Summary
우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.
Abstract
뇌는 포유류 신경계의 지휘 센터이며 엄청난 구조적 복잡성을 가진 기관입니다. 두개골 내에서 보호되는 뇌는 대뇌 피질로 알려진 반구에 회색 물질의 외부 덮개로 구성됩니다. 이 층 아래에는 존재에 중요한 여러 현상에 필수적인 다른 많은 특수 구조가 있습니다. 특정 총 뇌 영역의 샘플을 획득하려면 빠르고 정확한 해부 단계가 필요합니다. 현미경 수준에서 많은 하위 영역이 존재하며이 해부의 목적을 위해 부과하는 임의의 지역 경계를 넘을 가능성이 있음을 이해합니다.
마우스 모델은 인간의 뇌 기능과 질병을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 유전자 발현 패턴의 변화는 병든 상태에 따라 특정 표현형을 표적화하는 특정 뇌 영역에 국한될 수 있다. 따라서, 잘 정의된 구조 조직과 관련하여 전사의 조절을 연구하는 것이 매우 중요하다. 뇌에 대한 완전한 이해는 뚜렷한 뇌 영역을 연구하고, 연결을 정의하며, 이러한 각 뇌 영역의 활동에서 주요 차이점을 식별해야합니다. 이러한 각각의 별개의 영역에 대한보다 포괄적 인 이해는 신경 과학 분야에서 새롭고 개선 된 치료를위한 길을 열어 줄 수 있습니다. 여기에서, 우리는 마우스 뇌를 열여섯 개의 별개의 영역으로 해부하기 위한 단계별 방법론에 대해 논의한다. 이 절차에서 우리는 수컷 마우스 C57Bl / 6J (6-8 주 된) 뇌 제거 및 신경 해부학 적 랜드 마크를 사용하여 여러 영역으로 해부하여 기능적으로 관련성이 높고 행동 관련 뇌 영역을 식별하고 샘플링하는 데 중점을 두었습니다. 이 연구는 신경 과학 분야에서 강력한 토대를 마련하여 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해에보다 집중적 인 접근 방식을 이끌어내는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
뇌는 척수 및 망막과 함께 복잡한 행동을 실행하는 중추 신경계를 구성하며, 전신에 걸쳐 전문화되고 정확하게 위치하며 상호 작용하는 세포 유형에 의해 제어됩니다1. 뇌는 수십억 개의 상호 연결된 뉴런과 글리아교를 가진 복잡한 기관으로, 수많은 기능을 수행하는 정확한 회로를 갖추고 있습니다. 그것은 두 개의 뚜렷한 엽과 다양한 세포 구성 요소가있는 양측 구조입니다2. 척 수는 뇌를 외부 세계와 연결하고 뼈, 수막, 뇌척수액으로 보호되며 뇌2,3,4로 메시지를 주고받습니다. 뇌의 표면, 대뇌 피질은 고르지 않으며 자이리라고 불리는 뚜렷한 주름과 설치라고 불리는 홈을 가지고있어 뇌를 기능 센터로 분리합니다5. 피질은 작은 두뇌 6,7을 가진 포유류에서 매끄럽다. 다양한 뇌 영역과 관련된 장애와 기능 회로를 이해하기 위해 인간 뇌의 구조를 특성화하고 연구하는 것이 중요합니다. 최근 몇 년 동안 신경 과학 연구가 확대되었으며 뇌의 구조와 기능을 연구하기 위해 다양한 실험 방법이 사용되고 있습니다. 분자 및 시스템 수준의 생물학 분야의 발전은 뇌 구조와 분자의 기능 사이의 복잡한 관계를 탐구하는 새로운 시대를 열었습니다. 또한 분자 생물학, 유전학 및 후성 유전학이 급속히 확장되어 시스템이 작동하는 방식과 관련된 기본 메커니즘에 대한 지식을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 분석은보다 효과적인 치료법의 조사 및 개발을 목표로하는 데 도움이되도록 훨씬 더 현지화 된 기반으로 수행 될 수 있습니다.
포유류의 뇌는 구조적으로 명확하게 식별 가능한 개별 영역으로 정의됩니다. 그러나, 이들 이산 구조의 기능적 및 분자 복잡성은 아직 명확하게 이해되지 않았다. 뇌 조직의 다차원 및 다층 특성으로 인해이 풍경은 기능적 수준에서 연구하기가 어렵습니다. 또한, 여러 기능이 동일한 구조에 의해 수행되고 그 반대의 경우도 마찬가지라는 사실은 뇌에 대한 이해를 더욱 복잡하게 만든다8. 뇌 영역의 구조적 및 기능적 특성화를 위해 실행 된 실험 접근법은 신경 해부학 적 구조와 기능을 상호 연관시키기위한 샘플링의 일관성을 달성하기 위해 정확한 연구 방법론을 사용하는 것이 중요합니다. 뇌의 복잡성은 최근 75 개의 별개의 세포 유형 11로 구성된 인간 뇌의 측두엽 자이러스와 같은 단일 세포 시퀀싱 9,10을 사용하여 설명되었습니다. 이 데이터를 마우스 뇌의 유사한 영역의 데이터와 비교함으로써이 연구는 아키텍처와 세포 유형의 유사성을 밝힐 뿐만 아니라 차이점을 제시합니다. 따라서 복잡한 메커니즘을 풀기 위해서는 뇌의 다양한 영역을 완벽하게 정밀하게 연구하는 것이 중요합니다. 인간과 마우스 뇌 사이의 보존된 구조와 기능은 인간의 뇌 기능과 행동 결과를 해명하기 위한 예비 대리자로 마우스를 사용할 수 있게 한다.
시스템 생물학 접근법의 발전과 함께, 설치류의 개별 뇌 영역에서 정보를 얻는 것은 신경 과학 연구의 핵심 절차가되었습니다. 레이저 캡처 미세분리부(12)와 같은 일부 프로토콜은 비용이 많이 들 수 있지만, 기계적 프로토콜은 저렴하고 일반적으로 이용가능한 도구(13,14)를 사용하여 수행된다. 우리는 전사 분석(15)을 위해 다수의 뇌 영역을 사용해왔고, 짧은 시간 내에 단계적으로 관심있는 마우스 뇌 영역을 해부하기 위한 실습적이고 신속한 절차를 개발하였다. 일단 해부되면, 이들 샘플은 이들 조직의 핵산 및 단백질을 보존하기 위해 차가운 조건에서 즉시 저장될 수 있다. 우리의 접근 방식은 더 빨리 수행 될 수 있으므로 고효율로 이어지고 조직 악화 가능성을 줄일 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 뇌 조직을 사용하여 고품질의 재현 가능한 실험을 생성 할 가능성을 높입니다.
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Protocol
동물 취급 및 실험 절차는 동물 보호를위한 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 현재 월터 리드 육군 연구소 (WRAIR)의 환경 건강 연구 센터 (WRAIR)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받은 시설에서 수행되었습니다.
참고: 절차는 자궁경부 탈구16에 의해 안락사된 C57BL/6j 균주의 6 내지 8주령 수컷 마우스에 대해 수행될 것이다. 우리 실험실에서는 관류가 수행되지 않지만이 프로토콜을 수정하여 혈관 구조에서 혈액을 맑게하기위한 관류를 수행 할 수 있습니다. 해부에 필요한 모든 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다. 해부는 뇌의 제거, 뇌하수체 제거 및 뇌 해부를 포함한 세 가지 구성 요소로 나뉩니다. 뇌 조직 수집의 목적은 RNA 추출 후 전사 분석을 위해 이들을 처리하는 것입니다. 뇌 영역이 해부되자마자, 우리는 즉시 각각의 뇌 영역을 이미 라벨이 붙은 냉동고 바이알로 옮긴 다음 바이알을 액체 질소 또는 -80°C에 보관한다.
참고 : 신경 해부학에 대한 철저한 지식은이 절차를 수행하는 데 필수적입니다. 수평 및 세로 섹션뿐만 아니라 일반적인 횡단 단면도 연구하고 배워야합니다. 뇌 조직은 매우 빠르게 분해되기 때문에이 절차를 수행하는 동안 아틀라스와 상담 할 시간이 없습니다.
1. 마우스 뇌 제거
- 목이 잘린 머리의 맥실라를 지혈로 고정하고(그림 2i), 거즈 패드를 사용하여 두피를 로스트랄하게 반사하여 두개골 도섬에 마른 밭을 만듭니다(그림 2ii).
- 미세한 곡선 가위를 포라멘 매그넘에 삽입하여 부착 수막을 분리하십시오. 여기서, 두개골 기저부의 개구부에 가위를 삽입하면 포라멘 매그넘이 있는데, 여기서 척수는 칼날이 수직으로 가리키는 (12시 위치)와 함께 지나가지만, 평행하고 기저판 뼈의 내부 표면(즉, 후두부 스쿼마)에 대고 눌러서 블레이드를 왼쪽으로 사십오° 회전시킨 다음 오른쪽으로 돌린다.
- 손목을 계속 돌려 나머지 뼈의 중앙을 잘라내는 기저 판 뼈를 뺏어 내고, 나머지 뼈의 중앙을 잘라내어 후두골과 정수리 내 뼈가 제거 될 때까지 왼쪽과 오른쪽으로 캐냅니다. 비슷한 방식으로 후두골과 정수리 내 뼈를 제거하여 소뇌를 노출시킵니다.
참고: 이 시점에서 중이와 내이의 일부를 둘러싸고 있는 두개골의 복부 후부 부분에 있는 고막 불레(tympanic bullae)라고 불리는 중공 뼈 구조는 뇌하수체의 후방과 전엽을 해부하지 않는 한 제거할 수 있습니다(그림 2iii). - 구부러진 날카로운 가위 블레이드를 사용하여 측두엽 능선에 대한 근육 부착물을 제거하십시오. 구부러진 날카로운 가위의 한쪽 팔다리를 횡단 및 시상 부비동의 접합부로 침투하는 람도이드 봉합사 아래에 놓습니다 (그림 2iv).
- 중간 시상 봉합사를 따라 가위를 bregma까지 로스트랄하게 전진시키고 대뇌 피질의 열상을 피하기 위해 조심스럽게 위로 들어 올리면서 매우 부드럽게 자릅니다. 이는 절차에서 중요한 단계입니다(그림 2v).
- 이 단계에서 정수리 뼈를 들어 올리고 회전시켜 뼈의 내부 표면을 긁어 내고 남아있는 수막 부착물을 확인하고 절단합니다. 뇌에서 멀리 떨어진 바깥쪽으로 삐걱 거리는 측두골을 잡으십시오. 곡선형 가위 또는 론그어를 사용하여 양쪽에서 전두엽 뼈를 궤도로 분리하고 궤도 능선에 직각으로 관상동맥을 절단하지만 중앙선보다 크지 않습니다 (그림 2vii).
- 시상면에서 두 컷을 평행하고 약 4mm 간격으로 만듭니다(그림 2viii).
참고: 한 번의 스트로크로 양쪽을 자르지 마십시오. - 뇌 표면이 찢어지지 않도록 전두엽 뼈의 파편을 제거하십시오 (그림 2ix). 이 시점에서 미세한 가위를 사용하여 후각 전구 사이에 접근 할 수있는 경막 매트를 자릅니다.
- 두개골을 부드럽게 뒤집어 중력이 뇌의 제거를 돕고, 남아있는 수막 부착물과 두개골 신경을 계속 확인하고 절단합니다. 뇌는 뇌에 부착 된 가장 큰 삼차 신경을 절단하여 방출되며 칼바륨의 기저부에서 연장되어 명확하게 볼 수 있습니다 (그림 2x).
참고: 추가 해부를 위해 뇌를 차가운 식염수 용액(얼음 차가운 RNase-free 구연산나트륨(0.9%) 또는 생리식염수(0.9%) 식염수)로 옮깁니다.
2. 전방 및 후뇌하수체의 해부
참고 : 뇌하수체는 매우 거친 텐트 모양의 막으로 덮여 있으며, 왼쪽과 오른쪽 삼차 신경 사이에서 옆으로 이어지는 능선이 있습니다. 이 구조는 매우 부드럽고 섬세하기 때문에 뇌하수체 땀샘의 후방과 전엽을 두개골에서 직접 단계적으로, 현장에서 별도로 해부하는 것이 좋습니다. 해부 직후, 각각의 뇌하수체를 미리 표지된 바이알로 옮기고, 바이알을 바람직하게는 -80°C의 액체 질소에 저장한다. 뇌하수체는 후두부와 기초 페노이드 뼈의 교차점 위에 정확하게 놓여 있습니다. 그들이 구부러지면 뇌하수체 건축이 중단됩니다.
- 청각 불레를 그대로 유지하여 뇌하수체 해부학이 손상되지 않고 쉽게 식별 할 수 있는지 확인하십시오 (그림 2ix).
- 뇌하수체의 후엽을 해부하고 뇌하수체의 전엽을 두개골의 나머지 부분에서 해부하십시오.
- 막막 텐트의 능선에서 양쪽에 극히 작은 parasagittal 절단을하고 초미세 포셉으로 뇌하수체의 후엽을 들어 올려 전방 뇌하수체 조직을 방해하지 않도록주의하십시오 (그림 2x).
- 뇌하수체 전엽의 측면 여백과 가장 가까운 삼차 신경 사이의 시상을 자르고 그 후 뇌하수체의 전엽을 들어 올립니다 (그림 2x).
3. 마우스 뇌 해부
참고: 뇌와 뇌하수체 제거 직후, 미리 냉각된 스테인리스 스틸 블록에서 추가 해부가 수행됩니다(그림 3). 해부 후, 뇌 영역을 미리 표지된 바이알로 옮기고, 바이알을 바람직하게는 액체 질소로 옮기고 그렇지 않으면 -80°C로 옮긴다. 하향식 방법 (연대순으로)에 의해 생성 된 구조는 잠재적으로 다음을 포함합니다 : 소뇌 (CB), 뇌 줄기 / 뒷뇌 (폰스 및 수질 oblongata) (HB), 액세서리 후각 구근으로서의 후각 전구 (OB), 내측 전두엽 피질 (MPFC), 측면 전두엽 피질 (FCX), 전방 및 후부 코퍼스 선조체 (ST), 핵 축적 (NAC) 및 후각 결절 (OT)로 구성된 복부 선조체 (VS), 중격 (SE), 시전 영역, piriform 피질 (PFM), 시상 하부 (HY), 편도체 (AY), 해마 (HC), 후부 cingulate 피질 (CNG), entorhinal 피질 (ERC), 시상 및 나머지 대뇌 피질 (ROC)을 갖는 중뇌 (MB) (표 1). 특정 영역은 단일 반구로 작업하는 격리 순서로 논의 될 것입니다.
- 열상이있을 경우 랜드 마크가 파괴 될 수 있으므로 칼바륨에서 뇌를 제거하는 데 세심한주의를 기울이십시오. 이 단계에서 얼굴 보호, 특히 7x 보석상 바이저를 사용하여 모든 해부를 수행하고 조명은 각 디스 섹터의 어깨 위에 위치한 수술 램프로 제공됩니다. 해부의 대부분은 무딘 모드 작은 곡선 포셉 (즉, Graefe 포셉)을 사용하여 달성 될 것입니다.
- 뇌를 스테인리스 스틸 블록 위에 놓습니다(그림 4i 및 그림 4ii). 블록을 얼음과 얼음처럼 차가운 식염수로 둘러싸서 차갑게 유지하십시오. 주기적으로 얼음처럼 차가운 식염수로 조직을 축축하게 만들어 구조를 보존하십시오.
- 대뇌 피질이 위쪽을 향하도록 뇌를 배치하십시오. 작은 곡선 포셉을 사용하여, 상급, 중간 및 열등한 소뇌 받침대를 노출시킴으로써 CB를 부드럽게 반사시키고 CB를 제거한다(도 4iii 및 도 4iv).
- 등받이에서 시작하여 OB 와 대뇌 반구 사이에서 중간 시상 절단을 만들고 (그림 4v) 전방 commissure보다 더 멀리 확장되지 않도록하십시오. 이 시점에서, 버미스는 측면 부분으로부터 용이하게 분리될 수 있고, HB 는 폰의 전방 마진에서 코로나 절단에 의해 얻어질 것이다.
- 폰의 후방 여백에서 코로나 컷으로 수질을 분리하십시오.
참고 :이 시점에서 상복부, 시상탄, 시상 하부 및 복부 시상과 세 번째 심실을 포함하는 전뇌의 후부 부분 인 diencephalon은 복부 쪽을 위로 돌리고 시신경 치아즘에서 중추 절단이 이루어집니다. 반구 중 하나에서 OB를 제거한 후 대뇌 반구의 해부가이 단계에서 이루어질 것입니다 (그림 4v 및 그림 4vi). - 뇌파론을 더 해부하기 전에 대뇌 반구를 분리하십시오 (그림 4v). 등쪽 접근법은 비판적으로 두드러진 미드 라인 랜드 마크를 보존하기 위해 조심스럽게 둔한 해부로 사용될 것입니다. 모든 반구형 연결을 시각화한 후 분리하면 중간선에서 벗어날 가능성이 최소화되므로 연결을 끊습니다.
참고 :이 단계에서 대뇌 반구 (반뇌) 중 하나를 보존 할 수 있으며 두 번째 반구는 추가 해부에 사용할 수 있습니다. - 코퍼스 캘로섬 아래에있는 작고 구부러진 포셉의 닫힌 블레이드를 미끄러 뜨리고 부드럽게 퍼뜨려 신피질을 양측으로 수축시킵니다. 코퍼스 캘로섬 (corpus callosum)은 두 반구에 합류하는 광범위한 신경 섬유 밴드로, 아래에있는 중간 선 구조를 방해하지 않고 포셉으로 꼬집음으로써 무뚝뚝하게 해부됩니다.
참고 : 반구의 Mesial 얼굴에는 코퍼스 캘로섬의 속, fornices 및 전방 commissure와 같은 수초화 된 구조와 같은 여러 랜드 마크가 표시됩니다. 또한, 미드 라인에 몇 밀리미터 측면 있지만, mammillothalamic tract 및 근막 역반사 또한 볼 수 있습니다. - 미드라인을 가로지르는 여러 구조를 이분법합니다. 여기에는 코퍼스 캘로섬, 전방 컴미셔어, 복부 포닉스 컴미셔어, 후부 컴미셔스, 등쪽 포닉스 컴미스 슈어, 수프라 맘밀리아 드쿠시스, 우수한 콜리큘러스 컴미셔스, 복부 포닉스 컴미셔스 및 심실 주위 시상 섬유가 포함됩니다.
- 등쪽 접근 방법에 의해 부분적으로 손상 될 수있는 중간 선 안팎에서이 단계에서 특별한주의를 기울이십시오. 모든 후속 구조는 신중하게 수행하지 않으면 위험에 처해 있습니다.
- OB (쐐기 모양 및 밝은 색상) 및 액세서리 후각 전구를 제거한 다음 MPFC (cingulate cortex area 1, prelimbic, fralimbic, 내측 오비탈 및 2 차 운동 피질 [M2]) 및 FCX를 코퍼스 캘로섬의 게놈 전방으로 1mm 전방으로 만들어지는 코로나 절단에 의해 수집합니다 (그림 4vii). 결과 단면을 내측 표면으로부터 측면 표면까지의 거리의 1/3을 파라시시탈 절단으로 나누어 MPFC를 측방으로 내측 및 나머지를 산출한다. cingulate 피질은 MPFC의 마우스 유사체이다.
참고: 이 조직 슬라이스는 또한 소량의 M2(2차 운동 피질)( 17 )를 함유할 것이며 피할 수 없다. - 전방 비교의 수준에서 코로나 절단을 만들어 전방 전방 사지의 가시성을 확보하여 결과 코로나 절편의 로스트랄 면상의 단면에서 확인할 수 있는 반면, 횡단 부분은 단면의 인과면에 드러날 것이며, 이는 NAC18에 대한 확인 랜드마크이다. VS 는 NAC 및 OT로 구성됩니다.
참고 : 전방 commissure의 횡단 세그먼트 이외에 전방 사지가 있으며 전방 commissure, pars anterior라고합니다. - 측면 심실의 전방 뿔 아래의 중간선으로부터 전방 commissure의 횡단 부분을 통해 부분적으로 수평으로 절단하여, 중격 핵을 등쪽으로 그리고 VS 를 심실로 해방시킨다. NAC 와 OT 가 제거 될 측면 표면에서 소량의 피질을 제거하십시오.
- 외부 캡슐 바로 바깥쪽에 만곡된 메스 절단을 통해 ST 의 로스트랄 부분을 위에 놓인 피질로부터 분리하여 피질 샘플에 삼중조직을 포함하지 않도록 주의한다. 이 시점에서 중격 핵/SE 가 보이고이 슬라이스에서 쉽게 가져올 수 있습니다 (그림 4viii).
참고: PFM 의 전방 및 후방 한계는 각각 전방 컴미션 및 유방 몸체와 일치하는 가상의 코로나 평면에 의해 정의됩니다. 내측 한계는 외부 캡슐(18)에 의해 정의된다. - diencephalon의 나머지 반쪽 부분의 측면 표면에서, caudally로 연장되는 rhinal sulcus를 따라 부분적으로 수평으로 자르지 만, 유방 몸체가있는 상상의 코로나 평면 수준까지만. HY의 유모체 평면에서 측면 피질 표면에서 중간 1mm로 연장되는 부분 코로나 절단을하십시오. 여기서, 클라우스트럼의 평면에서의 파라시상 절개는 PFM을 해방시킬 것이다(도 4ix 및 도 4x).
참고 : diencephalon의 나머지 반쪽 절편의 내측 표면에는 유모체, 근막 역반사 및 줄무늬 수질이 포함 된 수많은 해부학 적 특징이 보일 것입니다. 반원형 패턴 (등쪽 오목한 쪽)이 보일 것이며, 이는 시상 과 HY 사이의 여백을 나타냅니다. HY 는 시신경 치아즘 전방 및 전방 commissure anterodorsally 및 mammillary body와 함께 근막 역반사 후방과 함께 중간 시상 단면도에서 쉽게 식별 될 것입니다. 후자의 랜드마크는 아틀라스(17 )와 알비노 마우스 전뇌 문맥(19)에서도 잘 전시되어 있다. - 부분적인 코로나 컷 후방을 유방 몸체에 만들고, 시상 하부 술쿠스만큼 옆으로 만 확장하십시오. 이 시점에서 시상 하부 술커스의 길이를 따라 절단 된 parasagittal은 이제 HY 를 해방시킵니다.
- 측심실의 퇴보를 수반하여 추가적인 변연계 연결과 나머지 변연계 구성 요소를 드러냅니다. 디뇌파론의 나머지 반쪽 부분의 내측면을 볼 때, 곡선 포셉은 기술자가 포닉스를 절단하는 데 사용되는 주변 영역의 다른 섬세한 부분을 조작 할 수있게하고 측심실에 삽입되어 부드럽게 확장되어 무딘 해부를 사용하여 심실을 열고 HC 를 회전 할 수 있으므로 최선의 선택이 될 것입니다. 수직에서 수평면까지 90°. 뾰족한 팁이 정확한 절단에 도움이 될 수 있으므로 맥락막 동맥 / 맥락막 신경총을 절개하기 위해 # 11 블레이드를 사용해야 할 수도 있습니다.
- CNG를 90°(HC와 반대 방향으로)로 돌려 수평면이 되도록 합니다. 포셉을 사용하여 HC를 바깥쪽과 옆으로 180 ° 부드럽게 회전시켜 ERC의 내부 표면을 볼 수있게하고 위쪽을 향하게합니다.
- ERC로부터 발생하는 수초화 섬유의 팬형 방사선은 HC에 대한 투과 경로 및 그의 부착을 포함하는 각다발을 형성하기 위해 수렴하는 것을 볼 수 있을 것이다. 시상과 MB를 180° 등쪽으로 돌려 심실로 AY를 표시합니다.
- 필요한 경우, 시상의 심실 표면의 측면 여백을 따라 AY 에 흐르는 섬유 밴드를 포함하고 AY 의 윤곽선을 명확하게하기 때문에 선로 말단의 부착을 드러내기 위해 광관을 들어 올립니다.
참고 : HC 와 fornix는 전체적으로 명확하게 볼 수 있으며 측면 심실에 중첩되어 쉽게 들어 올릴 수 있습니다. 측심실은 피아 매터로 줄 지어 있고 ERC 의 매우 투명한 하부 측면을 통한 투과 경로의 팬형 기원(20)이 보일 것이다. - 내측 ERC 의 외부 표면은 큰 피라미드 세포의 눈에 띄는 층을 가질 것이다. 또한, 골지 염색 섬유의 치밀한 수렴은 내측 ERC에서 두드러진 특징이 될 것이다. 이 해부 절차에서 측심실을 에버링 한 후,이 섬유는 심실의 내부 표면을 정렬하는 피아 매트를 통해 내측 표면에서 쉽게 볼 수 있으며 매우 눈에 띄는 팬과 같은 구조를 형성합니다.
- 섬유가 하부 혈액으로 모여서 복부 ERC를 내려 놓고 후방으로 확장 한 다음 HC를 천공하기 위해 수직으로 상승합니다. ERC 에서 이러한 팬형 구조는 해부를 목적으로 여백을 정의하는데 사용될 것이다. AY, ERC, CNG 및 HC 구조의 순서로 확인 및 제거한다.
참고: AY 해부를위한 좋은 랜드 마크를 정의하는 것은 다음 단계의 열쇠가 될 것이며 스트리아 터미널이 AY 를 만나는 후방 여백의 접합부가 좋은 포인트가 될 것입니다. - 이 시점에서, 나머지 구조물은 시상 및 MB를 포함한다. 중간 선 rostrocaudal 평면에서 연장 된 등쪽 표면에있는 stria medullaris의 시각화에 의해 시상의 식별을 확인하십시오. 하베눌라에 대한 코로나 컷 코달과 로스트랄에 의해 중뇌로부터 시상을 완전히 분리하고 우수한 콜리큘리로 로스트랄을 분리한다. 이 단계에서 ROC가 저장됩니다.
- 이 시점에서 모든 뇌 영역의 완전한 수집과, 즉시 (각각이 얻어짐에 따라) 추가 처리까지 샘플 플래시를 냉동 저장한다.
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Representative Results
복잡한 뇌 구조와 기능에 대한 우리의 이해는 빠르게 진화하고 개선되고 있습니다. 뇌는 여러 개의 별개의 영역을 포함하고 있으며 분자지도를 구축하면 뇌가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법 논문에서, 우리는 마우스 뇌를 여러 별개의 영역으로 해부하는 것에 대해 논의했다 (표 1). 이 프로토콜에서, 구조는 중요한 랜드 마크를 기반으로 확인되며 즉각적인 해부를 위해 견고성을 유지함으로써 조직을 식염수로 촉촉하게 유지함으로써 달성됩니다. 이 방법은 다른 보고서(21)보다 더 많은 영역을 다루며, 동결된 뇌(22,23)를 사용하는 해부 방법에 보완적이다. 이러한 해부 된 조직은 연구의 요구 사항에 따라 나중에 보존되고 처리 될 수 있습니다. 여기서 논의 된 방법은 두개골에서 뇌를 즉시 제거한 다음 마우스 뇌의 크기를 감안할 때 하류 분석을위한 빠른 방법으로 충분한 조직을 제공하는 해부입니다. 우리 팀은 여러 해부 된 조직에서 RNA를 추출하고 뇌 조직을위한 마이크로 어레이를 사용하여 유전자 발현 프로파일 링을 분석했습니다. AY, HC, MPFC, 중격 영역, 코퍼스 선조체 및 VS 및 결과는15 발표되었다. 이 수확된 뇌는 RNA 추출 전에 몇 달 동안 -80°C에서 보관되었다. 이 방법은 뇌 영역의 하류 유용성을 다양 화하기 위해 다른 방법의 조합으로 채택 될 수 있습니다. 이 해부 방법은 엄격하게 코로나 또는 시상 해부되는 대신 해부학적으로 구별되는 인접한 지역 사이의 랜드 마크를 따르는 데 중점을 둡니다. PTSD16의 공격자 노출 사회적 스트레스 모델 및 RNA 농도와 함께 체중 데이터와 함께 뚜렷한 뇌 영역을 체중 데이터와 함께 수집하여 분광 광도계 판독값을 도 5와 같이 나타내었다.
그림 1: 뚜렷한 조직 유형을 가진 마우스 뇌의 표현 수집. 이 그림은 구조의 외관상 표현이며 매핑된 데이터베이스로 확장되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뇌하수체 제거에 따른 두개골 제거. 뇌 제거를위한 단계적 절차 (i) 제모 후 클램핑 및 유지 (ii) 조직에서 머리카락을 멀리하기 위해 킴 와이프로 클램프를 고정하는 단계 절차 (iii) 근육 제거 전 (iv) 근육 제거 후 (v) 메닝의 분리 (vi) 오비탈 리지에서 절단 된 지구 / 눈 제거 (vii) 정수리 및 전두엽 뼈 제거 (ix) 뇌 표시 및 제거 (x) 뇌 분리 (xi) 뇌하수체 뷰 (xii) 뇌하수체 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 해부 설치 스테이션 이 이미지는 뇌 해부 후 뇌 및 뇌하수체 조직 제거를위한 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뇌 해부. 뇌 제거를 위한 단계적 절차 (i) 뇌의 상면 보기 (ii) 뇌의 등쪽 보기 (iii) 소뇌 제거 (iv) 대뇌 분리 (v) 반구 해부 (vi) 후각 전구 제거 (vii) MPFC, FCX 및 액세서리 후각 해부 (viii) SE, VS 및 ST 해부 (ix) PFM 제거 (x) 변연계 해부 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 각 뇌 조직으로부터 (A) 뇌 조직 중량 및 (B) RNA 농도 및 (C) OD 260/280 샘플 수집 후 생성된 데이터가 도시되어 있다. 여기서 데이터는 이전에 보고된15,16과 같이 연구 그룹으로부터 대조군(n=3-6)으로부터 수집된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| # | 약어 | 뇌 영역에 대한 설명 |
| 1 | 증권 시세 표시기 | 소뇌 |
| 2 | 증권 시세 표시기 | 뇌 줄기 / 뒷다리 뇌 (pons and medulla oblongata) |
| 두 반구로 분리 | ||
| 3 | 산부인과 | 후각 전구 및 액세서리 후각 전구 |
| 4 | 증권 시세 표시기 | 내측 전두엽 피질 |
| 5 | 증권 시세 표시기 | 측면 전두엽 피질 |
| 6 | SE | 중격 또는 중격 영역 |
| 7 | 대 | 복부 선조체는 핵 축적 (NAC) 및 후각 결절 (OT)을 포함합니다. |
| 8 | 세인트 | 전방 및 후부 코퍼스 선조체 |
| 9 | 안녕 | 시상하부 |
| 10 | 증권 시세 표시기 | 피리폼 피질 |
| 11 | 증권 시세 표시기 | 해마 |
| 12 | 증권 시세 표시기 | 엔토히날 피질 |
| 13 | 증권 시세 표시기 | 후부 cingulate 피질 |
| 14 | 바깥 | 편도 |
| 15 | 메가바이트 | 시상이있는 중뇌 |
| 16 | 증권 시세 표시기 | 대뇌 피질의 나머지 부분 |
표 1: 마우스 뇌의 뚜렷한 영역에 대한 설명. 이 표에는 약어로 수집 된 모든 뇌 영역의 목록이 포함되어 있습니다.
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Discussion
포유류의 뇌는 형태학적으로 뚜렷하고 기능적으로 독특한 세포들로 구성된 복잡한 기관으로, 다양한 분자 서명과 전문화되고 분리된 기능을 수행하는 여러 영역을 가지고 있다. 여기에 보고된 해부 절차는 실험실의 요구 사항에 따라 여러 목표를 가질 수 있습니다. 우리 실험실에서 우리는 스트레스16과 같은 PTSD에 노출 된 마우스에서 수집 된 여러 뇌 영역에서 전사를 평가했습니다. 우리는 균주 유전 배경24가 여러 뇌 영역의 발현 수준에 미치는 영향을 더 연구하고 싶습니다. 이 프로토콜에는 실험의 성공적인 재현성을 위해 고려해야 할 여러 중요한 단계가 있습니다. 뇌의 국소화된 영역들 각각은 신경병리학적 상태에서 뚜렷한 역할을 하며, 연구에 적합한 뇌 영역에 대한 상세한 지식이 부족하다. 따라서 뇌 영역과 관련된 데이터 세트를 생성하는 것이 중요합니다. 따라서, 데이터는 뇌 영역을 선택함으로써 질의될 뿐만 아니라 데이터 카테고리(예를 들어, 전사체, 단백질, 세포(cytoarchitectural) 또는 기타)에 의해서도 질의될 수 있고, 보다 정확한 정보를 이끌어낸다. 이전에, 신선한 쥐 뇌 조직에서 후각 구근, 전두엽 피질, 선조체 및 해마와 같은 조직은 현미경(25)을 사용하여 해부되는 것으로 나타났다. 번갈아 가며 뇌가 동결되는 동안 절편을 해부할 수 있고(14) RNA 및 단백질 추출이 뒤따르지만, 이 방법은 명확한 랜드마크에 의해 확인될 수 있는 뇌 영역으로 제한된다. 총 RNA 추출은 유전자 발현 연구(13)를 위해 비레이저 포획 현미경 접근법을 사용할 뿐만 아니라 주요 뇌 영역으로부터의 미세 해부(25) 이후 수행되었다. 여기서 우리는 생리 학적 및 행동 기능을 독점적으로 제어 할 수있는 특정 뇌 구조를 분리하기 위해 신선한 마우스 뇌의 해부에 중점을 둡니다. 우리의 방법은 이미 발표 된 보고서보다 더 많은 지역의 해부를 설명하지만 사용 가능한 다른 해부 방법을 보완합니다. 이 접근법은 조직 및 쇠약 상태와의 연관성에 대한 포괄적 인 평가를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 해부 전략은 새로운 발견에 대한 가능성을 열어주는 기존 샘플 수집 전략에 실행 가능한 옵션을 제공합니다.
본원에 기재된 방법에 의해, 뇌 조직은 장기간 보관을 위해 -80°C로 이송되기 전에 액체 질소에서 스냅 냉동된다. 핵산이나 단백질의 보존을위한 전체 절차 중에 도구와 조직을 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 동결 조직은 나중에 실험실 표준 작동 절차를 사용하여 균질화됩니다. 이러한 뇌 조직 중 일부는 매우 작기 때문에 더 높은 온도에서 분해로부터 표적 분자를 보호하는 균질화 및 추출 과정 중에주의해야합니다.
이 과정에서 특정 조직 영역을 정확히 찾아내기 위해 명확한 랜드 마크를 식별하는 것이 중요합니다. 이것은 조직이 빠르게 부드러워지지 않도록 식염수로 촉촉하게 유지하고 잠시 동안 견고함을 유지함으로써 달성됩니다. 우리의 이전 연구는 대조군과 공격자 노출 마우스 조직(15 ) 사이의 유전자 발현 변화를 비교했으며 해부 중에 사용 된 식염수로 인해 발생하는 어떠한 변화도 연구하지 않았다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이것은 시상 하부에서 시작하여 절개하고 변연계 영역 (AY, HC, ERC)의 국소 분리 음영을 드러내고 더 명확하게 만들 때 180 ° 뒤집는 동안 특히 중요합니다. 변연계는 뇌 깊숙이 위치하고 있으며 다양한 자극에 의해 손상되므로 진단 및 치료적으로 중요합니다. 변연계는 뇌 영역으로 구성되어 있지만이 목록26에 대한 보편적 인 합의는 없습니다. 연구되지는 않았지만, 우리는 식염수 사용의 효과가 미미하거나 전혀 없다고 생각합니다. 이것은 전체 절차가 전체 과정에서 차가운 조건에 따라 약 20 분 동안 지속되기 때문입니다.
뇌 조직 내의 영역은 뇌 아틀라스에 언급 된 랜드 마크를 사용하여 식별됩니다. 이 기술을 사용하면 랜드 마크를 명확하게해야하며이 절차는 순차적으로 수행되어야합니다. 해부는 뇌가 여전히 신선하고 튼튼한 동안 이루어져야합니다. (처음 15 분에서 20 분까지해야합니다) - 그렇지 않으면 랜드 마크가 명확하지 않고 뇌가 더 오래 머무르고 부드러워지면 영역이 구별되지 않습니다.
위에서 설명한 바와 같이, 뇌 내에는 독립적으로 또는 내재적 결합 네트워크와 협력하여 작용하는 다중 기능 영역을 포함하는 하위 영역이 있습니다. 광범위한 차원을 연구하기 위해 이러한 영역을 매우 정밀하게 검색하는 것이 중요합니다. 이것은 각각이 치료 잠재력과 별개의 과정을 제공하는 전문화 된 영역을 결합하여 이러한 개념을 통합하는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
실험 지원을 해주신 Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler 씨, Pamela Spellman 씨, 원고 편집을 해주신 Dana Youssef 여사에게 감사드립니다. USAMRDC의 자금 지원은 감사하게 인정됩니다. 제네바 재단은이 작업에 기여했으며 미 육군 연구 사무소를 통해 군사 및 운영 의학 연구 지역 국장 III의 기금으로 지원되었습니다.
면책 조항:
자료는 Walter Reed Army Institute of Research에서 검토했습니다. 그것의 프리젠 테이션 및 / 또는 출판에 대한 이의는 없습니다. 여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 사적인 견해이며 공식적이거나 육군부 또는 국방부의 진정한 견해를 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 연구는 동물 복지법 및 동물과 관련된 동물 및 실험과 관련된 기타 연방 법령 및 규정을 준수하여 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드, NRC 간행물, 2011 판에 명시된 원칙을 준수합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
