Summary
Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.
Abstract
O cérebro é o centro de comando do sistema nervoso mamífero e um órgão com enorme complexidade estrutural. Protegido dentro do crânio, o cérebro consiste em uma cobertura externa de matéria cinzenta sobre os hemisférios conhecidos como córtex cerebral. Abaixo dessa camada residem muitas outras estruturas especializadas que são essenciais para múltiplos fenômenos importantes para a existência. A aquisição de amostras de regiões cerebrais brutas específicas requer passos de dissecção rápidos e precisos. Entende-se que, no nível microscópico, existem muitas sub-regiões e provavelmente cruzam as fronteiras regionais arbitrárias que impomos para efeitos desta dissecção.
Modelos de camundongos são usados rotineiramente para estudar funções e doenças cerebrais humanas. Alterações nos padrões de expressão genética podem estar confinadas a áreas cerebrais específicas visando um fenótipo específico, dependendo do estado doente. Assim, é de grande importância estudar a regulação da transcrição no que diz respeito à sua organização estrutural bem definida. Uma compreensão completa do cérebro requer estudar regiões cerebrais distintas, definir conexões e identificar diferenças fundamentais nas atividades de cada uma dessas regiões cerebrais. Uma compreensão mais abrangente de cada uma dessas regiões distintas pode abrir caminho para novos e aprimorados tratamentos no campo da neurociência. Aqui, discutimos uma metodologia passo a passo para dissecar o cérebro do rato em dezesseis regiões distintas. Neste procedimento, focamos na remoção e dissecção cerebral do camundongo C57Bl/6J (6-8 semanas) em múltiplas regiões usando marcos neuroanatomáticos para identificar e amostrar regiões cerebrais discretas e relevantes do funcionamento e comportamentalmente relevantes. Este trabalho ajudará a estabelecer uma base forte no campo da neurociência, levando a abordagens mais focadas na compreensão mais profunda da função cerebral.
Introduction
O cérebro, juntamente com a medula espinhal e a retina, compreendem o sistema nervoso central que executa comportamentos complexos, controlados por tipos de células especializadas, precisamente posicionadas e interagindo em todo o corpo1. O cérebro é um órgão complexo com bilhões de neurônios interconectados e glia com circuitos precisos realizando inúmeras funções. É uma estrutura bilateral com dois lobos distintos e diversos componentes celulares2. A medula espinhal conecta o cérebro ao mundo exterior e é protegida por ossos, meninges e fluido cefalorraquidiano e encaminha mensagens de e para o cérebro 2,3,4. A superfície do cérebro, o córtex cerebral, é desigual e tem dobras distintas, chamadas gyri, e sulcos, chamados sulci, que separam o cérebro em centros funcionais5. O córtex é suave em mamíferos com um cérebro pequeno 6,7. É importante caracterizar e estudar a arquitetura do cérebro humano para entender os transtornos relacionados às diferentes regiões cerebrais, bem como seus circuitos funcionais. A pesquisa em neurociências se expandiu nos últimos anos e uma variedade de métodos experimentais estão sendo usados para estudar a estrutura e a função do cérebro. Desenvolvimentos nos campos da biologia molecular e de nível de sistemas iniciaram uma nova era de exploração da complexa relação entre estruturas cerebrais e o funcionamento das moléculas. Além disso, biologia molecular, genética e epigenética estão se expandindo rapidamente, permitindo-nos avançar nosso conhecimento dos mecanismos subjacentes envolvidos na forma como os sistemas funcionam. Essas análises podem ser realizadas de forma muito mais localizada, para ajudar na investigação e desenvolvimento de terapias mais eficazes.
O cérebro mamífero é estruturalmente definido em regiões discretas claramente identificáveis; no entanto, as complexidades funcionais e moleculares dessas estruturas discretas ainda não são claramente compreendidas. A natureza multidimensional e multicamadas do tecido cerebral torna essa paisagem difícil de estudar no nível funcional. Além disso, o fato de que múltiplas funções são executadas pela mesma estrutura e vice-versa complica ainda mais a compreensão do cérebro8. É vital que a abordagem experimental executada para a caracterização estrutural e funcional das regiões cerebrais utilize metodologias precisas de pesquisa para obter consistência na amostragem para correlacionar arquitetura neuroanatomical com função. A complexidade do cérebro foi recentemente explicada usando sequenciamento de células únicas 9,10, como o giro temporal do cérebro humano que é composto por 75 tipos de células distintas11. Comparando esses dados com os de uma região análoga do cérebro do camundongo, o estudo não só revela semelhanças em sua arquitetura e tipos celulares, mas também apresenta as diferenças. Para desvendar os mecanismos complexos, é importante, portanto, estudar diversas regiões do cérebro com plena precisão. Estruturas conservadas e função entre um cérebro humano e rato permitem o uso de um rato como substituto preliminar para elucidar a função cerebral humana e os resultados comportamentais.
Com o avanço das abordagens de biologia de sistemas, a obtenção de informações de regiões cerebrais discretas em roedores tornou-se um procedimento fundamental na pesquisa em neurociência. Embora alguns protocolos como a microdisseção de captura a laser12 possam ser caros, os protocolos mecânicos são baratos e realizados usando ferramentas comumente disponíveis13,14. Usamos várias regiões cerebrais para ensaios transcriômicos15 e desenvolvemos um procedimento prático e rápido para dissecar regiões cerebrais de camundongos de interesse de forma passo a passo em pouco tempo. Uma vez dissecadas, essas amostras podem ser armazenadas imediatamente em condições frias para preservar os ácidos nucleicos e proteínas desses tecidos. Nossa abordagem pode ser realizada mais rapidamente, levando a alta eficiência e permitindo menos chances de deterioração tecidual. Isso, em última análise, aumenta as chances de gerar experimentos reprodutíveis de alta qualidade usando tecidos cerebrais.
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Protocol
O manejo animal e os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais para o cuidado animal. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro de Pesquisa em Saúde Ambiental do Exército dos EUA, agora Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) e realizados em uma instalação credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC).
NOTA: O procedimento será realizado em camundongos machos de seis a oito semanas de idade da cepa C57BL/6j eutanizada por deslocamento cervical16. Não são realizadas perfusões em nosso laboratório, mas este protocolo pode ser modificado pelo qual perfusões para limpar o sangue da vasculatura poderiam ser realizadas. Todos os suprimentos necessários para a dissecção estão listados na Tabela de Materiais. A dissecção é subdividida em três componentes, incluindo a remoção do cérebro, a remoção da glândula pituitária e a dissecção cerebral. A intenção da coleta de tecido cerebral é processá-los para ensaios transcriômicos após extrações de RNA. Assim que a região cerebral é dissecada, transferimos imediatamente cada uma das regiões cerebrais para um frasco congelador já rotulado e, em seguida, armazenamos o frasco em nitrogênio líquido ou -80 °C.
NOTA: O conhecimento completo da neuronatomia é essencial para realizar este procedimento. Seções horizontais e longitudinais, bem como as seções transversais usuais, devem ser estudadas e aprendidas. Uma vez que o tecido cerebral se degrada muito rapidamente, não há tempo para consultar um atlas durante a realização deste procedimento.
1. Remoção do cérebro do rato
- Fixar a maxila da cabeça decapitada com um hemosta (Figura 2i) e usar uma gaze para refletir o couro cabeludo rostrally criando ainda mais um campo seco no dorso do crânio (Figura 2ii).
- Insira a tesoura curva fina no forame magnum para separar as meninges adesórias. Aqui, insira a tesoura na abertura na base do crânio é o forame magnum, onde a medula espinhal passa com a lâmina apontando verticalmente (posição 12 horas), mas paralelamente e pressionando contra a superfície interior do osso da placa basal (ou seja, squama occipital) e girando a lâmina 45° para o lado esquerdo e, em seguida, para o lado direito.
- Continue a girar o pulso para arrancar o osso da placa basal que cortará o meio do osso restante continuando no osso occipital e ossos intraparietais intrometendo os ossos esquerdo e direito até que eles sejam removidos. Da mesma forma, remova o osso occipital e o osso intraparietal para expor o cerebelo.
NOTA: Neste ponto, a estrutura óssea oca chamada bíblica tympanic, na porção posterior ventral do crânio que inclui partes do ouvido médio e interno, pode ser removida a menos que se esteja dissecando os lobos posterior e anterior dos pituitários (Figura 2ii). - Remova os acessórios musculares ao cume temporal usando uma lâmina de tesoura afiada curvada. Coloque um membro da tesoura afiada curva sob a sutura lambdoide penetrando na junção dos seios transversais e sagitários (Figura 2iv).
- Avance a tesoura rostrally ao longo da sutura midsagittal até o bregma e corte-a com muita gentileza enquanto levanta cuidadosamente para cima para evitar laceração de cortices cerebrais. Este é um passo crítico no procedimento (Figura 2v).
- Nesta etapa, os ossos parietal são levantados e girados, raspando assim a superfície interna do osso para identificar e cortar os acessórios meningeais restantes. Segure o osso temporal se intrometendo externamente, longe do cérebro. Remova o osso frontal de cada lado usando uma tesoura curva ou um rongeur na órbita e cortando coronally em um ângulo reto para a crista orbital, mas não mais longe da linha média (Figura 2vii).
- Faça dois cortes paralelos e cerca de 4 mm de distância no plano sagital (Figura 2viii).
NOTA: Não corte ambos os lados com um único golpe. - Remova os fragmentos do osso frontal evitando dilacerar a superfície cerebral (Figura 2ix). Neste ponto, use uma tesoura fina para cortar a dura mater, que deve ser acessível entre as lâmpadas olfativas.
- Inverter suavemente o crânio para permitir que a gravidade ajude na remoção do cérebro, enquanto continua a identificar e cortar os anexos meningeais restantes e os nervos cranianos. O cérebro será liberado cortando o maior nervo trigêmeo ligado ao cérebro e é claramente visível estendendo-se da base do calvarium (Figura 2x).
NOTA: Transfira o cérebro para uma solução salina fria (citrato de sódio sem resfriado de RNase (0,9%) ou fisiológico (0,9%) para dissecção posterior.
2. Dissecção dos Pituitários Anteriores e Posteriores
NOTA: As glândulas pituitárias são cobertas por uma membrana muito resistente como uma tenda, com um cume que corre lateralmente entre os nervos trigêmeos esquerdo e direito. Essas estruturas são extremamente macias e delicadas e, como tal, recomenda-se que os lobos posteriores e anteriores das glândulas pituitárias sejam dissecados separadamente em estágios, in situ, diretamente do crânio. Imediatamente após a dissecação, transfira a respectiva glândula pituitária para um frasco pré-rotulado e armazene o frasco em nitrogênio líquido de preferência -80 °C. A glândula pituitária repousa exatamente sobre a junção dos ossos occipital e basefenóide; se flexionarem, a arquitetura pituitária é interrompida.
- Mantenha o bullae auditivo intacto para garantir que a anatomia pituitária esteja intacta e facilmente identificável (Figura 2ix).
- Disseca o lobo posterior da pituitária seguido pelo lobo anterior da pituitária, do restante do crânio.
- Faça um corte parasagittal extremamente pequeno em ambos os lados no cume da tenda membranous e levante o lobo posterior da pituitária com fórceps ultrafinas, tomando cuidado para não interromper o tecido pituitário anterior (Figura 2x).
- Faça um corte sagital entre as margens laterais do lobo anterior da pituitária e o nervo trigêmeo mais próximo e levante o lobo anterior da pituitária posteriormente (Figura 2x).
3. Dissecção cerebral do rato
NOTA: Imediatamente após a remoção do cérebro e da hipófise, uma dissecção adicional é realizada em um bloco de aço inoxidável pré-refrigerado (Figura 3). Pós-dissecção, transfira as regiões cerebrais para frascos pré-rotulados e transfira os frascos de preferência para nitrogênio líquido de outra forma -80 °C. Estruturas produzidas pelo método de cima para baixo (em ordem cronológica) potencialmente incluem o seguinte: cerebelo (CB), tronco cerebral/cérebro traseiro (pons e medulla oblongata) (HB), lâmpadas olfativas (OB) como lâmpadas olfativas acessórias, córtex pré-frontal medial (MPFC), córtex pré-frontal lateral (FCX), estriado de corpus anterior e posterior (ST), estriatum ventral (VS) composto pelo núcleo accumbens (NAC) e tubérculo olfativo (OT), septum (SE), área pré-óptica, córtex piriforme (PFM), hipotálamo (HY), amígdala (AY), hipocampo (HC), córtex cingulado posterior (GNV), córtex entorhinal (ERC), cérebro médio (MB) com tálamo e resto do córtex cerebral (ROC) (Tabela 1). Regiões específicas serão discutidas por ordem de isolamento, trabalhando com um único hemisfério.
- Tome muito cuidado para remover o cérebro do calvarium, pois os marcos podem ser destruídos no caso de haver lacerações. Nesta etapa, realizará todas as dissecções utilizando proteção facial, especificamente, uma viseira de joalheiros 7x, e a iluminação será fornecida por lâmpadas cirúrgicas posicionadas sobre cada um dos ombros do dissetor. Grande parte da dissecção será realizada usando fórceps pequenos e curvos (ou seja, fórceps graefe).
- Coloque o cérebro em um bloco de aço inoxidável (Figura 4i e Figura 4ii). Mantenha o bloco frio ao redor dele com gelo e uma solução salina gelada. Moist o tecido periodicamente com solução salina gelada para preservar as estruturas.
- Posicione o cérebro de tal forma que os cortices cerebrais estão voltados para cima. Utilizando pequenas fórceps curvas, reflita suavemente o CB expondo os peduncles cerebelar superior, médio e inferior e remova o CB (Figura 4iii e Figura 4iv).
- Faça um corte midsagittal começando do dorso e entre o OB e os hemisférios cerebrais (Figura 4v) e certifique-se de não estender mais longe do que a comissura anterior. Neste ponto, os vermis podem ser facilmente separados das porções laterais e HB será obtido por um corte coronal na margem anterior dos pons.
- Separe a medula por um corte coronal na margem posterior dos pons.
NOTA: Neste ponto, o diencephalon, a parte posterior do cérebro contendo o epitálamo, tálamo, hipotálamo e tálamo ventral e o terceiro ventrículo, será virado para cima, e um corte de meados do país será feito a partir do quiasmo óptico rostrally. A dissecção dos hemisférios cerebrais seguida da remoção de OB de um dos hemisférios será nesta etapa (Figura 4v e Figura 4vi). - Separe os hemisférios cerebrais (Figura 4v) antes de dissecar ainda mais o diencephalon (Figura 4v). A abordagem dorsal será empregada por dissecção contundente cuidadosa para preservar os marcos médios criticamente salientes. Visualize cada conexão interhemisférica antes de cortá-las, pois isso minimizará a possibilidade de desvio da linha média.
NOTA: Nesta etapa, um hemisfério cerebral (Hemibrain) pode ser preservado e o segundo hemisfério pode ser usado para dissecção adicional - Deslize as lâminas fechadas de um pequeno fórceps curvos, sob o caloso corpus e espalhe suavemente para retrair o neocórtex bilateralmente. O corpus calosum é um amplo grupo de fibras nervosas que une os dois hemisférios que serão dissecados sem rodeios por beliscar com as fórceps, sem perturbar as estruturas de linha média que estão abaixo.
NOTA: Rostos mesiais dos hemisférios terão múltiplos marcos visíveis, como estruturas mielidas como o gênero do corpo caloso, os fornices e a comissura anterior. Além disso, embora alguns milímetros laterais à linha média, o trato mamilotalâmico e o fasciculus retroflexus também podem ser visíveis. - Bissecte as múltiplas estruturas que cruzam a linha média. Isso incluirá o corpus calosum, comissariação anterior, ventral fornix commissure, comissariação posterior, comissariação dorsal fornix, descussação supra mammillary, commissure de colliculus superior, ventral fornix commissure, e fibras talamicas periventriculares.
- Tome cuidado especial nesta etapa dentro ou perto da linha média que pode ser parcialmente comprometida pelo método de abordagem dorsal. Todas as estruturas de acompanhamento estão em risco se não forem realizadas com cuidado.
- Remova o OB (cortices olfativos em forma de cunha) e olfatos acessórios seguidos da coleta do MPFC (córtex cingulado área 1, pré-cílimico, infralimíbico, orbital medial e cortices motores secundários [M2]) e FCX por um corte coronal que é feito 1mm anterior ao genu do calosum corpus (Figura 4vii). Divida a seção resultante por um corte parasagittal de 1/3 da distância do medial para a superfície lateral, rendendo MPFC medianamente e restante do FCX lateralmente. O córtex cingulado é o análogo do camundongo do MPFC.
NOTA: Esta fatia de tecido também conterá uma pequena quantidade do M2 (córtex motor secundário) 17 e é inevitável. - Faça um corte coronal ao nível da comissura anterior levando à visibilidade de pars membro anterior do comissure anterior na seção transversal na face rostral da seção coronal resultante, enquanto a porção transversal será revelada na face caudal da seção Este é um marco confirmatório para o NAC18. O VS é composto pelo NAC e OT.
NOTA: Há um membro anterior além do segmento transversal na comissura anterior e é chamado de comissure anterior, pars anterior. - Corte horizontalmente horizontalmente através da porção transversal da comissura anterior da linha média sob o chifre anterior do ventrículo lateral, para liberar o núcleo septo dorsalmente e o VS ventrally. Remova a pequena quantidade do córtex da superfície lateral onde o NAC e o OT serão removidos.
- Separe a porção rostral do ST do córtex sobrelada através de corte curvo de bisturi fora da cápsula externa, tomando cuidado para não incluir tecido estriatal na amostra cortical. Neste ponto, os núcleos septos /SE serão visíveis e podem ser facilmente retirados desta fatia (Figura 4viii).
NOTA: Os limites anteriores e posteriores do MPF são definidos por planos coronais imaginários que estão em consonância com a comissura anterior e os corpos mammillários, respectivamente. O limite medial é definido pela cápsula externa18. - Na superfície lateral da seção hemi restante do diencephalon, faça um corte horizontal parcial ao longo do sulco rinal estendendo-se caudally, mas apenas até o nível de plano coronal imaginário com os corpos mammillary. Faça um corte coronal parcial, estendendo-se medialmente 1 mm da superfície cortical lateral no plano dos corpos mammillary do HY. Aqui, a incisão para-sagitar no plano do claustrum libertará o FPM (Figura 4ix e Figura 4x).
NOTA: Na superfície medial da seção hemi remanescente do diencephalon, numerosas características anatômicas serão visíveis, incluindo os corpos mammillários, o fasciculus retroflexus e o estria medullaris. Um padrão semicircular (lado côncavo dorsal) será visível, o que denota a margem entre o tálamo e o HY. O HY será facilmente identificado na vista da seção midsagittal por meio do quiasma óptico anteroventrally e anterior comissure anterodorsalmente e os corpos mammillários, juntamente com o fasciculus retroflexus posteriormente. Estes últimos marcos foram bem exibidos no atlas17 , bem como no contexto do cérebro do rato albino19. - Faça um corte coronal parcial posterior aos corpos mammillários, estendendo-se apenas tão lateralmente quanto o sulco hipotalâmico. Neste ponto um corte parasagittal ao longo do comprimento do sulco hipotalâmico agora libera o HY .
- Implica a eversão do ventrículo lateral para revelar conexões intra-límbicas adicionais e os demais componentes do sistema límbico. Visualizando a face medial da seção hemi remanescente do diencephalon, fórceps curvos serão a melhor opção, pois permitem que o técnico manipule em torno de outras seções delicadas da área circundante usadas para cortar o fornix e é inserido no ventrículo lateral e suavemente expandido, usando dissecção sem cortes para abrir o ventrículo e girar o HC 90° da vertical ao plano horizontal. Pode ser necessário usar a lâmina #11 para separar a artéria coroidal/plexo coroide, pois a ponta pontiaguda pode ajudar com cortes precisos.
- Gire o GNV 90° (mas na direção oposta do HC) para estar no plano horizontal. Com fórceps, gire suavemente o HC mais 180° para fora e lateralmente, o que tornará visível a superfície interna do ERC e voltada para cima.
- Uma radiação semelhante a ventilador de fibras mielidas decorrentes do ERC será vista convergindo para formar o feixe angular, incluindo o caminho perfurante e sua ligação com o HC. Gire o tálamo e o MB 180° dorsalmente para revelar o AY.
- Se necessário, levante o trato óptico para revelar a fixação do terminal de estria, pois conterá faixas de fibras que correm ao longo da margem lateral da superfície ventricular do tálamo para o AY e deixará os contornos do AY claros.
NOTA: O HC e o fornix serão claramente visíveis em sua totalidade, aninhados no ventrículo lateral e, podem ser facilmente retirados. O ventrículo lateral será forrado com pia mater e origens semelhantes aos ventiladores do caminho perforante através do aspecto subpial muito transparente do ERC será visível 20. - A superfície externa do ERC medial terá uma camada proeminente visível de grandes células piramiptárias. Além disso, uma densa convergência de fibras de manchas de Golgi será uma característica marcante no ERC medial. Neste procedimento de dissecção, após o deslocamento do ventrículo lateral, essas fibras serão facilmente visíveis na superfície medial através da pia mater, que reveste as superfícies internas dos ventrículos, formando uma estrutura muito proeminente como um ventilador.
- Observe que as fibras estão se acumulando subpially, descendo e deixando o ERC ventral, estendendo-se posteriormente e, em seguida, subindo verticalmente para perfurar o HC. Esta estrutura semelhante ao ventilador no ERC será usada para definir as margens para fins de dissecção. Identificar e remover na ordem das estruturas AY, ERC, GNV e HC .
NOTA: Definir um bom marco para a dissecção AY será uma chave para o próximo passo e a junção na margem posterior onde stria terminalis atende o AY será um bom ponto. - Neste ponto, as estruturas restantes incluem o tálamo e o MB. Confirme a identificação do tálamo pela visualização da estria medullaris em sua superfície dorsal estendendo-se no plano rostrocaudal midline. Separe o tálamo completamente do cérebro médio por um corte coronal caudal para a habenula e rostral para o colegiado superior. O ROC está salvo nesta etapa.
- Neste ponto, a coleta completa de todas as regiões cerebrais e, imediatamente (como cada uma é obtida) armazena as amostras flash congelado até um processamento adicional.
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Representative Results
Nossa compreensão da complexa estrutura e função cerebral está evoluindo rapidamente e melhorando. O cérebro contém várias regiões distintas e construir um mapa molecular pode nos ajudar a entender melhor como o cérebro funciona. Neste artigo de método, discutimos a dissecação do cérebro do camundongo em múltiplas regiões distintas (Tabela 1). Neste protocolo, as estruturas são identificadas com base nos marcos críticos e são alcançadas mantendo o tecido úmido com solução salina, mantendo sua robustez para dissecção imediata. O método abrange mais regiões do que outros relatórios21 e é complementar aos métodos de dissecção utilizando cérebros congelados22,23. Esses tecidos dissecados podem ser preservados e processados posteriormente, dependendo das exigências do estudo. O método discutido aqui é a remoção imediata do cérebro do crânio seguido de dissecção que fornece tecido suficiente de forma rápida para ensaios a jusante dado o tamanho do cérebro do camundongo. Nossa equipe extraiu RNA de múltiplos tecidos dissecados e ensaiou para perfil de expressão genética usando microarrays para tecidos cerebrais; AY, HC, MPFC, região septal, corpus e VS e os resultados foram publicados15. Estes cérebros colhidos foram armazenados a -80°C por vários meses antes da extração do RNA. Este método pode ser adotado em combinação de outros métodos para diversificar a utilidade a jusante das regiões cerebrais. Este método de dissecção é focado em seguir marcos entre regiões anatomicamente distintas adjacentes em vez de serem dissecções estritamente coronais ou sagidas. As distintas regiões cerebrais, juntamente com os dados de peso, foram coletadas no âmbito do estudo, o agressor expôs o modelo de estresse social das concentrações de TEPT16 e RNA, juntamente com leituras espectrofotométricas, como Figura 5.
Figura 1: Representação do cérebro do rato com tipos de tecidos distintos coletados. Este número é uma representação cosmética das estruturas e não é dimensionado para nenhum banco de dados mapeado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Remoção cerebral da Cavidade Craniana Seguida de Remoção pituitária. Procedimento stepwise para remoção cerebral (i) fixação e retenção após a depilação (ii) fixação do grampo com um Kimwipe para manter o cabelo longe do tecido (iii) antes de remover os músculos (iv) após a remoção dos músculos (v) separação de méninges (vi) remoção de globo/olho (vii) corte na crista orbital (viii) remoção de parietal e ossos frontais (ix) exibição cerebral e remoção (x) descolamento cerebral (xi) visão pituitária (xii) remoção pituitária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estação de Configuração de dissecação. Esta imagem mostra a configuração para dissecção cerebral pós-cérebro e remoção de tecidos pituitários. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dissecção cerebral. Procedimento stepwise para remoção cerebral (i) visão superior do cérebro (ii) visão dorsal do cérebro (iii) remoção de cerebelo (iv) separação cerebral (v) hemisférios dissecção (vi) remoção de lâmpada olfativa (vii) MPFC, FCX e dissecção olfativa acessório (viii) SE, VS e dissecção DE ST (ix) Dissecção do sistema pfm (x)
Figura 5: Dados gerados após coleta de amostras (A) Peso do tecido cerebral e (B) concentração de RNA e (C) OD 260/280 de cada tecido cerebral é mostrado. Aqui os dados são coletados de grupos de controle (n= 3-6) de um grupo de estudo, conforme relatado anteriormente15,16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| # | Abreviaturas | Descrição da região cerebral |
| 1 | Cb | Cerebelo |
| 2 | Hb | Cérebro cerebral/cérebro traseiro (pons e medulla oblongata) |
| Separe-se nos dois hemisférios | ||
| 3 | Ob | Lâmpadas olfativas e lâmpadas olfativas de acessórios |
| 4 | MPFC | Córtex pré-frontal medial |
| 5 | FCX | Córtex pré-frontal lateral |
| 6 | SE | Septo ou região septal |
| 7 | Vs | O estriato ventral inclui o núcleo accumbens (NAC) e o tubérculo olfativo (OT) |
| 8 | St | Estriado de corpus anterior e posterior |
| 9 | Hy | Hipotálamo |
| 10 | PFM | Córtex piriforme |
| 11 | Hc | Hipocampo |
| 12 | ERC | Córtex entorhinal |
| 13 | GNV | Córtex cingulado posterior |
| 14 | Ay | Amígdala |
| 15 | Mb | Midbrain com tálamo |
| 16 | Roc | Restante do córtex cerebral |
Tabela 1: Descrição de Regiões Distintas do Cérebro de Rato. Esta tabela contém lista de todas as regiões cerebrais coletadas com sua abreviação.
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Discussion
O cérebro mamífero é um órgão complexo composto por uma matriz de células morfologicamente distintas e funcionalmente únicas com diversas assinaturas moleculares e múltiplas regiões que realizam funções especializadas e discretas. O procedimento de dissecção aqui relatado pode ter múltiplas metas dependendo dos requisitos do laboratório. Em nosso laboratório avaliamos a transcrição em várias regiões cerebrais coletadas de camundongos expostos ao TEPT como o estresse16 . Gostaríamos de estudar mais o impacto do fundo genético da cepa24 nos níveis de expressão em múltiplas regiões cerebrais. Este protocolo tem múltiplas etapas críticas que precisam ser consideradas para a reprodutibilidade bem sucedida dos experimentos. Cada uma das regiões localizadas do cérebro desempenha um papel distinto na condição neuropatológica e falta conhecimento detalhado da região cerebral apropriada para estudar. Por isso, é importante gerar o conjunto de dados relativo à região cerebral. Assim, os dados podem não apenas ser consultados selecionando a região cerebral, mas também por categoria de dados (por exemplo, Transcriptome, proteína, celular (citoarchitectural), ou outro) levando a informações mais precisas. Anteriormente, tecidos como bulbo olfativo, córtex frontal, estriato e hipocampo em tecidos cerebrais frescos de ratos foram mostrados como dissecados usando um microscópio25. Alternadamente, seções podem ser dissecadas enquanto o cérebro está congelado14 seguido por extrações de RNA e proteínas, mas este método é limitado a regiões cerebrais que podem ser identificadas por marcos claros. Extrações totais de RNA foram transportadas após a microdisseção25 das principais regiões cerebrais, bem como usando a abordagem de microscopia de captura não laser para estudosde expressão genética 13. Aqui nos concentramos na dissecção do cérebro de camundongos frescos para separar as estruturas cerebrais específicas que têm controle dedicado sobre funções fisiológicas e comportamentais. Nosso método explica a dissecação de mais regiões do que relatórios já publicados, porém é complementar a outros métodos de dissecção disponíveis. Essa abordagem pode ajudar a fornecer uma avaliação abrangente dos tecidos e sua associação com condições debilitantes. Essa estratégia de dissecção fornece uma opção viável às estratégias de coleta de amostras existentes que abrem possibilidades para novas descobertas.
Com o método descrito aqui, os tecidos cerebrais são congelados em nitrogênio líquido antes de transferir para -80 °C para armazenamento a longo prazo. É importante que as ferramentas e tecidos sejam mantidos frios durante todo o procedimento para preservação de ácidos nucleicos ou proteínas. Estes tecidos congelados são homogeneizados mais tarde usando procedimentos operacionais padrão de laboratório. Alguns desses tecidos cerebrais são muito pequenos e devem ser tomados cuidados durante o processo de homogeneização e extração protegendo moléculas-alvo da degradação a temperaturas mais altas.
Nesse processo, é importante identificar marcos claros para identificar as regiões específicas do tecido. Isso é conseguido mantendo o tecido úmido com solução salina para evitar que ele fique rapidamente macio e mantendo sua robustez por um tempo. Nossos estudos anteriores compararam mudanças de expressão genética entre controle e agressor expostos tecidos de camundongos15 e não estudaram nenhuma alteração causada devido ao soro fisiológico utilizado durante a dissecção. Em nossa experiência, isso é especialmente importante durante a incisão a partir do hipotálamo e da inversão de 180° à medida que expõe e torna o sombreamento da separação regional das regiões límbicas (AY, HC, ERC) óbvio e mais claro. O sistema límbico está situado no interior do cérebro e é danificado por uma variedade de estímulos, e, portanto, é importante diagnóstico e terapeuticamente. Há sistema límbico composto por regiões cerebrais, porém não há acordo universal nesta lista26. Embora não estudados, achamos que há efeitos mínimos ou não do uso de soro fisiológico. Isso porque todo o procedimento dura cerca de 20 minutos após condições frias durante todo o processo.
Regiões dentro do tecido cerebral são identificadas usando marcos mencionados em atlas cerebrais. Usando essa técnica, os marcos precisam ser claros e este procedimento deve ser feito sequencialmente. A dissecção tem que ser feita enquanto o cérebro ainda está fresco e resistente; (tem que ser feito com os primeiros 15 a 20 minutos) - caso contrário, os marcos não serão claros e as regiões não serão distintas se o cérebro permanecer por mais tempo e ficar mais suave.
Como descrito acima, dentro do cérebro estão sub-regiões, contendo múltiplas áreas funcionais que atuam independentemente ou em coordenação com redes conectivas intrínsecas. É importante recuperar essas regiões com grande precisão para estudar suas dimensões amplas. Isso ajudará a integrar esses conceitos, combinando as regiões especializadas onde cada uma está servindo um processo distinto com um potencial terapêutico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos à Sra. Seshmalini Srinivasan, ao Sr. Stephen Butler e à Sra. Pamela Spellman por assistência experimental e à Sra. Dana Youssef por editar o manuscrito. O apoio ao financiamento da USAMRDC é reconhecido com gratidão. A Fundação Genebra contribuiu para este trabalho e foi apoiada por fundos da Área de Pesquisa de Medicina Militar e Operacional III através do Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA.
Disclaimer:
O material foi revisado pelo Instituto de Pesquisa do Exército Walter Reed. Não há objeção à sua apresentação e/ou publicação. As opiniões ou afirmações aqui contidas são as opiniões privadas do autor, e não devem ser interpretadas como oficiais, ou como refletir verdadeiras visões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. A pesquisa foi conduzida sob um protocolo aprovado de uso de animais em uma instalação credenciada pela AAALAC em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e outros estatutos e regulamentos federais relativos a animais e experimentos envolvendo animais e adere aos princípios indicados no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Edição NRC Publication, edição de 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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