Summary
Vi præsenterer en praktisk, trin-for-trin, hurtig protokol til fjernelse af musehjerne og dissektion af diskrete områder fra frisk hjernevæv. At opnå hjerneområder til molekylær analyse er blevet rutine i mange neurovidenskabslaboratorier. Disse hjerneområder fryses straks for at opnå transkriptomiske data af høj kvalitet til analyse på systemniveau.
Abstract
Hjernen er kommandocentral for pattedyrs nervesystem og et organ med enorm strukturel kompleksitet. Beskyttet i kraniet består hjernen af et ydre dække af gråt stof over halvkuglerne kendt som hjernebarken. Under dette lag ligger mange andre specialiserede strukturer, der er afgørende for flere fænomener, der er vigtige for eksistensen. Erhvervelse af prøver af specifikke grove hjerneområder kræver hurtige og præcise dissektionstrin. Det er underforstået, at der på mikroskopisk niveau findes mange underregioner og sandsynligvis krydser de vilkårlige regionale grænser, som vi pålægger med henblik på denne dissektion.
Musemodeller bruges rutinemæssigt til at studere menneskelige hjernefunktioner og sygdomme. Ændringer i genekspressionsmønstre kan begrænses til specifikke hjerneområder rettet mod en bestemt fænotype afhængigt af den syge tilstand. Det er således af stor betydning at studere regulering af transkription med hensyn til dens veldefinerede strukturelle organisation. En fuldstændig forståelse af hjernen kræver at studere forskellige hjerneområder, definere forbindelser og identificere nøgleforskelle i aktiviteterne i hver af disse hjerneområder. En mere omfattende forståelse af hver af disse forskellige regioner kan bane vejen for nye og forbedrede behandlinger inden for neurovidenskab. Heri diskuterer vi en trin-for-trin metode til dissekering af musehjernen i seksten forskellige regioner. I denne procedure har vi fokuseret på hanmus C57Bl/6J (6-8 uger gammel) hjernefjernelse og dissektion i flere regioner ved hjælp af neuroanatomiske landemærker til at identificere og prøve diskret funktionelt relevante og adfærdsmæssigt relevante hjerneområder. Dette arbejde vil hjælpe med at lægge et stærkt fundament inden for neurovidenskab, hvilket fører til mere fokuserede tilgange i den dybere forståelse af hjernens funktion.
Introduction
Hjernen udgør sammen med rygmarven og nethinden centralnervesystemet, der udfører kompleks adfærd, styret af specialiserede, præcist placerede og interagerende celletyper i hele kroppen1. Hjernen er et komplekst organ med milliarder af sammenkoblede neuroner og glia med præcise kredsløb, der udfører adskillige funktioner. Det er en bilateral struktur med to forskellige lobes og forskellige cellulære komponenter2. Rygmarven forbinder hjernen med omverdenen og er beskyttet af knogler, hjernehinder og cerebrospinalvæske og dirigerer beskeder til og fra hjernen 2,3,4. Hjernens overflade, hjernebarken, er ujævn og har forskellige folder, kaldet gyri, og riller, kaldet sulci, der adskiller hjernen i funktionelle centre5. Cortex er glat hos pattedyr med en lille hjerne 6,7. Det er vigtigt at karakterisere og studere arkitekturen i den menneskelige hjerne for at forstå de lidelser, der er relateret til de forskellige hjerneområder, såvel som dets funktionelle kredsløb. Neurovidenskabelig forskning er udvidet i de senere år, og en række eksperimentelle metoder bruges til at studere hjernens struktur og funktion. Udviklingen inden for molekylær- og systembiologi har indvarslet en ny æra med udforskning af det komplekse forhold mellem hjernestrukturer og molekylers funktion. Derudover vokser molekylærbiologi, genetik og epigenetik hurtigt, hvilket gør det muligt for os at fremme vores viden om de underliggende mekanismer, der er involveret i, hvordan systemer fungerer. Disse analyser kan udføres på et meget mere lokaliseret grundlag for at hjælpe med at målrette undersøgelsen og udviklingen af mere effektive terapier.
Pattedyrshjernen er strukturelt defineret i klart identificerbare diskrete regioner; imidlertid er de funktionelle og molekylære kompleksiteter af disse diskrete strukturer endnu ikke klart forstået. Hjernevævets flerdimensionelle og flerlagede natur gør dette landskab vanskeligt at studere på funktionsniveau. Hertil kommer, at det faktum, at flere funktioner udføres af samme struktur og omvendt, yderligere komplicerer forståelsen af hjernen8. Det er afgørende, at den eksperimentelle tilgang, der udføres til strukturel og funktionel karakterisering af hjerneområder, bruger præcise forskningsmetoder til at opnå konsistens i prøveudtagning for korrelerende neuroanatomisk arkitektur med funktion. Hjernens kompleksitet er for nylig blevet forklaret ved hjælp af enkeltcellesekventering 9,10, såsom den tidlige gyrus i den menneskelige hjerne, der består af 75 forskellige celletyper11. Ved at sammenligne disse data med dem fra en analog region i musehjernen afslører undersøgelsen ikke kun ligheder i deres arkitektur og celletyper, men præsenterer også forskellene. For at opklare de komplekse mekanismer er det derfor vigtigt at studere forskellige områder af hjernen med fuld præcision. Bevarede strukturer og funktion mellem en menneske- og musehjerne muliggør brugen af en mus som en foreløbig surrogat til belysning af menneskelig hjernefunktion og adfærdsmæssige resultater.
Med udviklingen af systembiologiske tilgange er indhentning af information fra diskrete hjerneområder hos gnavere blevet en nøgleprocedure inden for neurovidenskabelig forskning. Mens nogle protokoller såsom laser capture mikrodissektion12 kan være dyre, er mekaniske protokoller billige og udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige værktøjer13,14. Vi har brugt flere hjerneområder til transkriptomiske assays15 og har udviklet en praktisk og hurtig procedure til at dissekere musehjerneområder af interesse på en trinvis måde på kort tid. Når dissekeret, kan disse prøver opbevares straks under kolde forhold for at bevare nukleinsyrer og proteiner i disse væv. Vores tilgang kan udføres hurtigere, hvilket fører til høj effektivitet og giver mindre chancer for vævsforringelse. Dette øger i sidste ende chancerne for at generere reproducerbare eksperimenter af høj kvalitet ved hjælp af hjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrehåndterings- og forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med europæiske, nationale og institutionelle retningslinjer for dyrepleje. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved US Army Center for Environmental Health Research nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) og udført i et anlæg akkrediteret af Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
BEMÆRK: Proceduren vil blive udført på seks til otte uger gamle hanmus af C57BL/6j-stammen aflivet ved cervikal dislokation16. Ingen perfusioner udføres i vores laboratorium, men denne protokol kunne ændres, hvorved perfusioner for at rydde blod fra vaskulaturen kunne udføres. Alle forsyninger, der kræves til dissektionen, er angivet i materialetabellen. Dissektionen er opdelt i tre komponenter, herunder fjernelse af hjernen, fjernelse af hypofysen og hjernedissektion. Hensigten med hjernevævsindsamling er at behandle dem til transkriptomiske assays efter RNA-ekstraktioner. Så snart hjerneområdet er dissekeret, overfører vi straks hvert af hjerneområderne til et allerede mærket frysehætteglas og opbevarer derefter hætteglasset i flydende nitrogen eller -80 °C.
BEMÆRK: Indgående kendskab til neuroanatomi er afgørende for at udføre denne procedure. Vandrette og langsgående sektioner samt de sædvanlige tværgående sektioner bør studeres og læres. Da hjernevæv nedbrydes meget hurtigt, er der ikke tid til at konsultere et atlas, mens du udfører denne procedure.
1. Fjernelse af musehjerne
- Klem maxillaen af det halshuggede hoved med en hæmostat (figur 2i) og brug en gasbind til at reflektere hovedbunden rostralt yderligere og skabe et tørt felt på kraniets dorsum (figur 2ii).
- Indsæt den fine buede saks i foramen magnum for at adskille de klæbende hjernehinder. Her indsættes saksen ved åbningen på bunden af kraniet er foramen magnum, hvor rygmarven passerer med bladet pegende lodret (klokken 12 position), men parallelt med og presser mod den indre overflade af basalpladebenet (dvs. occipital squama) og roterer bladet femogfyrre ° til venstre side og derefter til højre side.
- Fortsæt med at dreje håndleddet for at lirke basalpladebenet af, der vil klippe op i midten af den resterende knogle, der fortsætter ind i den occipitale knogle og intraparietale knogler, der lirker knoglerne til venstre og højre, indtil de fjernes. På lignende måde skal du fjerne den occipitale knogle og den intraparietale knogle for at udsætte cerebellum.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan den hule knoglestruktur kaldet tympanic bullae, på den ventrale bageste del af kraniet, der omslutter dele af mellem- og indre øre, fjernes, medmindre man dissekerer hypofysenes bageste og forreste lober (figur 2iii). - Fjern muskelfastgørelserne til den tidsmæssige højderyg ved hjælp af et buet skarpt sakseblad. Placer en lem af den buede skarpe saks under lambdoid suturen, der trænger ind i krydset mellem de tværgående og sagittale bihuler (figur 2iv).
- Skub saksen rostralt langs midsagittal suturen op til bregmaen og skær den meget forsigtigt, mens den forsigtigt løftes opad for at undgå laceration af cerebral cortices. Dette er et kritisk trin i proceduren (figur 2v).
- På dette trin løftes og roteres parietalbenene og skraber således den indre overflade af knoglen for at identificere og skære resterende meningeale vedhæftede filer. Tag fat i den temporale knogle, der lirker udad, væk fra hjernen. Fjern frontbenet fra hver side ved hjælp af buet saks eller en rongeur ind i kredsløbet og skær koronalt i en ret vinkel til orbitalryggen, men ikke længere end midterlinjen (figur 2vii).
- Lav to snit parallelt og ca. 4 mm fra hinanden i sagittalplanet (figur 2viii).
BEMÆRK: Skær ikke begge sider med et enkelt slag. - Fjern fragmenterne af frontalbenet og undgå at lacerere hjerneoverfladen (figur 2ix). På dette tidspunkt skal du bruge en fin saks til at skære dura mater, som skal være tilgængelig mellem de olfaktoriske pærer.
- Vend forsigtigt kraniet for at tillade tyngdekraften at hjælpe med at fjerne hjernen, mens du fortsætter med at identificere og skære resterende meningeale vedhæftede filer og kraniale nerver. Hjernen frigives ved at skære den største trigeminusnerve, der er knyttet til hjernen, og er tydeligt synlig, der strækker sig fra bunden af calvarium (figur 2x).
BEMÆRK: Overfør hjernen til en kold saltopløsning (iskold RNasefrit natriumcitrat (0,9%) eller fysiologisk (0,9%) saltvand) til yderligere dissektion.
2. Dissektion af de forreste og bageste hypofyser
BEMÆRK: Hypofysen er dækket af en meget hård teltlignende membran med en højderyg, der løber sideværts mellem venstre og højre trigeminusnerver. Disse strukturer er ekstremt bløde og delikate, og som sådan anbefales det, at hypofysenes bageste og forreste lober dissekeres separat i trin, in situ, direkte fra kraniet. Umiddelbart efter dissektion overføres den respektive hypofyse til et formærket hætteglas og opbevares hætteglasset i flydende nitrogen, helst ellers -80 °C. Hypofysen hviler nøjagtigt over krydset mellem occipitale og basisphenoid knogler; hvis de bøjer, forstyrres hypofysearkitekturen.
- Hold den auditive bullae intakt for at sikre, at hypofysens anatomi er intakt og let identificerbar (figur 2ix).
- Dissekere den bageste lap af hypofysen efterfulgt af hypofysens forreste lap fra resten af kraniet.
- Lav et ekstremt lille parasagittalt snit på begge sider i ryggen af det membranøse telt og løft hypofysens bageste lobe med ultrafine tang, idet du sørger for ikke at forstyrre det forreste hypofysevæv (figur 2x).
- Lav et sagittalt snit mellem laterale margener af hypofysens forreste lobe og den nærmeste trigeminusnerve og løft den forreste lap af hypofysen derefter (figur 2x).
3. Dissektion af musehjerne
BEMÆRK: Umiddelbart efter fjernelse af hjerne og hypofyse udføres yderligere dissektion på en forkølet rustfri stålblok (figur 3). Efter dissektion overføres hjerneområderne til formærkede hætteglas og hætteglassene fortrinsvis til flydende nitrogen ellers -80 °C. Strukturer produceret ved top-down-metoden (i kronologisk rækkefølge) omfatter potentielt følgende: lillehjernen (CB), hjernestammen/baghjernen (pons og medulla oblongata) (HB), olfaktoriske pærer (OB) som tilbehørs olfaktoriske pærer, mediale præfrontale cortex (MPFC), lateral præfrontal cortex (FCX), anterior og posterior corpus striatum (ST), ventral striatum (VS) bestående af nucleus accumbens (NAC) og olfaktorisk tuberkel (OT), septum (SE), præoptisk område, piriform cortex (PFM), hypothalamus (HY), amygdala (AY), hippocampus (HC), posterior cingulate cortex (CNG), entorhinal cortex (ERC), mellemhjernen (MB) med thalamus og resten af hjernebarken (ROC) (tabel 1). Specifikke regioner vil blive diskuteret i rækkefølge af isolation, der arbejder med en enkelt halvkugle.
- Vær meget omhyggelig med at fjerne hjernen fra calvarium, da landemærkerne kan blive ødelagt, hvis der er flænger. På dette trin skal du udføre alle dissektioner ved hjælp af ansigtsbeskyttelse, specifikt et 7x juvelervisir, og belysning vil blive tilvejebragt af kirurgiske lamper placeret over hver af dissectorens skuldre. Meget af dissektionen vil blive udført ved hjælp af stump tilstand små buede tang (dvs. Graefe tang).
- Placer hjernen på en blok af rustfrit stål (figur 4i og figur 4ii). Hold blokken kold ved at omgive den med is og en iskold saltopløsning. Fugt regelmæssigt vævet med iskold saltopløsning for at bevare strukturerne.
- Placer hjernen således, at hjernekroppen vender opad. Brug små buede tang til forsigtigt at reflektere CB ved at udsætte de overlegne, midterste og ringere cerebellære peduncles og fjerne CB (figur 4iii og figur 4iv).
- Lav et midsagittal snit startende fra dorsum og mellem OB og cerebral halvkugler (figur 4v) og sørg for ikke at strække sig længere end den forreste kommission. På dette tidspunkt kan vermis let adskilles fra de laterale dele, og HB opnås ved en koronal skæring ved den forreste margen af pons.
- Adskil medulla med et koronalt snit i den bageste kant af pons.
BEMÆRK: På dette tidspunkt vil diencephalon, den bageste del af forhjernen indeholdende epithalamus, thalamus, hypothalamus og ventral thalamus og den tredje ventrikel, blive vendt ventral side opad, og et midsagittal snit vil blive lavet fra den optiske chiasm rostralt. Dissektion af cerebrale halvkugler efterfulgt af fjernelse af OB fra en af halvkuglen vil være på dette trin (figur 4v og figur 4vi). - Adskil de cerebrale halvkugler (figur 4v), før diencephalon dissekeres yderligere (figur 4v). Den dorsale tilgang vil blive anvendt ved omhyggelig stump dissektion for at bevare de kritisk fremtrædende midterlinjemærker. Visualiser hver interhemisfærisk forbindelse, før du afbryder dem, da dette minimerer muligheden for at afvige fra midterlinjen.
BEMÆRK: På dette trin kan en af hjernehalvdelen (Hemibrain) bevares, og den anden halvkugle kan bruges til yderligere dissektion - Slip de lukkede knive af en lille, buet tang under corpus callosum og spred forsigtigt for at trække neocortex bilateralt tilbage. Corpus callosum er et bredt bånd af nervefibre, der forbinder de to halvkugler, som vil blive dissekeret ved at klemme med tangen uden at forstyrre midterlinjestrukturerne, der ligger nedenunder.
BEMÆRK: Mesiale ansigter på halvkuglerne vil have flere vartegn synlige, såsom myelinerede strukturer som genu af corpus callosum, fornices og den forreste kommission. Selvom det er et par millimeter lateralt til midterlinjen, kan mammillothalamuskanalen og fasciculus retroflexus også være synlige. - Skær de mange strukturer, der krydser midterlinjen. Dette vil omfatte corpus callosum, anterior commissionmissure, ventral fornix commissionmissure, posterior commissionmissure, dorsal fornix commissionmissure, supra mammillær decussation, superior colliculus commissionmissure, ventral fornix commissionmissure og periventrikulære thalamiske fibre.
- Vær særlig forsigtig på dette trin i eller nær midterlinjen, der kan blive delvist kompromitteret af den dorsale tilgangsmetode. Alle opfølgningsstrukturer er i fare, hvis de ikke udføres omhyggeligt.
- Fjern OB (kileformet og lysere farve) og tilbehørs olfaktoriske pærer efterfulgt af indsamling af MPFC (cingulate cortex area 1, prelimbic, infralimbic, medial orbital og sekundære motor cortices [M2]) og FCX af et koronal snit, der er lavet 1 mm anterior til genu af corpus callosum (figur 4vii). Divider den resulterende sektion med et parasagittalt snit 1/3 af afstanden fra medialen til den laterale overflade, hvilket giver MPFC medialt og resten af FCX lateralt. Den cingulære cortex er museanalogen af MPFC.
BEMÆRK: Denne vævsskive vil også indeholde en lille mængde af M2 (sekundær motor cortex) 17 og er uundgåelig. - Lav et koronalt snit på niveauet for den forreste kommission, der fører til synlighed af pars forreste lem af den forreste kommission i tværsnittet på rostralfladen af den resulterende koronale sektion, mens den tværgående del vil blive afsløret i sektionens kaudale overflade Dette er et bekræftende vartegn for NAC18. VS består af NAC og OT.
BEMÆRK: Der er en forreste lem ud over det tværgående segment i den forreste kommission, og det kaldes anterior commissure, pars anterior. - Delvist skåret vandret gennem den tværgående del af den forreste kommission fra midterlinjen under det forreste horn i den laterale ventrikel for at frigøre septalkernen dorsalt og VS ventralt. Fjern den lille mængde cortex fra den laterale overflade, hvor NAC og OT fjernes.
- Adskil den rostrale del af ST fra den overliggende cortex via buet skalpelskæring lige uden for den eksterne kapsel, idet du sørger for ikke at inkludere striatalvæv i den kortikale prøve. På dette tidspunkt vil septalkernerne /SE være synlige og let kan tages fra denne skive (figur 4viii).
BEMÆRK: PFM's forreste og bageste grænser er defineret af imaginære koronaplaner, der er i overensstemmelse med henholdsvis den forreste kommission og mammillære kroppe. Den mediale grænse er defineret af den eksterne kapsel18. - På den laterale overflade af den resterende hemi-sektion af diencephalon foretages et delvist vandret snit langs rhinal sulcus, der strækker sig kaudalt, men kun så langt som det imaginære koronale plan niveau med mammillærlegemerne. Lav et delvist koronalt snit, der strækker sig medialt 1 mm fra den laterale kortikale overflade i planet af HY's mammillære kroppe. Her vil para-sagittal snit i claustrumets plan frigøre PFM (figur 4ix og figur 4x).
BEMÆRK: På den mediale overflade af den resterende hemi-sektion af diencephalon vil adskillige anatomiske træk være synlige, herunder mammillære kroppe, fasciculus retroflexus og stria medullaris. Et halvcirkelformet mønster (dorsal konkav side) vil være synlig, hvilket angiver margenen mellem thalamus og HY. HY vil let kunne identificeres på den midsagittale sektionsvisning i henhold til den optiske chiasm anteroventralt og forreste kommission anterodorsalt og mammillarlegemerne sammen med fasciculus retroflexus posteriorly. Sidstnævnte landemærker er blevet vist godt i atlas17 såvel som i albinomusens forhjernekontekst19. - Lav en delvis koronal skåret posterior til mammillære kroppe, der kun strækker sig så langt lateralt som hypothalamus sulcus. På dette tidspunkt frigør et parasagittalt snit langs længden af hypothalamus sulcus nu HY .
- Medføre eversion af den laterale ventrikel for at afsløre yderligere intra-limbiske forbindelser og de resterende limbiske systemkomponenter. Når man ser den mediale overflade af den resterende hemi-sektion af diencephalon, vil buede tang være den bedste mulighed, da de giver teknikeren mulighed for at manipulere omkring andre sarte sektioner i det omkringliggende område, der bruges til at skære fornix og indsættes i den laterale ventrikel og forsigtigt udvides ved hjælp af stump dissektion for at åbne ventriklen og rotere HC 90° fra lodret til vandret plan. Det kan være nødvendigt at bruge #11 bladet til at skære choroidal arterien / choroid plexus, da den spidse spids kan hjælpe med præcise snit.
- CNG'en drejes 90° (men i modsat retning af HC) for at være i vandret plan. Brug pincet til forsigtigt at dreje HC yderligere 180 ° udad og sideværts, hvilket vil gøre DEN INDRE OVERFLADE AF ERC synlig og vende opad.
- En viftelignende stråling af myelinerede fibre, der stammer fra ERC , vil blive set konvergere for at danne vinkelbundtet, herunder perforantbanen og dens fastgørelse til HC. Drej thalamus og MB 180 ° dorsalt for at afsløre AY.
- Løft om nødvendigt den optiske kanal for at afsløre fastgørelsen af stria terminalis, da den vil indeholde bånd af fibre, der løber langs den laterale kant af thalamus ventrikulære overflade til AY og vil gøre konturerne af AY klare.
BEMÆRK: HC og fornix vil være tydeligt synlige i deres helhed, indlejret i den laterale ventrikel og kan let løftes ud. Den laterale ventrikel vil være foret med pia mater, og fan-lignende oprindelse af perforantstien gennem det meget gennemsigtige subpiale aspekt af ERC vil være synlig20. - Den ydre overflade af mediale ERC vil have et synligt fremtrædende lag af store pyramideceller. Derudover vil en tæt konvergens af Golgi-farvningsfibre være et fremtrædende træk i den mediale ERC. I denne dissektionsprocedure, efter everting af lateral ventrikel, vil disse fibre være let synlige på den mediale overflade gennem pia mater, som linjer de indre overflader af ventriklerne og danner en meget fremtrædende ventilatorlignende struktur.
- Bemærk, at fibrene samler sig subpialt, falder ned og forlader den ventrale ERC, strækker sig bagud og derefter stiger lodret op for at perforere HC. Denne viftelignende struktur i EFR vil blive brugt til at definere margenerne med henblik på dissektion. Identificer og fjern i rækkefølge efter AY-, ERC-, CNG- og HC-strukturer .
BEMÆRK: At definere et godt vartegn for AY-dissektion vil være en nøgle til det næste trin, og krydset på bageste margen, hvor stria terminalis møder AY , vil være et godt punkt. - På dette tidspunkt omfatter de resterende strukturer thalamus og MB. Bekræft identifikationen af thalamus ved visualisering af stria medullaris på dens dorsale overflade, der strækker sig i midterlinjen rostrocaudalplanet. Adskil thalamus helt fra mellemhjernen ved en koronal skåret kaudal til habenula og rostral til den overlegne colliculi. ROC gemmes på dette trin.
- På dette tidspunkt komplet indsamling af alle hjerneområder og straks (som hver er opnået) opbevare prøverne flash frosset indtil videre behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores forståelse af hjernens komplekse struktur og funktion udvikler sig hurtigt og forbedres. Hjernen indeholder flere forskellige regioner, og opbygning af et molekylært kort kan hjælpe os med bedre at forstå, hvordan hjernen fungerer. I dette metodepapir har vi diskuteret dissektion af musehjernen i flere forskellige regioner (tabel 1). I denne protokol identificeres strukturerne baseret på de kritiske landemærker og opnås ved at holde vævet fugtigt med saltopløsning ved at bevare dets robusthed til øjeblikkelig dissektion. Metoden dækker flere regioner end andre rapporter21 og supplerer dissektionsmetoder ved hjælp af frosne hjerner22,23. Disse dissekerede væv kan bevares og behandles senere afhængigt af undersøgelsens krav. Den metode, der diskuteres her, er øjeblikkelig fjernelse af hjernen fra kraniet efterfulgt af dissektion, som giver nok væv på en hurtig måde til nedstrøms assays i betragtning af musehjernens størrelse. Vores team har ekstraheret RNA fra flere dissekerede væv og analyseret til genekspressionsprofilering ved hjælp af mikroarrays til hjernevæv; AY, HC, MPFC, septal region, corpus striatum og VS og resultaterne er blevet offentliggjort15. Disse høstede hjerner blev opbevaret ved -80 ° C i flere måneder før RNA-ekstraktion. Denne metode kan vedtages i kombination af andre metoder til at diversificere nedstrøms nytte af hjerneområder. Denne dissektionsmetode er fokuseret på at følge landemærker blandt anatomisk forskellige tilstødende regioner i stedet for at være strengt koronale eller sagittale dissektioner. De forskellige hjerneområder sammen med vægtdata blev indsamlet under undersøgelsen aggressor eksponeret social stressmodel af PTSD16 og RNA-koncentrationer sammen med spektrofotometriske aflæsninger er vist som figur 5.
Figur 1: Repræsentation af musehjerne med forskellige vævstyper indsamlet. Denne figur er en kosmetisk repræsentation af strukturerne og er ikke skaleret til nogen kortlagt database. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hjernefjernelse fra kraniehulen efterfulgt af hypofysefjernelse. Trinvis procedure for hjernefjernelse (i) fastspænding og fastholdelse efter hårfjerning (ii) fastgørelse af klemmen med en Kimwipe for at holde håret væk fra vævet (iii) før fjernelse af muskler (iv) efter fjernelse af muskler (v) adskillelse af méninges (vi) fjernelse af globus / øje (vii) skåret på orbital højderyg (viii) fjernelse af parietale og frontale knogler (ix) hjernevisning og fjernelse (x) hjerneløsning (xi) hypofysevisning (xii) hypofysefjernelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dissektionsopsætningsstation. Dette billede viser opsætningen til fjernelse af hjernedissektion efter hjerne og hypofysevæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hjerne dissektion. Trinvis procedure for hjernefjernelse (i) topvisning af hjernen (ii) dorsal visning af hjerne (iii) fjernelse af lillehjernen (iv) cerebral adskillelse (v) halvkugledissektion (vi) olfaktorisk pærefjernelse (vii) MPFC, FCX og tilbehør olfaktorisk dissektion (viii) SE, VS og ST dissektion (ix) PFM-fjernelse (x) Limbisk systemdissektion Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Data genereret efter prøveindsamling (A) Hjernevævsvægt og (B) RNA-koncentration og (C) OD 260/280 fra hvert af hjernevævene er vist. Her indsamles data fra kontrolgrupper (n= 3-6) fra en studiegruppe som rapporteret tidligere15,16. Klik her for at se en større version af denne figur.
| # | Forkortelser | Beskrivelse af hjerneområdet |
| 1 | Cb | Lillehjerne |
| 2 | Hb | Hjernestamme/baghjerne (pons og medulla oblongata) |
| Adskil i de to halvkugler | ||
| 3 | Ob | Olfaktoriske pærer og tilbehørslufaktoriske pærer |
| 4 | Mpfc | Medial præfrontal cortex |
| 5 | Fcx | Lateral præfrontal cortex |
| 6 | SE | Septum eller septal region |
| 7 | Vs | Ventral striatum omfatter nucleus accumbens (NAC) og olfaktorisk tuberkel (OT) |
| 8 | Skt | Forreste og bageste corpus striatum |
| 9 | Hy | Hypothalamus |
| 10 | Pfm | Piriform cortex |
| 11 | Hc | Hippocampus |
| 12 | ERC | Entorhinal cortex |
| 13 | CNG | Posterior cingulate cortex |
| 14 | Ay | Amygdala |
| 15 | Mb | Mellemhjerne med thalamus |
| 16 | Roc | Resten af hjernebarken |
Tabel 1: Beskrivelse af forskellige regioner fra musehjerne. Denne tabel indeholder en liste over alle hjerneområder indsamlet med forkortelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pattedyrshjernen er et komplekst organ sammensat af en række morfologisk forskellige og funktionelt unikke celler med forskellige molekylære signaturer og flere regioner, der udfører specialiserede og diskrete funktioner. Dissektionsproceduren, der er rapporteret her, kan have flere mål afhængigt af laboratoriets krav. I vores laboratorium vurderede vi transkription i flere hjerneområder indsamlet fra mus udsat for PTSD som stress16 . Vi vil gerne undersøge yderligere virkningen af stammegenetisk baggrund24 på ekspressionsniveauer i flere hjerneområder. Denne protokol har flere kritiske trin, der skal overvejes for en vellykket reproducerbarhed af eksperimenterne. Hver af de lokaliserede områder af hjernen spiller en særskilt rolle i neuropatologisk tilstand, og detaljeret viden om den passende hjerneregion til at studere mangler. Derfor er det vigtigt at generere datasættet vedrørende hjerneområdet. Således kan dataene ikke kun forespørges ved at vælge hjerneregion, men også efter datakategori (f.eks. Transkriptom, protein, celle (cytoarkitektur) eller andet), hvilket fører til mere præcis information. Tidligere har væv som olfaktorisk pære, frontal cortex, striatum og hippocampus i friske rottehjernevæv vist sig at blive dissekeret ved hjælp af et mikroskop25. Alternativt kan sektioner dissekeres, mens hjernen er frosset14 efterfulgt af RNA- og proteinekstraktioner, men denne metode er begrænset til hjerneområder, der kan identificeres ved klare landemærker. Samlede RNA-ekstraktioner er blevet udført efter mikrodissektion25 fra større hjerneområder samt ved hjælp af ikke-laserfangstmikroskopimetode til genekspressionsundersøgelser13. Her fokuserer vi på dissektion af frisk musehjerne for at adskille de specifikke hjernestrukturer, der har dedikeret kontrol over fysiologiske og adfærdsmæssige funktioner. Vores metode forklarer dissektion af flere regioner end allerede offentliggjorte rapporter, men den supplerer andre tilgængelige dissektionsmetoder. Denne tilgang kan bidrage til at give en omfattende vurdering af vævene og dets tilknytning til svækkende tilstande. Denne dissektionsstrategi giver en levedygtig mulighed for eksisterende prøveindsamlingsstrategier, der åbner muligheder for nye opdagelser.
Med den metode, der er beskrevet heri, snap fryses hjernevæv i flydende nitrogen, inden det overføres til -80 ° C til langtidsopbevaring. Det er vigtigt, at værktøjerne og vævene holdes kolde under hele proceduren til bevarelse af nukleinsyrer eller proteiner. Disse frosne væv homogeniseres senere ved hjælp af laboratoriestandardoperationsprocedurer. Nogle af disse hjernevæv er meget små, og der skal udvises forsigtighed under homogeniserings- og ekstraktionsprocessen, der beskytter målmolekyler mod nedbrydning ved højere temperaturer.
I denne proces er det vigtigt at identificere klare landemærker for at lokalisere de specifikke vævsområder. Dette opnås ved at holde vævet fugtigt med saltopløsning for at forhindre det i at blive hurtigt blødt og bevare sin robusthed i et stykke tid. Vores tidligere undersøgelser sammenlignede genekspressionsændringer mellem kontrol- og aggressoreksponeret musevæv15 og undersøgte ikke nogen ændringer forårsaget af saltvandet, der blev brugt under dissektion. Efter vores erfaring er dette især vigtigt under snittet startende fra hypothalamus og 180 ° vending, da det afslører og gør den regionale adskillelse skygge af de limbiske regioner (AY, HC, ERC) indlysende og mere klar. Det limbiske system ligger dybt inde i hjernen og bliver beskadiget af en række stimuli og er derfor vigtigt diagnostisk og terapeutisk. Der limbisk system består af hjerneområder, men der er ingen universel enighed om denne liste26. Selvom det ikke er undersøgt, mener vi, at der er minimale eller ingen virkninger af saltvandsbrug. Dette skyldes, at hele proceduren varer ca. 20 minutter efter kolde forhold under hele processen.
Regioner i hjernevæv identificeres ved hjælp af landemærker nævnt i hjerneatlas. Ved hjælp af denne teknik skal landemærkerne være klare, og denne procedure skal udføres sekventielt. Dissektionen skal udføres, mens hjernen stadig er frisk og robust; (skal gøres med de første 15 til 20 minutter) - ellers vil landemærkerne ikke være klare, og regioner vil ikke være tydelige, hvis hjernen forbliver i længere tid og bliver blødere.
Som beskrevet ovenfor er der i hjernen underområder, der indeholder flere funktionelle områder, der virker uafhængigt eller i koordination med iboende forbindelsesnetværk. Det er vigtigt at hente disse regioner med stor præcision for at studere dens brede dimensioner. Dette vil bidrage til at integrere disse begreber ved at kombinere de specialiserede regioner, hvor hver tjener en særskilt proces med et terapeutisk potentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler og Pamela Spellman for eksperimentel hjælp og Dana Youssef for redigering af manuskriptet. Finansieringsstøtten fra USAMRDC anerkendes taknemmeligt. Geneva Foundation bidrog til dette arbejde og blev støttet af midler fra Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via US Army Research Office.
Ansvarsfraskrivelse:
Materialet er blevet gennemgået af Walter Reed Army Institute of Research. Der er ingen indvendinger mod dens præsentation og/eller offentliggørelse. De meninger eller påstande, der er indeholdt heri, er forfatterens private synspunkter og må ikke opfattes som officielle eller som udtryk for sande synspunkter fra hærens ministerium eller forsvarsministeriet. Forskning blev udført under en godkendt dyrebrugsprotokol i en AAALAC-akkrediteret facilitet i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven og andre føderale vedtægter og regler vedrørende dyr og forsøg, der involverer dyr og overholder principperne i Vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr, NRC-publikation, 2011-udgave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
