Summary
Мы представляем практический, пошаговый, быстрый протокол для удаления мозга мыши и рассечения дискретных областей из свежей мозговой ткани. Получение областей мозга для молекулярного анализа стало рутиной во многих лабораториях нейробиологии. Эти области мозга немедленно замораживаются для получения высококачественных транскриптомных данных для анализа на системном уровне.
Abstract
Мозг является командным центром нервной системы млекопитающих и органом с огромной структурной сложностью. Защищенный внутри черепа, мозг состоит из внешнего покрытия серого вещества над полушариями, известного как кора головного мозга. Под этим слоем находятся многие другие специализированные структуры, которые необходимы для множественных явлений, важных для существования. Получение образцов конкретных грубых областей мозга требует быстрых и точных этапов рассечения. Понятно, что на микроскопическом уровне существует много субрегионов и, вероятно, пересекают произвольные региональные границы, которые мы налагаем с целью этого вскрытия.
Мышиные модели обычно используются для изучения функций и заболеваний человеческого мозга. Изменения в паттернах экспрессии генов могут быть ограничены конкретными областями мозга, нацеленными на определенный фенотип в зависимости от болезненного состояния. Таким образом, большое значение имеет изучение регуляции транскрипции в отношении ее четко определенной структурной организации. Полное понимание мозга требует изучения различных областей мозга, определения связей и выявления ключевых различий в деятельности каждой из этих областей мозга. Более полное понимание каждой из этих отдельных областей может проложить путь для новых и улучшенных методов лечения в области неврологии. Здесь мы обсуждаем пошаговую методологию рассечения мозга мыши на шестнадцать различных областей. В этой процедуре мы сосредоточились на удалении и рассечении мозга самцов мышей C57Bl / 6J (6-8 недель) на несколько областей с использованием нейроанатомических ориентиров для выявления и выборки дискретных функционально значимых и поведенчески значимых областей мозга. Эта работа поможет заложить прочный фундамент в области нейробиологии, что приведет к более целенаправленным подходам в более глубоком понимании функции мозга.
Introduction
Головной мозг, наряду со спинным мозгом и сетчаткой, составляет центральную нервную систему, которая выполняет сложное поведение, контролируемое специализированными, точно расположенными и взаимодействующими типами клеток по всему телу1. Мозг представляет собой сложный орган с миллиардами взаимосвязанных нейронов и глии с точной схемой, выполняющей многочисленные функции. Это двусторонняя структура с двумя различными долями и разнообразными клеточными компонентами2. Спинной мозг соединяет головной мозг с внешним миром и защищен костью, мозговыми оболочками и спинномозговой жидкостью и направляет сообщения в мозг и из него 2,3,4. Поверхность мозга, кора головного мозга, неровная и имеет отчетливые складки, называемые извилинами, и бороздки, называемые бороздами, которые разделяют мозг на функциональные центры5. Кора гладкая у млекопитающих с небольшим мозгом 6,7. Важно охарактеризовать и изучить архитектуру человеческого мозга, чтобы понять расстройства, связанные с различными областями мозга, а также его функциональными схемами. В последние годы исследования в области неврологии расширились, и для изучения структуры и функции мозга используются различные экспериментальные методы. Разработки в области молекулярной и системной биологии открыли новую эру изучения сложных отношений между структурами мозга и функционированием молекул. Кроме того, молекулярная биология, генетика и эпигенетика быстро расширяются, что позволяет нам продвигать наши знания об основных механизмах, связанных с функционированием систем. Эти анализы могут проводиться на гораздо более локализованной основе, чтобы помочь целенаправленно исследовать и разработать более эффективные методы лечения.
Мозг млекопитающих структурно определен в четко идентифицируемые дискретные области; однако функциональные и молекулярные сложности этих дискретных структур еще не ясно поняты. Многомерность и многослойность мозговой ткани затрудняет изучение этого ландшафта на функциональном уровне. Кроме того, тот факт, что несколько функций выполняются одной и той же структурой и наоборот, еще больше усложняет понимание мозга8. Крайне важно, чтобы экспериментальный подход, выполненный для структурной и функциональной характеристики областей мозга, использовал точные исследовательские методологии для достижения согласованности в выборке для корреляции нейроанатомической архитектуры с функцией. Сложность мозга была недавно объяснена с использованием секвенирования одиночных клеток 9,10, таких как височная извилина человеческого мозга, которая состоит из 75 различных типов клеток11. Сравнивая эти данные с данными из аналогичной области мозга мыши, исследование не только выявляет сходство в их архитектуре и типах клеток, но и представляет различия. Чтобы разгадать сложные механизмы, важно изучать различные области мозга с полной точностью. Сохраненные структуры и функции между мозгом человека и мыши позволяют использовать мышь в качестве предварительного суррогата для выяснения функции человеческого мозга и поведенческих результатов.
С развитием подходов системной биологии получение информации из дискретных областей мозга у грызунов стало ключевой процедурой в исследованиях нейробиологии. В то время как некоторые протоколы, такие как микродиссекция12 лазерного захвата, могут быть дорогостоящими, механические протоколы недороги и выполняются с использованием общедоступных инструментов13,14. Мы использовали несколько областей мозга для транскриптомных анализов15 и разработали практическую и быструю процедуру для пошагового рассечения областей мозга мыши шаг за шагом за короткое время. После вскрытия эти образцы могут быть сохранены сразу в холодных условиях для сохранения нуклеиновых кислот и белков этих тканей. Наш подход может быть выполнен быстрее, что приводит к высокой эффективности и позволяет снизить вероятность ухудшения состояния тканей. Это, в конечном счете, увеличивает шансы на создание высококачественных, воспроизводимых экспериментов с использованием тканей мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Обработка животных и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с европейскими, национальными и институциональными руководящими принципами по уходу за животными. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Центре исследований в области гигиены окружающей среды армии США, который в настоящее время является Институтом исследований армии Уолтера Рида (WRAIR) и выполнены в учреждении, аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной организации по уходу за лабораторными животными (AAALAC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура будет проводиться на шести-восьминедельных самцах мышей штамма C57BL/6j, усыпленных вывихом шейки матки16. Перфузии в нашей лаборатории не выполняются, но этот протокол может быть изменен, в результате чего могут быть выполнены перфузии для очистки крови из сосудистой системы. Все расходные материалы, необходимые для вскрытия, перечислены в Таблице материалов. Рассечение подразделяется на три компонента, включая удаление мозга, удаление гипофиза и рассечение мозга. Целью сбора мозговой ткани является их обработка для транскриптомных анализов после экстракции РНК. Как только область мозга рассечена, мы немедленно переносим каждую из областей мозга в уже помеченный флакон с морозильной камерой, а затем храним флакон в жидком азоте или -80 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное знание нейроанатомии имеет важное значение для выполнения этой процедуры. Горизонтальные и продольные сечения, а также обычные поперечные сечения должны быть изучены и изучены. Поскольку мозговая ткань деградирует очень быстро, нет времени обращаться к атласу при выполнении этой процедуры.
1. Удаление мозга мыши
- Зажмите верхнюю челюсть обезглавленной головы гемостатом (рисунок 2i) и используйте марлевую подушечку, чтобы отразить ростральную часть головы, дополнительно создав сухое поле на спинке черепа (рисунок 2ii).
- Вставьте тонкие изогнутые ножницы в отверстие magnum, чтобы отделить прилипшие мозговые оболочки. Здесь вставляют ножницы в отверстие на основании черепа — это большое отверстие, где спинной мозг проходит с лезвием, направленным вертикально (положение 12 часов), но параллельным и прижимающимся к внутренней поверхности базальной пластинчатой кости (т. е. затылочной сквамы) и вращающим лезвие на сорок пять° в левую сторону, а затем в правую сторону.
- Продолжайте вращать запястье, чтобы вырвать базальную пластинчатую кость, которая будет срезать середину оставшейся кости, продолжая в затылочную кость и внутритеменные кости, вырывая кости влево и вправо, пока они не будут удалены. Аналогичным образом удалите затылочную кость и внутритеменную кость, чтобы обнажить мозжечок.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент полая костная структура, называемая барабанными буллами, на вентральной задней части черепа, которая охватывает части среднего и внутреннего уха, может быть удалена, если не рассекать заднюю и переднюю доли гипофиза (рисунок 2iii). - Снимите мышечные крепления к височному гребню с помощью изогнутого острого лезвия ножниц. Поместите одну конечность изогнутых острых ножниц под лямбдовидный шов, проникающий в стык поперечной и сагиттальной пазух (рисунок 2iv).
- Продвиньте ножницы рострально вдоль среднего сагиттального шва до брегмы и нарежьте его очень осторожно, осторожно поднимая вверх, чтобы избежать разрыва коры головного мозга. Это критический шаг в процедуре (рисунок 2v).
- На этом этапе теменные кости поднимаются и вращаются, таким образом, соскребая внутреннюю поверхность кости, чтобы идентифицировать и разрезать оставшиеся менингеальные прикрепления. Схватите височную кость, выглядывающую наружу, подальше от мозга. Извлеките лобную кость с каждой стороны с помощью изогнутых ножниц или ронгера на орбиту и коронально разрезайте под прямым углом к орбитальному гребню, но не дальше средней линии (рисунок 2vii).
- Сделайте два разреза параллельно и примерно на расстоянии 4 мм друг от друга в сагиттальной плоскости (рисунок 2viii).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрезайте обе стороны одним ударом. - Удалите фрагменты лобной кости, избегая разрыва поверхности мозга (рисунок 2ix). В этот момент используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать твердую мозговую оболочку, которая должна быть доступна между обонятельными луковицами.
- Осторожно переверните череп, чтобы гравитация помогла в удалении мозга, продолжая выявлять и разрезать оставшиеся менингеальные прикрепления и черепные нервы. Мозг будет освобожден путем разрезания самого большого тройничного нерва, прикрепленного к мозгу и хорошо видимого, простирающегося от основания кальвария (рисунок 2x).
ПРИМЕЧАНИЕ: Переведите мозг на холодный физиологический раствор (ледяной цитрат натрия без РНКазы (0,9%) или физиологический (0,9%) физиологический раствор) для дальнейшего рассечения.
2. Рассечение переднего и заднего гипофиза
ПРИМЕЧАНИЕ: Гипофиз покрыт очень жесткой палаточной мембраной с гребнем, который проходит латерально между левым и правым тройничными нервами. Эти структуры чрезвычайно мягкие и деликатные и, как таковые, рекомендуется, чтобы задняя и передняя доли гипофиза рассекались отдельно поэтапно, in situ, непосредственно от черепа. Сразу после рассечения перенесите соответствующий гипофиз в предварительно маркированный флакон и храните флакон в жидком азоте предпочтительно в противном случае -80°С. Гипофиз покоится ровно над стыком затылочной и базисфеноидной костей; если они сгибаются, архитектура гипофиза нарушается.
- Держите слуховые буллы нетронутыми, чтобы убедиться, что анатомия гипофиза неповреждена и легко идентифицируема (рисунок 2ix).
- Рассечение задней доли гипофиза, за которой следует передняя доля гипофиза, от остальной части черепа.
- Сделайте крайне маленький парасагиттальный разрез с обеих сторон в гребне мембранной палатки и поднимите заднюю долю гипофиза ультратонкими щипцами, следя за тем, чтобы не нарушить переднюю ткань гипофиза (рисунок 2x).
- Сделайте сагиттальный разрез между боковыми краями передней доли гипофиза и ближайшим тройничным нервом и после этого вытащите переднюю долю гипофиза (рисунок 2x).
3. Рассечение мозга мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после удаления мозга и гипофиза дальнейшее рассечение проводится на предварительно охлажденном блоке из нержавеющей стали (рисунок 3). После рассечения переносят области мозга на предварительно маркированные флаконы и переносят флаконы предпочтительно в жидкий азот в противном случае -80 °C. Структуры, полученные методом сверху вниз (в хронологическом порядке), потенциально включают следующее: мозжечок (CB), ствол мозга / задний мозг (pons и продолговатый мозг) (HB), обонятельные луковицы (OB) в качестве вспомогательных обонятельных луковиц, медиальная префронтальная кора (MPFC), латеральная префронтальная кора (FCX), передняя и задняя полосатое тело (ST), вентральное полосатое тело (VS), состоящее из прилежащего ядра (NAC) и обонятельного бугорка (OT), перегородка (SE), преоптическая область, грушевидная кора (PFM), гипоталамус (HY), миндалина (AY), гиппокамп (HC), задняя поясная кора (CNG), энторинальная кора (ERC), средний мозг (MB) с таламусом и остальная часть коры головного мозга (ROC) (таблица 1). Конкретные регионы будут обсуждаться в порядке изоляции, работая с одним полушарием.
- Будьте очень осторожны в удалении мозга из кальвария, так как ориентиры могут быть разрушены в случае каких-либо рваных ран. На этом этапе выполните все вскрытия с использованием защиты лица, в частности, 7-кратного ювелирного козырька, и освещение будет обеспечиваться хирургическими лампами, расположенными над плечами каждого из плеч диссектора. Большая часть рассечения будет выполнена с использованием тупого режима небольших изогнутых щипцов (т. Е. Щипцов Грефе).
- Поместите мозг на блок из нержавеющей стали (рисунок 4i и рисунок 4ii). Держите блок холодным, окружив его льдом и ледяным солевым раствором. Периодически смачивайте ткани ледяным солевым раствором для сохранения структур.
- Расположите мозг так, чтобы кора головного мозга была обращена вверх. Используя небольшие изогнутые щипцы, мягко отразите CB, обнажив верхнюю, среднюю и нижнюю мозжечковые ножки и удалите CB (рисунок 4iii и рисунок 4iv).
- Сделайте среднесагиттальный разрез, начиная с спинки и между OB и полушариями головного мозга (рисунок 4v) и убедитесь, что он не простирается дальше передней комиссуры. В этот момент вермис может быть легко отделен от боковых частей, и HB будет получен корональным срезом на переднем крае понса.
- Отделите продолговатый мозг корональным разрезом по заднему краю понса.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент диэнцефалон, задняя часть переднего мозга, содержащая эпиталамус, таламус, гипоталамус и вентральный таламус и третий желудочек, будет повернута вентральной стороной вверх, и из зрительного хиазма рострально будет сделан средний разрез. Рассечение полушарий головного мозга с последующим удалением OB из одного из полушарий будет происходить на этом этапе (рисунок 4v и рисунок 4vi). - Отделите полушария головного мозга (рисунок 4v) перед дальнейшим рассечением диэнцефалона (рисунок 4v). Дорсальный подход будет использоваться путем тщательного тупого рассечения для сохранения критически заметных ориентиров средней линии. Визуализируйте каждую межполушарную связь, прежде чем разрывать их, так как это сведет к минимуму возможность отклонения от средней линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе одно из полушарий головного мозга (гемибрейн) может быть сохранено, а второе полушарие может быть использовано для дальнейшего рассечения - Сдвиньте закрытые лопасти небольших изогнутых щипцов под мозолистым телом и осторожно раздвиньте, чтобы втянуть неокортекс двусторонне. Мозолистое тело представляет собой широкую полосу нервных волокон, которая соединяет два полушария, которые будут тупо рассечены путем защемления щипцами, не нарушая структуры средней линии, лежащие внизу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мезиальные грани полушарий будут иметь несколько видимых ориентиров, таких как миелинизированные структуры, такие как genu мозолистого тела, fornices и передняя комиссура. Кроме того, хотя это несколько миллиметров от средней линии, маммиллоталамический тракт и фасцикулус ретрофлексус также могут быть видны. - Разделите пополам несколько структур, которые пересекают среднюю линию. Это будет включать в себя мозолистое тело, переднее отверстие, вентральное форникс-комиссур, заднее комиссурное, дорсальное форникс-комиссурное, надмаммиллярное декуссирование, верхнее колликуловое комиссурное, вентральное форникс-комиссур и перивентрикулярные таламические волокна.
- Будьте особенно осторожны на этом этапе в или вблизи средней линии, которая может быть частично скомпрометирована методом дорсального подхода. Все последующие структуры подвергаются риску, если они не выполняются осторожно.
- Удалите OB (клиновидный и более светлый цвет) и вспомогательные обонятельные луковицы с последующим сбором MPFC (поясная область коры 1, прелимбическая, инфракрасная, медиальная орбитальная и вторичная двигательная коры [M2]) и FCX корональным срезом, который делается на 1 мм впереди гену мозолистого тела (рисунок 4vii). Разделите полученный участок на парасагиттальный срез на 1/3 расстояния от медиальной до боковой поверхности, получив MPFC медиально и остаток FCX сбоку. Поясная кора является мышиным аналогом MPFC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот срез ткани также будет содержать небольшое количество M2 (вторичной моторной коры) 17 и является неизбежным. - Сделать корональный разрез на уровне передней комиссуры, приводящий к видимости парса передней конечности передней комиссуры в поперечном сечении на ростральной грани полученного коронального сечения, тогда как поперечная часть будет выявлена в каудальной грани сечения Это подтверждающий ориентир для NAC18. VS состоит из NAC и OT.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к поперечному сегменту в передней комиссуре есть передняя конечность, и она называется передней комиссурой, pars anterior. - Частично разрезать горизонтально через поперечную часть передней комиссуры от средней линии под передним рогом бокового желудочка, чтобы освободить ядро перегородки дорсально и VS вентрально. Удалите небольшое количество коры с боковой поверхности, где будут удалены NAC и OT .
- Отделите ростральную часть ST от вышележащей коры с помощью изогнутого скальпеля, разрезанного непосредственно за внешней капсулой, заботясь о том, чтобы не включать стриатальную ткань в кортикальный образец. В этот момент ядра перегородки /SE будут видны и могут быть легко взяты из этого среза (рисунок 4viii).
ПРИМЕЧАНИЕ: Передний и задний пределы PFM определяются воображаемыми корональными плоскостями, которые находятся в соответствии с передней комиссурой и маммиллярными телами соответственно. Медиальный предел определяется наружной капсулой18. - На боковой поверхности оставшегося геми-сечения диэнцефалона сделать частичный горизонтальный разрез вдоль хиковой борозды, простирающейся каудально, но только до мнимого уровня корональной плоскости с маммиллярными телами. Делают частичный корональный разрез, распространяющийся медиально на 1 мм от боковой корковой поверхности в плоскости маммиллярных тел HY. Здесь парасагиттальный разрез в плоскости клауструма освободит PFM (рисунок 4ix и рисунок 4x).
ПРИМЕЧАНИЕ: На медиальной поверхности оставшегося гемисекции диэнцефалона будут видны многочисленные анатомические особенности, включая маммиллярные тела, фасцикулус ретрофлексус и стрию медулларис. Будет виден полукруглый рисунок (спинная вогнутая сторона), который обозначает границу между таламусом и HY. HY будет легко идентифицирован на вид среднего сагиттального сечения в соответствии с оптическим хиазмом антеровентрально и передней комиссуры антеродорально и маммиллярными телами вместе с фасцикулусом ретрофлексусом сзади. Последние ориентиры были хорошо отображены в атласе17 , а также в контексте19 переднего мозга мыши-альбиноса. - Сделайте частичный корональный разрез сзади к маммиллярным телам, простираясь только вбок, как и гипоталамическая борозда. В этот момент парасагиттальный разрез по длине гипоталамической борозды теперь освобождает HY .
- Влекут за собой выворот бокового желудочка для выявления дополнительных внутрилимбических связей и остальных компонентов лимбической системы. Просмотр медиальной грани оставшегося геми-сечения диэнцефалона, изогнутые щипцы будут лучшим вариантом, поскольку они позволяют технику манипулировать другими деликатными участками окружающей области, используемой для разрыва форникса, и вставляются в боковой желудочек и осторожно расширяются, используя тупое рассечение, чтобы открыть желудочек и вращать HC 90° от вертикальной к горизонтальной плоскости. Может потребоваться использовать лезвие No 11 для разрезания сосудистой артерии / сосудистого сплетения, поскольку заостренный наконечник может помочь с точными разрезами.
- Поверните СПГ на 90° (но в направлении, противоположном от HC), чтобы он находился в горизонтальной плоскости. Используя щипцы, осторожно поверните HC еще на 180° наружу и сбоку, что сделает внутреннюю поверхность ERC видимой и обращенной вверх.
- Веерообразное излучение миелинизированных волокон, возникающее из ERC , будет сходиться, образуя угловой пучок, включая перфорантный путь и его прикрепление к HC. Поверните таламус и MB на 180° дорсально, чтобы вентрально раскрыть AY.
- При необходимости поднимите оптический тракт, чтобы выявить прикрепление stria terminalis, так как он будет содержать полосы волокон, идущих вдоль бокового края желудочковой поверхности таламуса к AY и сделает контуры AY ясными.
ПРИМЕЧАНИЕ: HC и форникс будут хорошо видны целиком, вложены в боковой желудочек и могут быть легко подняты. Боковой желудочек будет выстлан pia mater, и будут видны веерообразные истоки перфорантного пути через очень прозрачный субпиальный аспект ERC 20. - Внешняя поверхность медиального ERC будет иметь видимый заметный слой крупных пирамидальных клеток. Кроме того, плотная конвергенция волокон окрашивания Гольджи будет заметной особенностью в медиальном ERC. В этой процедуре рассечения, после вскрытия бокового желудочка, эти волокна будут легко видны на медиальной поверхности через pia mater, которая выстилает внутренние поверхности желудочков, образуя очень заметную веерообразную структуру.
- Обратите внимание, что волокна собираются субпиально, опускаются и покидают вентральный ERC, простираясь кзади, а затем поднимаются вертикально, чтобы перфорировать HC. Эта веерообразная структура в ERC будет использоваться для определения полей с целью рассечения. Идентификация и удаление в порядке AY, ERC, CNG и HC структур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение хорошего ориентира для рассечения AY будет ключом к следующему шагу, а соединение на заднем краю, где stria terminalis встречается с AY , будет хорошей точкой. - На данный момент остальные структуры включают таламус и МБ. Подтвердить идентификацию таламуса можно визуализацией stria medullaris на его дорсальной поверхности, простирающейся в средней линии рострокодальной плоскости. Отделите таламус полностью от среднего мозга корональным срезом каудального к хабенуле и рострального к верхним колликулам. РПЦ сохраняется на этом шаге.
- В этот момент полный сбор всех областей мозга и, сразу же (по мере получения каждой из них) хранит образцы, замороженные до дальнейшей обработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наше понимание сложной структуры и функции мозга быстро развивается и улучшается. Мозг содержит несколько различных областей, и построение молекулярной карты может помочь нам лучше понять, как работает мозг. В этой статье мы обсудили рассечение мозга мыши на несколько различных областей (таблица 1). В этом протоколе структуры идентифицируются на основе критических ориентиров и достигаются путем поддержания ткани влажной с физиологическим раствором, сохраняя ее прочность для немедленного рассечения. Метод охватывает больше областей, чем другие отчеты21, и дополняет методы рассечения с использованием замороженного мозга22,23. Эти рассеченные ткани могут быть сохранены и обработаны позже в зависимости от требований исследования. Метод, обсуждаемый здесь, заключается в немедленном удалении мозга из черепа с последующим рассечением, которое обеспечивает достаточное количество ткани быстрым способом для последующих анализов, учитывая размер мозга мыши. Наша команда извлекла РНК из нескольких рассеченных тканей и провела анализ для профилирования экспрессии генов с использованием микрочипов для тканей мозга; AY, HC, MPFC, септальная область, полосатое тело и VS и результаты были опубликованы15. Эти собранные мозги хранились при -80 ° C в течение нескольких месяцев до извлечения РНК. Этот метод может быть принят в сочетании с другими методами для диверсификации последующей полезности областей мозга. Этот метод рассечения ориентирован на следование ориентирам среди анатомически различных смежных областей, а не на строго корональные или сагиттальные рассечения. Различные области мозга вместе с данными о весе были собраны в рамках исследования агрессора, подвергшегося социальному стрессу модели ПТСР16, а концентрации РНК вместе со спектрофотометрическими показаниями показаны на рисунке 5.
Рисунок 1: Представление мозга мыши с различными типами собранных тканей. Этот рисунок является косметическим представлением структур и не масштабируется до какой-либо картографической базы данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Удаление мозга из полости черепа с последующим удалением гипофиза. Пошаговая процедура удаления мозга (i) зажим и удержание после удаления волос (ii) закрепление зажима с помощью Kimwipe для удержания волос подальше от ткани (iii) перед удалением мышц (iv) после удаления мышц (v) разделение метанов (vi) удаление глобуса /глаза (vii) разрезание на орбитальном гребне (viii) удаление теменной и лобной костей (ix) отображение и удаление мозга (x) отслоение мозга (xi) вид гипофиза (xii) удаление гипофиза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Станция настройки рассечения. На этом изображении показана установка на диссекцию мозга после удаления тканей мозга и гипофиза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Рассечение мозга. Пошаговая процедура удаления мозга (i) вид сверху мозга (ii) дорсальный вид мозга (iii) удаление мозжечка (iv) разделение головного мозга (v) рассечение полушарий (vi) удаление обонятельной луковицы (vii) MPFC, FCX и вспомогательное обонятельное рассечение (viii) SE, VS и ST рассечение (ix) удаление PFM (x) Рассечение лимбической системы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Показаны данные, полученные после сбора образца (A) Вес ткани мозга и (B) концентрация РНК и (C) OD 260/280 из каждой ткани мозга. Здесь данные собираются из контрольных групп (n = 3-6) из исследовательской группы, как сообщалось ранее 15,16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| # | Сокращения | Описание области мозга |
| 1 | КБ | Мозжечок |
| 2 | НВ | Ствол мозга /задний мозг (понс и продолговатый мозг) |
| Разделите на два полушария | ||
| 3 | Обь | Обонятельные лампы и вспомогательные обонятельные лампы |
| 4 | МПФК | Медиальная префронтальная кора |
| 5 | ФКХ | Латеральная префронтальная кора |
| 6 | ГП | Перегородка или область перегородки |
| 7 | ВС | Вентральный стриатум включает прилежащее ядро (NAC) и обонятельный бугорок (OT) |
| 8 | Ул | Переднее и заднее полосатое тело |
| 9 | Хай | Гипоталамус |
| 10 | ПФМ | Грушевидная кора |
| 11 | Хк | Птичья шпора |
| 12 | ЭРЦ | Энторинальная кора |
| 13 | СПГ | Задняя поясная кора |
| 14 | Да | Миндалина |
| 15 | Мб | Средний мозг с таламусом |
| 16 | Рух | Остальная часть коры головного мозга |
Таблица 1: Описание отдельных областей мозга мыши. Эта таблица содержит список всех областей мозга, собранных с его аббревиатурой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мозг млекопитающих представляет собой сложный орган, состоящий из массива морфологически различных и функционально уникальных клеток с разнообразными молекулярными сигнатурами и несколькими областями, которые выполняют специализированные и дискретные функции. Процедура вскрытия, описанная здесь, может иметь несколько целей в зависимости от требований лаборатории. В нашей лаборатории мы оценили транскрипцию в нескольких областях мозга, собранных у мышей, подвергшихся воздействию ПТСР, как стресс16 . Мы хотели бы дополнительно изучить влияние генетического фона штамма24 на уровни экспрессии в нескольких областях мозга. Этот протокол имеет несколько критических шагов, которые необходимо учитывать для успешной воспроизводимости экспериментов. Каждая из локализованных областей мозга играет определенную роль в нейропатологическом состоянии, и подробные знания о соответствующей области мозга для изучения отсутствуют. Поэтому важно сгенерировать набор данных, относящийся к области мозга. Таким образом, данные могут быть запрошены не только путем выбора области мозга, но и по категории данных (например, транскриптом, белок, клетка (цитоархитектура) или другие), что приводит к более точной информации. Ранее было показано, что такие ткани, как обонятельная луковица, лобная кора, полосатое тело и гиппокамп в свежих тканях мозга крыс, препарируются с помощью микроскопа25. Поочередно участки могут быть рассечены, пока мозг заморожен14 с последующей экстракцией РНК и белка, но этот метод ограничен областями мозга, которые могут быть идентифицированы четкими ориентирами. Полная экстракция РНК была проведена после микродиссекции25 из основных областей мозга, а также с использованием нелазерного подхода к микроскопии захвата для исследований экспрессии генов13. Здесь мы сосредоточимся на рассечении свежего мозга мыши, чтобы отделить конкретные структуры мозга, которые имеют специальный контроль над физиологическими и поведенческими функциями. Наш метод объясняет рассечение большего количества областей, чем уже опубликованные отчеты, однако он дополняет другие доступные методы рассечения. Этот подход может помочь обеспечить всестороннюю оценку тканей и их связи с изнурительными состояниями. Эта стратегия вскрытия обеспечивает жизнеспособный вариант существующих стратегий сбора образцов, открывая возможности для новых открытий.
С помощью способа, описанного в настоящем описании, ткани мозга замораживают в жидком азоте перед переносом на -80 °C для длительного хранения. Важно, чтобы инструменты и ткани оставались холодными в течение всей процедуры для сохранения нуклеиновых кислот или белков. Эти замороженные ткани гомогенизируются позже с использованием стандартных лабораторных операционных процедур. Некоторые из этих тканей мозга очень малы, и во время процесса гомогенизации и экстракции следует соблюдать осторожность, защищая молекулы-мишени от деградации при более высоких температурах.
В этом процессе важно определить четкие ориентиры, чтобы точно определить конкретные области ткани. Это достигается путем поддержания ткани влажной с помощью физиологического раствора, чтобы она не становилась быстро мягкой и сохраняла свою прочность в течение некоторого времени. Наши предыдущие исследования сравнивали изменения экспрессии генов между контрольными и агрессорными тканями мыши15 и не изучали никаких изменений, вызванных физиологическим раствором, используемым во время рассечения. По нашему опыту, это особенно важно во время разреза, начиная с гипоталамуса и переворачивания на 180°, поскольку оно обнажает и делает региональное разделение затенения лимбических областей (AY, HC, ERC) очевидным и более ясным. Лимбическая система расположена глубоко внутри мозга и повреждается различными стимулами, и, следовательно, важна диагностически и терапевтически. Там лимбическая система состоит из областей мозга, однако нет универсального согласия по этому списку26. Хотя это не изучено, мы думаем, что есть минимальные или вообще нет эффектов использования физиологического раствора. Это связано с тем, что вся процедура длится около 20 минут после холодных условий в течение всего процесса.
Области в ткани мозга идентифицируются с использованием ориентиров, упомянутых в атласах мозга. Используя эту технику, ориентиры должны быть четкими, и эта процедура должна выполняться последовательно. Рассечение должно быть сделано, пока мозг еще свежий и прочный; (должно быть сделано с первых 15 до 20 минут) - в противном случае ориентиры не будут четкими и области не будут различимыми, если мозг задержится на более длительное время и станет мягче.
Как описано выше, внутри мозга находятся подобласти, содержащие несколько функциональных областей, которые действуют независимо или в координации с внутренними соединительными сетями. Важно извлекать эти области с большой точностью, чтобы изучить их широкие размеры. Это поможет интегрировать эти концепции путем объединения специализированных регионов, где каждый из них обслуживает отдельный процесс с терапевтическим потенциалом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жу Сешмалини Сринивасан, г-на Стивена Батлера и г-жу Памелу Спеллман за экспериментальную помощь и г-жу Дану Юсеф за редактирование рукописи. Финансовая поддержка со стороны USAMRDC благодарна. Женевский фонд внес свой вклад в эту работу и был поддержан средствами Из Управления исследований военной и оперативной медицины III через Исследовательское управление армии США.
Отказ:
Материал был рассмотрен Институтом исследований армии Уолтера Рида. Нет никаких возражений против его представления и/или публикации. Мнения или утверждения, содержащиеся в настоящем документе, являются частными взглядами автора и не должны толковаться как официальные или как отражающие истинные взгляды Министерства армии или Министерства обороны. Исследования проводились в соответствии с утвержденным протоколом использования животных в аккредитованном AAALAC учреждении в соответствии с Законом о благополучии животных и другими федеральными законами и правилами, касающимися животных и экспериментов с участием животных, и придерживаются принципов, изложенных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, публикация NRC, издание 2011 года.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
