 65 °C och överför de 100 μL värmedödade cellerna tillbaka till den ursprungliga brunnen med de 100 μL återstående levande cellerna.
- Inkubera celler vid 4 °C, skyddade mot ljus, i 30 minuter.
- Centrifugera plattan vid 845 x g i 2 min vid 4 °C. Dekantera supernatanten genom att snabbt invertera och snärta plattan över ett handfat, var försiktig så att du inte korskontaminerar brunnar.
- Återanvänd cellerna i 200 μL DPBS (utan BSA eller FBS).
- Upprepa steg 4.8 och 4.9.
- Upprepa steg 4.8.
- Återanvänd cellerna i 50 μL fc-block utspädd 1:50 (slutlig koncentration=10 μg/ml) i fläckbuffert (0,5% BSA i DPBS [vol/vol]).
- För peritonealceller - tillsätt också 5 μL monocytblockerare för att minska icke-specifik färgning.
- Inkubera cellerna vid 4 °C, skyddade mot ljus, i 15 minuter.
- Förbered fullständiga fläckmasterblandningar och fmos i fläckbuffert för en slutlig volym på 100 μl per 106 celler. Se tabell 1-tabell 4 för antikroppslistorna.
OBS: FMOs tillverkas genom att inkludera alla antikroppar i en fläckuppsättning utom en. Förbered en FMO för varje antikropp i en fläckuppsättning. När en fläckuppsättning innehåller flera briljanta färgämnen, byt ut 50 μL briljant fläckbuffert mot fläckbuffert per prov - Utan att ta bort Fc-blocket, tillsätt 100 μL full fläckblandningar och FMOs till utvalda brunnar.
- Förbered enfärgskompensationskontroller för varje antikropp i en fläckuppsättning.
- Följ tillverkarens anvisningar för användning om du använder kompensationspärlor.
- Om du använder celler, tillsätt titrerad antikropp till 106 celler, reserverade tidigare i steg 4.6.1 utan livskraftsfärg, i 100 μL fläckbuffert. Om alla celler i provet är positiva för en viss markör, avsätt oförstätliga celler som ska användas vid insamling av kompensationsdata på flödescytometern.
- Inkubera cellerna och pärlorna vid 4 °C, skyddade mot ljus, i 30 minuter.
- Centrifugera plattan vid 845 x g i 2 min vid 4 °C. Dekantera supernatanten genom att snabbt invertera och snärta plattan över ett handfat, var försiktig så att du inte korskontaminerar brunnar.
- Återanvänd cellerna och pärlorna i 200 μL fläckbuffert.
- Upprepa steg 4.18 och 4.19 två gånger.
- Upprepa steg 4.18.
- För att fastställa proverna för analys inom 48 h, återanvänd celler och pärlor i 200 μL av 2% paraformaldehyd i DPBS.
VARNING: Parafomaldehyd är en allvarlig hälsorisk och brandfarlig. Se databladet Safty före användning. - Inkubera cellerna och pärlorna vid 4 °C, skyddade mot ljus, i 30 minuter.
- Upprepa steg 4.18 och 4.19 två gånger.
- Placera en filterplatta över en ren 96 väl U-bottenplatta. Överför varje prov till en brunn på filterplattan med hjälp av en multipipett.
- Centrifugera filterplattan-96 väl U-bottenplatta inställning vid 845 x g i 2 min vid 4 °C. Ta bort filterplattan och dekantera supernatanten genom att snabbt invertera och snärta plattan över ett handfat, var försiktig så att du inte korskontaminerar brunnar.
- För BM- och mjältemognadspanelerna återanvänd de helt färgade cellerna i 100 μL fläckbuffert. Kombinera de 2 brunnarna för varje djur i 1 brunn. Återanvänd de återstående panelerna, fmos och kontroller i 200 μL fläckbuffert.
- Inkubera fasta celler och pärlor vid 4 °C, skyddade mot ljus, över natten.
5. Förvärv av flödescytometriska data
- Initiera och QC flödescytometern enligt tillverkarens instruktioner.
- Läs in mallen som är specifik för varje panel.
- Innan du registrerar data bör du se till att alla händelser för varje prov är i skala och synliga på prickdiagramna.
- Registrera kompensationskontroller för varje fläckpanel med hjälp av enstaka fläckkompensationer som bereds i steg 4.16. Ställ in positiva och negativa portar för varje prov. Låt programvaran beräkna kompensationsmatrisen.
- Börja skaffa det första provet och se till att grindarna är lämpliga.
- Ställ in att maskinen registrerar minst 50 000 B-cellhändelser för cellpanelen peritoneal B och mjältepanelen Igκ och Igλ. 150 000 B-cellhändelser för BM-mognadspanelen; och 300 000 B-cellhändelser för mjältens mognadspanel.
- För varje fläckpanel, kör och registrera de helt färgade proverna för varje djur, ett oförseelseväckande prov och de icke-registrerade.
6. Analysera data
- Fortsätt med dataanalys med hjälp av programvara för flödescytometrianalys. Följ gatingstrategierna i figur 1, figur 2, figur 3,figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi gatingstrategin för att karakterisera B-cellutveckling i musperifonum, BM och mjälte. Grunden för analysen bildas kring begreppet färgning med livskraftfärg, sedan gating ut dubbletter baserade på Forward-Scatter-Area (FSC-A) och Forward-Scatter-Height (FSC-H), och slutligen gating ut skräp genom att välja celler enligt deras FSC-A och Side-Scatter-Area (SSC-A) egenskaper, som här kallas storleksporten, som återspeglar relativ cellstorlek och cellgranularitet, innan man gating på befolkning av intresse.
Flödescytometrisk analys av peritoneala B-celler visar frekvenserna av livskraftiga peritoneala celler, totala B-celler, B-1 och B-2 undergrupper, liksom B-1a- och B-1b-celler i C57BL/6J-möss (figur 1), med hjälp av en färgpanel som beskrivs i tabell 1. Genomsnittligt absolut cellantal för dessa frekvenser visas i tabell 5. Störningar i B-1-celler kan avgränsas genom fördelning av cellundergrupper, antingen efter cellfrekvens eller absolut celltal per mus.
Flödescytometrisk analys av BM B-celler visar frekvenserna av livskraftiga BM-celler, totala B-celler, frakta B (pre-pro-B-celler och kontaminerande lymfocyter), pre-pro-B-celler, fraktion B, fraktion C, fraktion D, omogen (delmängd i fraktion E), övergångsceller (delmängd i fraktion E) och fraktioner F B-celler i C57BL/6J-möss (figur 2), med hjälp av en färgpanel som beskrivs i tabell 2. Genomsnittligt absolut cellnummer för dessa frekvenser visas i tabell 6. Störningar i BM B-celler kan avgränsas genom fördelning av cellundergrupper, antingen efter cellfrekvens eller absolut celltal per ben.
Flödescytometrisk analys av mjälte B-celler visar frekvenserna av livskraftiga mjälteceller, totala B-celler, övergångs B-celler, T1, T2, T3-celler, mogna B-celler, follikulära I-celler (Fol I), follikulära II (Fol II) celler, marginalzon (MZ) prekursorceller, mogna MZ-celler och B-1-celler i C57BL/6J-möss (figur 3), med hjälp av en färgpanel som beskrivs i tabell 3. Genomsnittligt absolut cellantal för dessa frekvenser visas i tabell 7. Störningar i mjälte B-celler kan avgränsas genom fördelning av cellundergrupper, antingen efter cellfrekvens eller absolut celltal per mjälte.
På samma sätt visar flödescytometrisk analys av mjälten frekvenserna av Igκ+ och Igλ + B-celler i C57BL/6J-möss (figur 4), med hjälp av en färgpanel som beskrivs i tabell 4. Genomsnittligt absolut cellnummer för dessa frekvenser visas i tabell 8. Störningar i Igκ+ och Igλ+ Bcells kan avgränsas genom fördelning av cellundergrupper, antingen efter cellfrekvens eller absolut celltal per mjälte.
| Antikropp | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD11b | BV711 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
Tabell 1: Peritoneal B-cellpanel
| Antikropp | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | 1B11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-F1 |
| C-Kit | BUV395 | 2B8 |
| BP-1 | BV786 | BP-1 |
| CD93 | BV711 | AA4.1 |
| dumpa kanal | ||
| CD3 | AF700 | 17-A2 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | AF700 | RB6-8C5 |
| Ter119 | AF700 | TER-119 |
Tabell 2: Benmärgsmognadspanel
| Antikropp | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD21/35 | BV421 | 7G6 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
| CD93 | PE | AA4.1 |
Tabell 3: Mjältemognadspanel
| Antikropp | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD3 | PB | 17-A2 |
| Kappa | FITC | 187.1 |
| Lambda | PE | RML-42 |
Tabell 4: Mjälte Igκ och Igλ Panel
Figur 1: Karakterisering av B-cellpopulationer i bukhinnan. Livskraftiga, encelliga, storlek gated peritoneal B celler separeras först från förorenande celler genom gating på IgM + celler. B-1- och B-2-celler skiljer sig sedan från varandra genom frånvaro (B-1) eller förekomst av CD23 (B-2). Nästa CD5-uttryck används för att avgränsa B-1a-celler (CD5+) från B-1b-celler (CD5-). FMOs användes för att empiriskt bestämma var man ska rita grindar. Tal är procentandelar av varje population inom samma densitetsdiagram. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Karakterisering av B-cellundergrupper i BM. Livskraftiga, encelliga, storlek gated BM B celler separeras från icke-B celler genom gating på B220 + dump- (där dumpning hänvisar till CD3 / GR-1 /CD11b / TER119) celler. CD43- och B220-uttryck definierar ytterligare Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) och Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++). Fraktion A-C' separeras ytterligare genom uttryck av BP-1 och CD24. Fraktion A (BP-1- CD24-) motsvarar pre-pro-B-celler tillsammans med kontaminerande celler. För att separera pre-pro-B-celler från förorenande celler i fraktion A används uttrycket av CD93 och frånvaron av CD19. Fraktion B (BP-1- CD24int) och fraktion C (BP-1+ CD24int) motsvarar tidiga respektive sena pro-B-celler, respektive Fraktion C' (BP-1+/- CD24+) motsvarar tidiga pre-B-celler. För att separera Fraktion D-F används uttryck för IgM och IgD. Fraktion D motsvarar sena pre-B-celler (IgM-/låg IgD-); Fraktion E (blå grind, IgMint/hög IgD-) till både omogna (Imm, IgMint IgD-) och övergångsceller (Tran, IgMhigh IgD-) B. och Fraktion F (IgMint/high IgD+) för att återcirkulera mogna B-celler. FMOs användes för att empiriskt bestämma var man ska rita grindar. Tal är procentandelar av varje population inom samma densitetsdiagram. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Karakterisering av mjälte B-cellmognad. Livskraftiga, encelliga, storlek gated mjälte B-celler separeras från icke-B-celler genom gating på B220 + celler. För att identifiera B-1-delmängd identifieras och definieras CD23- CD19+-celler genom uttryck för CD43. För att klassificera B-2-populationer separeras CD19+-celler i övergångsceller (CD93+ B220+) och mogna (CD93- B220+) B-celler. Övergångsceller (CD93+ B220+) är vidare indelade i populationer av T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) och T3 (IgMint CD23+). Mogna (CD93- B220+) celler är uppdelade i marginell zon (CD21/35+ IgM+) och follikulära (CD21/35int IgMint/+) B-celler. Uttrycket av CD23 används vidare för att separera MZ-prekursorceller (CD23+ B220+) från mer mogna MZ-celler (CD23- B220+). Follikulära populationer avgränsas sedan till Fol I -celler (IgD+ IgMint) och Fol II (IgD+ IgM+). FMOs användes för att empiriskt bestämma var man ska rita grindar. Tal är procenttal för varje population inom samma densitetsdiagram Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Figur 4: Igκ och Igλ uttryck av splenic B celler. Livskraftiga, encelliga, storlek gated mjälte B-celler separeras från icke-B-celler genom gating på B220 + CD3-celler. B-celler utmärks sedan av uttrycket Igλ och Igκ. Tal är procentandelar av varje population inom samma densitetsdiagram. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Absolut cellnummer | |||||
| Djurnummer | Livskraftiga peritoneala celler | B-celler | B-1a celler | B-1b celler | B-2 celler |
| 1 | 1.02E+07 | 4.67E+06 | 1.28E+06 | 8.95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92E+06 | 4.52E+06 | 1.49E+06 | 9.60E+05 | 1.91E+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56E+06 | 1.71E+06 | 9.19E+05 | 1.78E+06 |
| Genomsnitt | 1.05E+07 | 4.58E+06 | 1.49E+06 | 9.25E+05 | 2.01E+06 |
Tabell 5: Absoluta cellnummer för peritoneal B-cellundergrupper
| Absolut cellnummer | |||||||||||
| Djurnummer | Livskraftiga benmärgsceller | B-celler | Bråk A | Pre-pro | Bråk B | Bråk C | Fraktion C' | Bråk D | Omogen | Övergångs | Bråk F |
| 1 | 5.05E+07 | 9.70E+06 | 1.13E+06 | 1.95E+05 | 2.22E+05 | 9.14E+04 | 6.31E+05 | 1.59E+06 | 4.56E+05 | 7.81E+05 | 4.03E+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03E+07 | 1.14E+06 | 2.29E+05 | 2.89E+05 | 1.22E+05 | 8.40E+05 | 2.11E+06 | 5.39E+05 | 8.07E+05 | 3.67E+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1.01E+07 | 1.10E+06 | 2.12E+05 | 2.84E+05 | 1.05E+05 | 9.02E+05 | 2.72E+06 | 5.94E+05 | 7.62E+05 | 2.59E+06 |
| Genomsnitt | 5.46E+07 | 1.00E+07 | 1.12E+06 | 2.12E+05 | 2.65E+05 | 1.06E+05 | 7.91E+05 | 2.14E+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43E+06 |
Tabell 6: Absoluta cellnummer av benmärg B-cellundergrupper
| Absolut cellnummer | ||||||||||||
| Djurnummer | Livskraftiga mjälteceller | B-celler | B-celler under övergång | T1-celler | T2-celler | T3-celler | Mogna B-celler | Follikulära I-celler | Follikulära II-celler | Marginalzonceller för prekursorer | Mogna marginalzonceller | B-1 celler |
| 1 | 9.16E+07 | 4.61E+07 | 3.66E+06 | 1.55E+06 | 1.10E+06 | 7.16E+05 | 4.06E+07 | 2.39E+07 | 5.27E+06 | 2.17E+06 | 3.98E+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.18E+07 | 4.88E+06 | 1.97E+06 | 1.57E+06 | 1.00E+06 | 4.49E+07 | 2.68E+07 | 7.33E+06 | 3.42E+06 | 3.84E+06 | 8.15E+05 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.34E+07 | 4.64E+06 | 1.98E+06 | 1.41E+06 | 8.54E+05 | 4.62E+07 | 2.81E+07 | 5.84E+06 | 3.58E+06 | 4.02E+06 | 1.01E+06 |
| Genomsnitt | 9.77E+07 | 5.04E+07 | 4.39E+06 | 1.83E+06 | 1.36E+06 | 8.58E+05 | 4.39E+07 | 2.63E+07 | 6.15E+06 | 3.06E+06 | 3.94E+06 | 9.02E+05 |
Tabell 7: Absoluta cellnummer för Splenic B Cell-delmängder
| Absolut cellnummer | ||||
| Djurnummer | Livskraftiga mjälteceller | B-celler | Igκ+ B-celler | Igλ+ B-celler |
| 1 | 9.16E+07 | 4.97E+07 | 4.51E+07 | 2.46E+06 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.63E+07 | 5.08E+07 | 3.16E+06 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.91E+07 | 5.33E+07 | 3.24E+06 |
| Genomsnitt | 9.77E+07 | 5.50E+07 | 4.97E+07 | 2.95E+06 |
Tabell 8: Absoluta cellnummer för Igκ- och Igλ B-cellundergrupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flöde cytometrisk analys av lymfoida och icke-lymfoida vävnader har möjliggjort samtidig identifiering och uppräkning av B-cellsunderpopulationer hos möss och människor sedan 1980-talet. Det har använts som ett mått på humoral immunitet och kan tillämpas ytterligare för att utvärdera B-cellsfunktionalitet. Denna metod utnyttjar reagenstillgänglighet för att bedöma olika stadier av B-cellmognad hos möss och människor, genom samtidig analys av flera parametrar som möjliggör bedömning av B-cells heterogenitet, även i sällsynta populationer. Om det används för att mäta komplexa heterogena prover kan det upptäcka delpopulationer inom några minuter, på enskilda celler33. Sekventiell gating analys strategi, oftast tillämpas på flöde cytometrisk analys, kan vara enkel och intuitiv när en viss population måste identifieras34. Slutligen är en annan fördel med flödescytometri att den är lätt att anpassa i de flesta akademiska laboratorier, under ledning av erfarna användare. Vårt protokoll beskriver framgångsrikt bedömning av B-cellpopulationer i bukhinnan, BM och mjältar av möss, genom att beskriva och räkna upp B-1 populationer och gräva i utvecklingen av B-2 pro-B celler, pre-B celler, omogna, övergångs- och mogna B-celler, liksom deras ytan uttryck av Igκ eller Igλ ljuskedjor. Flödescytometri är den mest använda, och enklaste metoden att tillämpa, när man undersöker B-cellsutveckling hos möss.
Medan flödescytometri genererar ovärderliga data, finns det vissa gränser för denna teknik när den används för att undersöka heterogeniteten hos immun B-cellfacket. Enorma datamängder kan vara överväldigande eftersom 10 färgfärgning gör det möjligt att känna igen mer än 1 024 olika cellpopulationer34. Man måste ta hänsyn till att vissa vanliga lymfoida cellmarkörer har visat sig vara mindre specifika än man ursprungligen trodde. Detta kan lösas genom att använda en mängd cellytan markörer för att fastställa gating på önskade populationer. Även om flödescytometrisk analys kan vara enkel och intuitiv, är en annan begränsning för att flöda cytometrisk analys att den vanligtvis tillåter visualisering av endast två parametrar i taget, även om datavisualiseringsverktyg som t-SNE kan användas för att gruppera cellpopulationer mer effektivt när du använder cytometri med högt parameterflöde. En annan viktig begränsning är att de portar som används vid både förvärv och analys ibland är beroende av operatörens subjektivitet.
För en lyckad anpassning eller replikering av detta protokoll finns det flera kritiska parametrar som måste beaktas35. Noggrant övervägande måste beaktas i paneldesign och fluorokromval. Det är absolut nödvändigt att para ihop dim eller viktiga antigener med ljusa fluorokromer. Antikroppstitrering måste utföras för att undvika att överskott av antikroppar binder till celler icke-specifikt, vilket potentiellt ökar bakgrundsfärgning och minskar upplösningen. Antikroppstitrering utförs genom färgning av ett känt antal celler med minskande koncentrationer av antikroppar, för att bestämma det bästa separationsindexet36. Detta bör upprepas för varje mängd antikroppar. Under provberedning och färgning är det viktigt att säkerställa en enda cellfjädring genom att undvika Ca++ och Mg++. Dessutom kan tillägg av EDTA bidra till att förhindra cellaggregering och enzymatisk aktivitet som kan leda till antikroppsmedierad stimilulering och internalisering av märkta markörer. Före datainsamlingen måste proverna avbrytas, filtreras och fritt från aggregat. Spridning av signal från en parameter till en annan löses med hjälp av kompensationskontroller, i form av enfärgade celler eller kommersiellt tillgängliga kompensationspärlor35. En annan viktig faktor är att ha ordentliga kontroller i varje experiment. Oförstuderade celler etablerar baslinjen för autofluorescens. Isotypkontroller anses inte längre vara lämpliga kontroller för gating på grund av icke-specifik bindning. Det viktigaste steget för att hjälpa till att göra exakta grindar är användningen av FMO-kontroller. I en FMO-kontroll finns alla konjugerade antikroppar i fläcken utom det som kontrolleras. FMO-kontroller gör det möjligt att mäta spridningen av alla fluoroforer till den saknade kanalen och gör det därmed möjligt att sätta upp grindar i enlighet därmed. Det är viktigt att tillräckligt med celler förvärvas för ökad noggrannhet. Som en tumregel bör minst 2 000 evenemang av intressepopulationen samlas in. Slutligen bör kompensationskontrollerna, oavsett om de är pärlor eller celler, exakt matchas med de fluorokromer som används och kontrollerna måste vara minst lika ljusa som försöksproverna37.
Sammantaget används låg cytometrisk analys av B-cellfack i stor utsträckning inom immunologiområdet. Denna teknik kan användas för att undersöka störtben i humoral immunitet hos både vilda typer och genetiskt modifierade möss, under icke-sjukdomstillstånd och vid immunologisk utmaning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är anställda och aktieägare i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Vi tackar Matthew Sleeman för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också vivariumoperations- och flödescytometrikärnavdelningarna på Regeneron för att de stöder denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H.
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S.
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M.
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S.
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K.
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P.
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B.
