Summary
Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.
Abstract
Beyin, memeli sinir sisteminin komuta merkezi ve muazzam yapısal karmaşıklığa sahip bir organdır. Kafatasının içinde korunan beyin, serebral korteks olarak bilinen yarımküreler üzerindeki gri cevherin dış kaplamasından oluşur. Bu katmanın altında, varoluş için önemli olan çoklu fenomenler için gerekli olan birçok başka özel yapı bulunur. Belirli brüt beyin bölgelerinin örneklerini elde etmek, hızlı ve hassas diseksiyon adımları gerektirir. Mikroskobik düzeyde, birçok alt bölgenin var olduğu ve muhtemelen bu diseksiyonun amacı için dayattığımız keyfi bölgesel sınırları aştığı anlaşılmaktadır.
Fare modelleri, insan beyninin fonksiyonlarını ve hastalıklarını incelemek için rutin olarak kullanılır. Gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, hastalıklı duruma bağlı olarak belirli bir fenotipi hedef alan belirli beyin bölgeleriyle sınırlı olabilir. Bu nedenle, transkripsiyonun düzenlenmesini iyi tanımlanmış yapısal organizasyonu açısından incelemek büyük önem taşımaktadır. Beynin tam olarak anlaşılması, farklı beyin bölgelerini incelemeyi, bağlantıları tanımlamayı ve bu beyin bölgelerinin her birinin faaliyetlerindeki temel farklılıkları tanımlamayı gerektirir. Bu farklı bölgelerin her birinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sinirbilim alanında yeni ve geliştirilmiş tedavilerin yolunu açabilir. Burada, fare beynini on altı farklı bölgeye ayırmak için adım adım bir metodolojiyi tartışıyoruz. Bu prosedürde, erkek fare C57Bl / 6J (6-8 haftalık) beyin çıkarılmasına ve nöroanatomik işaretleri kullanarak birden fazla bölgeye diseksiyonuna odaklandık. Bu çalışma, sinirbilim alanında güçlü bir temel oluşturmaya yardımcı olacak ve beyin fonksiyonunun daha derin anlaşılmasında daha odaklı yaklaşımlara yol açacaktır.
Introduction
Beyin, omurilik ve retina ile birlikte, tüm vücutta uzmanlaşmış, hassas bir şekilde konumlandırılmış ve etkileşime giren hücre tipleri tarafından kontrol edilen karmaşık davranışları yürüten merkezi sinir sistemini içerir1. Beyin, milyarlarca birbirine bağlı nöron ve glia'nın sayısız işlevi yerine getiren hassas devrelere sahip karmaşık bir organdır. İki ayrı lob ve çeşitli hücresel bileşenlere sahip iki taraflı bir yapıdır2. Omurilik beyni dış dünyaya bağlar ve kemik, meninksler ve beyin omurilik sıvısı tarafından korunur ve mesajları beyne yönlendirir 2,3,4. Beynin yüzeyi, serebral korteks, düzensizdir ve gyri adı verilen farklı kıvrımlara ve beyni fonksiyonel merkezlere ayıran sulci adı verilen oluklara sahiptir5. Korteks, küçük bir beyne sahip memelilerde pürüzsüzdür 6,7. Farklı beyin bölgeleriyle ilgili bozuklukları ve fonksiyonel devrelerini anlamak için insan beyninin mimarisini karakterize etmek ve incelemek önemlidir. Sinirbilim araştırmaları son yıllarda genişlemiştir ve beynin yapısını ve işlevini incelemek için çeşitli deneysel yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler ve sistem düzeyinde biyoloji alanlarındaki gelişmeler, beyin yapıları ile moleküllerin işleyişi arasındaki karmaşık ilişkiyi araştırmak için yeni bir çağ başlatmıştır. Ek olarak, moleküler biyoloji, genetik ve epigenetik hızla genişlemekte ve sistemlerin nasıl işlediğine dahil olan temel mekanizmalar hakkındaki bilgimizi geliştirmemizi sağlamaktadır. Bu analizler, daha etkili tedavilerin araştırılmasını ve geliştirilmesini hedeflemeye yardımcı olmak için çok daha lokalize bir temelde gerçekleştirilebilir.
Memeli beyni yapısal olarak açıkça tanımlanabilir ayrı bölgelere tanımlanır; Bununla birlikte, bu ayrık yapıların fonksiyonel ve moleküler karmaşıklıkları henüz net olarak anlaşılamamıştır. Beyin dokusunun çok boyutlu ve çok katmanlı doğası, bu manzaranın işlevsel düzeyde incelenmesini zorlaştırmaktadır. Ek olarak, birden fazla fonksiyonun aynı yapı tarafından yerine getirilmesi ve bunun tersi de beynin anlaşılmasını daha da zorlaştırmaktadır8. Beyin bölgelerinin yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yürütülen deneysel yaklaşımın, nöroanatomik mimariyi fonksiyonla ilişkilendirmek için örneklemede tutarlılık sağlamak için hassas araştırma metodolojileri kullanması hayati önem taşımaktadır. Beynin karmaşıklığı son zamanlarda, 75 farklıhücre tipinden oluşan insan beyninin temporal girusu gibi 9,10 tek hücreli dizileme kullanılarak açıklanmıştır. Bu verileri fare beyninin benzer bir bölgesinden gelenlerle karşılaştırarak, çalışma sadece mimarilerinde ve hücre tiplerinde benzerlikler ortaya koymakla kalmıyor, aynı zamanda farklılıkları da sunuyor. Bu nedenle, karmaşık mekanizmaları çözmek için, beynin çeşitli bölgelerini tam hassasiyetle incelemek önemlidir. Bir insan ve fare beyni arasındaki korunmuş yapılar ve işlevler, bir farenin insan beyninin işlevini ve davranışsal sonuçlarını aydınlatmak için bir ön vekil olarak kullanılmasını sağlar.
Sistem biyolojisi yaklaşımlarının ilerlemesiyle birlikte, kemirgenlerde ayrık beyin bölgelerinden bilgi elde etmek, sinirbilim araştırmalarında kilit bir prosedür haline gelmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu12 gibi bazı protokoller pahalı olsa da, mekanik protokoller ucuzdur ve yaygın olarak bulunan araçlar kullanılarak gerçekleştirilir13,14. Transkriptomik tahliller için birden fazla beyin bölgesi kullandık15 ve fare beyninin ilgilendiği bölgeleri kısa sürede adım adım incelemek için uygulamalı ve hızlı bir prosedür geliştirdik. Disseke edildikten sonra, bu dokulardaki nükleik asitleri ve proteinleri korumak için bu numuneler hemen soğuk koşullarda saklanabilir. Yaklaşımımız daha hızlı gerçekleştirilebilir, bu da yüksek verimliliğe yol açar ve doku bozulması için daha az şans sağlar. Bu sonuçta, beyin dokularını kullanarak yüksek kaliteli, tekrarlanabilir deneyler üretme şansını arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan elleçleme ve deneysel prosedürler, hayvan bakımı için Avrupa, ulusal ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ordusu Çevre Sağlığı Araştırma Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve şimdi Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü (WRAIR) tarafından onaylandı ve Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir tesiste gerçekleştirildi.
NOT: Prosedür, servikal çıkık16 ile ötenazi yapılan C57BL / 6j suşunun altı ila sekiz haftalık erkek fareleri üzerinde gerçekleştirilecektir. Laboratuvarımızda perfüzyon yapılmamaktadır, ancak bu protokol vaskülatürden kanı temizlemek için perfüzyonların yapılabileceği şekilde modifiye edilebilir. Diseksiyon için gerekli tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Diseksiyon, beynin çıkarılması, hipofiz bezinin çıkarılması ve beyin diseksiyonu dahil olmak üzere üç bileşene ayrılır. Beyin dokusu toplamanın amacı, RNA ekstraksiyonlarını takiben transkriptomik testler için bunları işlemektir. Beyin bölgesi diseke edilir edilmez, beyin bölgelerinin her birini derhal önceden etiketlenmiş bir dondurucu şişesine aktarırız ve daha sonra şişeyi sıvı azot veya -80 ° C'de depolarız.
NOT: Bu prosedürü gerçekleştirmek için nöroanatomi hakkında kapsamlı bilgi gereklidir. Yatay ve uzunlamasına bölümlerin yanı sıra normal enine kesitler de incelenmeli ve öğrenilmelidir. Beyin dokusu çok hızlı bir şekilde bozunduğundan, bu prosedürü uygularken bir atlasa danışmak için zaman yoktur.
1. Fare Beyninin Çıkarılması
- Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin (Şekil 2i) ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez pedi kullanın ve kafatasının dorsumunda kuru bir alan oluşturun (Şekil 2ii).
- İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Burada, makası kafatasının tabanındaki açıklığa yerleştirin, omuriliğin dikey olarak (saat 12 pozisyonunda) bıçakla geçtiği, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine (yani oksipital squama) paralel ve bastırdığı ve bıçağı kırk beş ° sol tarafa ve daha sonra sağ tarafa döndürdüğü foramen magnumdur.
- Oksipital kemiğe devam eden kalan kemiğin ortasını kesecek bazal plaka kemiğini ve kemikleri çıkarılana kadar sola ve sağa meraklı intraparietal kemikleri kesmek için bileği döndürmeye devam edin. Benzer şekilde, beyinciği açığa çıkarmak için oksipital kemiği ve intraparietal kemiği çıkarın.
NOT: Bu noktada, kafatasının orta ve iç kulağın kısımlarını çevreleyen ventral posterior kısmında, timpanik bullae adı verilen içi boş kemikli yapı, hipofizlerin arka ve ön lobları diseke edilmediği sürece çıkarılabilir (Şekil 2iii). - Kavisli keskin bir makas bıçağı kullanarak zamansal sırttaki kas ataşmanlarını çıkarın. Kavisli keskin makasın bir uzvunu enine ve sagital sinüslerin birleşme noktasına nüfuz eden lambdoid sütür altına yerleştirin (Şekil 2iv).
- Makası midsagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için dikkatlice yukarı doğru kaldırırken çok nazikçe kesin. Bu, prosedürde kritik bir adımdır (Şekil 2v).
- Bu adımda, parietal kemikler kaldırılır ve döndürülür, böylece kalan meningeal ataşmanları tanımlamak ve kesmek için kemiğin iç yüzeyi kazınır. Temporal kemiği dışa doğru meraklı bir şekilde, beyinden uzakta kavrayın. Ön kemiği her iki taraftan kavisli makas veya bir rongeur kullanarak yörüngeye çıkarın ve yörünge sırtına dik açıyla koronal olarak kesin, ancak orta çizgiden daha fazla değil (Şekil 2vii).
- Sagital düzlemde paralel ve yaklaşık 4 mm aralıklarla iki kesim yapın (Şekil 2viii).
NOT: Her iki tarafı da tek bir vuruşla kesmeyin. - Beyin yüzeyinin yırtılmasından kaçınarak frontal kemiğin parçalarını çıkarın (Şekil 2ix). Bu noktada, koku alma ampulleri arasında erişilebilir olması gereken dura mater'i kesmek için ince bir makas kullanın.
- Yerçekiminin beynin çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını yavaşça ters çevirin, kalan meningeal ekleri ve kraniyal sinirleri tanımlamaya ve kesmeye devam edin. Beyin, beyne bağlı en büyük trigeminal sinir kesilerek serbest bırakılır ve kalvaryum tabanından uzanan açıkça görülebilir (Şekil 2x).
NOT: Daha fazla diseksiyon için beyni soğuk bir salin çözeltisine (buz gibi soğuk RNaz içermeyen sodyum sitrat (% 0.9) veya fizyolojik (% 0.9) salin) aktarın.
2. Ön ve Arka Hipofizlerin Diseksiyonu
NOT: Hipofiz bezleri, sol ve sağ trigeminal sinirler arasında yanal olarak uzanan bir sırt ile çok sert bir çadır benzeri zarla kaplıdır. Bu yapılar son derece yumuşak ve hassastır ve bu nedenle, hipofiz bezlerinin arka ve ön loblarının doğrudan kafatasından ayrı aşamalarda, in situ olarak diseke edilmesi önerilir. Diseksiyondan hemen sonra, ilgili hipofiz bezini önceden etiketlenmiş bir şişeye aktarın ve şişeyi tercihen -80 ° C'de sıvı azotta saklayın. Hipofiz bezi tam olarak oksipital ve bazfenoid kemiklerin birleşme noktasına dayanır; eğer esnerlerse, hipofiz mimarisi bozulur.
- Hipofiz anatomisinin sağlam ve kolayca tanımlanabildiğinden emin olmak için işitsel bülleri sağlam tutun (Şekil 2ix).
- Hipofizin arka lobunu ve ardından hipofizin ön lobunu kafatasının geri kalanından diseke edin.
- Membranöz çadırın sırtında her iki tarafta son derece küçük bir parasagital kesim yapın ve ön hipofiz dokusunu bozmamaya özen göstererek hipofizin arka lobunu ultra ince forseps ile kaldırın (Şekil 2x).
- Hipofiz ön lobunun lateral kenarları ile en yakın trigeminal sinir arasında sagital bir kesim yapın ve bundan sonra hipofizin ön lobunu kaldırın (Şekil 2x).
3. Fare Beyin Diseksiyonu
NOT: Beyin ve hipofiz çıkarılmasından hemen sonra, önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerinde daha fazla diseksiyon yapılır (Şekil 3). Diseksiyon sonrası, beyin bölgelerini önceden etiketlenmiş şişelere aktarın ve şişeleri tercihen sıvı nitrojene aktarın, aksi takdirde -80 ° C. Yukarıdan aşağıya yöntemle (kronolojik sırayla) üretilen yapılar potansiyel olarak şunları içerir: beyincik (CB), beyin sapı / arka beyin (pons ve medulla oblongata) (HB), aksesuar koku alma ampulleri olarak koku alma ampulleri (OB), medial prefrontal korteks (MPFC), lateral prefrontal korteks (FCX), anterior ve posterior korpus triatum (ST), çekirdek akümülatörlerinden (NAC) ve koku tüberkülünden (OT) oluşan ventral striatum (VS), septum (SE), preoptik alan, piriform korteks (PFM), hipotalamus (HY), amigdala (AY), hipokampus (HC), posterior singulat korteks (CNG), entorinal korteks (ERC), talamuslu orta beyin (MB) ve serebral korteksin geri kalanı (ROC) (Tablo 1). Belirli bölgeler, tek bir yarımküre ile çalışan izolasyon sırasına göre tartışılacaktır.
- Beyni kalvaryumdan çıkarmaya büyük özen gösterin, çünkü herhangi bir yırtılma olması durumunda yer işaretleri tahrip olabilir. Bu adımda, yüz koruma, özellikle de 7x kuyumcu vizörü kullanarak tüm diseksiyonları gerçekleştirin ve aydınlatma, dissektörün omuzlarının her birinin üzerine yerleştirilmiş cerrahi lambalarla sağlanacaktır. Diseksiyonun çoğu künt modlu küçük kavisli forseps (yani Graefe forseps) kullanılarak gerçekleştirilecektir.
- Beyni paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin (Şekil 4i ve Şekil 4ii). Bloğu buz ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisi ile çevreleyerek soğuk tutun. Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
- Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, üst, orta ve alt serebellar pedinkülleri açığa çıkararak CB'yi nazikçe yansıtın ve CB'yi çıkarın (Şekil 4iii ve Şekil 4iv).
- Dorsumdan başlayarak ve OB ile serebral hemisferler arasında (Şekil 4v) orta sagital bir kesim yapın ve anterior komissürden daha uzağa uzanmadığınızdan emin olun. Bu noktada, vermis lateral kısımlardan kolayca ayrılabilir ve HB , ponsun ön kenarındaki koronal bir kesim ile elde edilir.
- Medullayı, ponsun arka kenarındaki koronal bir kesimle ayırın.
NOT: Bu noktada, epitalamus, talamus, hipotalamus ve ventral talamus ile üçüncü ventrikülü içeren ön beynin arka kısmı olan diensefalon, ventral tarafı yukarı doğru çevirecek ve optik kiazmdan rostral olarak orta sagital bir kesim yapılacaktır. Serebral hemisferlerin diseksiyonu ve ardından OB'nin yarımkürelerden birinden çıkarılması bu aşamada olacaktır (Şekil 4v ve Şekil 4vi). - Diensefalonu daha fazla diseke etmeden önce serebral hemisferleri ayırın (Şekil 4v). Dorsal yaklaşım, kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için dikkatli künt diseksiyon ile kullanılacaktır. Her hemisferik bağlantıyı kesmeden önce görselleştirin, çünkü bu orta hattan sapma olasılığını en aza indirecektir.
NOT: Bu adımda serebral yarımküreden biri (Hemibrain) korunabilir ve ikinci yarımküre daha ileri diseksiyon için kullanılabilir. - Korpus kallozumun altındaki küçük, kavisli forsepslerin kapalı bıçaklarını kaydırın ve neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Korpus kallozum, iki yarımküreyi birleştiren, forsepslerle kıstırılarak altta yatan orta hat yapılarını bozmadan açıkça diseke edilecek geniş bir sinir lifi bandıdır.
NOT: Yarımkürelerin mesial yüzleri, korpus kallozumun cinsi, fornices ve anterior komissür gibi miyelinli yapılar gibi görülebilen birden fazla işarete sahip olacaktır. Ayrıca, orta hatta birkaç milimetre yanal olmasına rağmen, mammillothalamik sistem ve fasciculus retroflexus da görülebilir. - Orta çizgiyi geçen çoklu yapıları ikiye bölün. Buna korpus kallozum, anterior komissür, ventral forniks komissure, posterior komissür, dorsal fornix komissure, supra mammillary decussation, superior colliculus commissure, ventral fornix komissure, ve periventriküler talamiks lifleri dahil olacaktır.
- Dorsal yaklaşım yöntemiyle kısmen tehlikeye girebilecek orta hattın içinde veya yakınında bu adımda özel dikkat gösterin. Tüm takip yapıları dikkatli yapılmadığı takdirde risk altındadır.
- OB (kama şeklinde ve daha açık renkte) ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından MPFC (singulat korteks alanı 1, prelimbik, infralimbik, medial orbital ve sekonder motor korteksler [M2]) ve FCX'in toplanması, korpus kallozumun cinsine 1 mm ön tarafta yapılan bir koronal kesimle (Şekil 4vii). Elde edilen bölümü, medialden lateral yüzeye olan mesafenin 1 / 3'ünü parasagital bir kesimle bölün, medial olarak MPFC ve yanal olarak FCX'in geri kalanını verin. Singulat korteks, MPFC'nin fare analoğudur.
NOT: Bu doku dilimi ayrıca az miktarda M2 (ikincil motor korteks) 17 içerecektir ve kaçınılmazdır. - Ortaya çıkan koronal bölümün rostral yüzündeki enine kesitte anterior komissürün pars anterior ekstremitesinin görünürlüğüne yol açan anterior komissür seviyesinde koronal bir kesim yapın, oysa enine kısım bölümün kaudal yüzünde ortaya çıkacaktır Bu NAC18 için doğrulayıcı bir dönüm noktasıdır. VS , NAC ve OT'den oluşur.
NOT: Anterior komissürde transvers segmente ek olarak bir anterior ekstremite vardır ve buna anterior komissür, pars anterior denir. - Septal çekirdeği dorsal ve VS ventralli serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay olarak kısmen kesin. Korteksin az miktarını , NAC ve OT'nin çıkarılacağı lateral yüzeyden çıkarın.
- ST'nin rostral kısmını, kortikal numuneye striatal doku dahil etmemeye dikkat ederek, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli neşter yoluyla üstteki korteksten ayırın. Bu noktada septal çekirdek/SE görünür olacak ve bu dilimden kolayca alınabilecektir (Şekil 4viii).
NOT: PFM'nin anterior ve posterior sınırları, sırasıyla anterior komissür ve mammillary cisimlerle uyumlu hayali koronal düzlemler ile tanımlanır. Medial sınır, eksternal kapsül18 tarafından tanımlanır. - Diensefalonun kalan hemi bölümünün lateral yüzeyinde, kaudal olarak uzanan rinal sulkus boyunca kısmi yatay bir kesim yapın, ancak sadece mammillary cisimlerle hayali koronal düzlem seviyesine kadar. HY'nin memeli cisimlerinin düzleminde lateral kortikal yüzeyden medial olarak 1 mm uzanan kısmi bir koronal kesim yapın. Burada, klostrum düzlemindeki para-sagital insizyon PFM'yi serbest bırakacaktır (Şekil 4ix ve Şekil 4x).
NOT: Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzeyinde, mammillary cisimler, fasciculus retroflexus ve stria medullaris dahil olmak üzere çok sayıda anatomik özellik görülecektir. Talamus ve HY arasındaki boşluğu gösteren yarım daire biçimli bir desen (dorsal içbükey taraf) görünecektir. HY, optik kiazm başına midsagital kesit görünümünde, anteroodoral olarak anteroodoral olarak ve anterikülus retrofleksusla birlikte mammillary cisimlerde posterioral olarak kolayca tanımlanacaktır. İkinci işaretler atlas17'de ve albino fare ön beyin bağlamı19'da iyi bir şekilde gösterilmiştir. - Memeli cisimlerin posteriorunda kısmi bir koronal kesim yapın, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanır. Bu noktada, hipotalamik sulkusun uzunluğu boyunca bir parasagital kesim şimdi HY'yi serbest bırakır.
- Ek limbik içi bağlantıları ve kalan limbik sistem bileşenlerini ortaya çıkarmak için lateral ventrikülün eversiyonunu gerektirir. Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzünü görüntüleyerek, kavisli forsepsler, teknisyenin forniksi kesmek için kullanılan çevredeki diğer hassas bölümlerin etrafında manipüle etmesine izin verdiği ve lateral ventriküle yerleştirildiği ve nazikçe genişlediği, ventrikülü açmak ve HC'yi döndürmek için künt diseksiyon kullanılarak en iyi seçenek olacaktır. Dikeyden yatay düzleme 90°. Koroidal arter / koroid pleksusunu kesmek için #11 bıçağının kullanılması gerekebilir, çünkü sivri uçlu uç hassas kesimlere yardımcı olabilir.
- CNG'yi yatay düzlemde olacak şekilde 90° döndürün (ancak HC'den ters yönde). Forseps kullanarak, HC'yi yavaşça 180 ° dışa ve yanal olarak döndürün, bu da ERC'nin iç yüzeyini görünür ve yukarı bakacak hale getirecektir.
- ERC'den kaynaklanan miyelinli liflerin fan benzeri bir radyasyonu , perforan yol ve HC'ye bağlanması da dahil olmak üzere açısal demetleri oluşturmak için yakınsama görecektir. Talamus ve MB 180°'yi dorsal olarak döndürerek AY'yi ventralal olarak ortaya çıkarın.
- Gerekirse, talamusun ventriküler yüzeyinin lateral kenarı boyunca AY'ye uzanan lif bantları içereceğinden stria terminalisin bağlantısını ortaya çıkarmak için optik yolu kaldırın ve AY'nin ana hatlarını netleştirecektir.
NOT: HC ve forniks, lateral ventriküle yuvalanmış ve kolayca kaldırılabilen, bütünüyle açıkça görülebilecektir. Lateral ventrikül pia mater ile kaplanacak ve ERC'nin çok şeffaf subpial yönü boyunca perforant yolun fan benzeri kökenleri görünür olacaktır20. - Medial ERC'nin dış yüzeyi , büyük piramidal hücrelerin görünür belirgin bir tabakasına sahip olacaktır. Ek olarak, Golgi boyama liflerinin yoğun bir yakınsaması, medial ERC'de göze çarpan bir özellik olacaktır. Bu diseksiyon prosedüründe, lateral ventrikül kesildikten sonra, bu lifler, ventriküllerin iç yüzeylerini kaplayan ve çok belirgin bir fan benzeri yapı oluşturan pia mater yoluyla medial yüzeyde kolayca görülebilecektir.
- Liflerin subpial olarak toplandığına, ventral ERC'ye inip ayrıldığına, posteriora uzandığına ve daha sonra HC'yi delmek için dikey olarak yükseldiğine dikkat edin. ERC'deki bu fan benzeri yapı , diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için kullanılacaktır. AY, ERC, CNG ve HC yapılarının sırasına göre tanımlayın ve kaldırın.
NOT: AY diseksiyonu için iyi bir dönüm noktası tanımlamak, bir sonraki adım için bir anahtar olacaktır ve stria terminalinin AY ile buluştuğu arka kenardaki kavşak iyi bir nokta olacaktır. - Bu noktada, kalan yapılar talamus ve MB'yi içerir. Orta hat rostrokaudal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden tamamen bir koronal kesim kaudal ile habenula'ya ve rostral'dan superior kolliküllere ayırın. ROC bu adımda kaydedilir.
- Bu noktada, tüm beyin bölgelerinin tam olarak toplanması ve derhal (her biri elde edildiğinden) numunelerin daha sonraki işlemlere kadar dondurulmuş olarak saklanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karmaşık beyin yapısı ve işlevi hakkındaki anlayışımız hızla gelişiyor ve gelişiyor. Beyin birden fazla farklı bölge içerir ve moleküler bir harita oluşturmak, beynin nasıl çalıştığını daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem yazısında, fare beyninin birden fazla farklı bölgeye diseksiyonunu tartıştık (Tablo 1). Bu protokolde, yapılar kritik noktalara göre tanımlanır ve derhal diseksiyon için sağlamlığını koruyarak dokunun tuzlu su çözeltisi ile nemli tutulmasıyla elde edilir. Yöntem, diğer raporlardan daha fazla bölgeyi kapsamaktadır21 ve donmuş beyinleri kullanan diseksiyon yöntemlerinin tamamlayıcısıdır22,23. Bu disseke dokular, çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak daha sonra korunabilir ve işlenebilir. Burada tartışılan yöntem, beynin kafatasından derhal çıkarılması ve ardından fare beyninin büyüklüğü göz önüne alındığında aşağı akış tahlilleri için hızlı bir şekilde yeterli doku sağlayan diseksiyondur. Ekibimiz RNA'yı çoklu disseke dokulardan çıkardı ve beyin dokuları için mikrodiziler kullanarak gen ekspresyon profillemesi için test yaptı; AY, HC, MPFC, septal bölge, korpus striatum ve VS ile sonuçları15 olarak yayınlanmıştır. Bu toplanan beyinler, RNA ekstraksiyonundan önce birkaç ay boyunca -80 ° C'de depolandı. Bu yöntem, beyin bölgelerinin aşağı akış faydasını çeşitlendirmek için diğer yöntemlerin kombinasyonunda benimsenebilir. Bu diseksiyon yöntemi, kesinlikle koronal veya sagital diseksiyonlar olmak yerine, anatomik olarak farklı bitişik bölgeler arasındaki yer işaretlerini takip etmeye odaklanmıştır. Çalışma kapsamında toplanan saldırgan TSSB16'nın sosyal stres modeli ve RNA konsantrasyonları ile spektrofotometrik okumalar Şekil 5 olarak gösterilmiştir.
Şekil 1: Toplanan Farklı Doku Tipleri ile Fare Beyninin Temsili. Bu şekil, yapıların kozmetik bir temsilidir ve herhangi bir eşlenmiş veritabanına ölçeklendirilmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kraniyal boşluktan beyin çıkarılması ve ardından hipofiz çıkarılması. Beynin çıkarılması için kademeli prosedür (i) epilasyondan sonra kelepçeleme ve tutma (ii) saçları dokudan uzak tutmak için kelepçenin bir Kimwipe ile sabitlenmesi (iii) kasların çıkarılmasından önce (iv) kasların çıkarılmasından sonra (v) méninges'in ayrılması (vi) küre / gözün çıkarılması (vii) orbital sırtta kesilen (viii) parietal ve frontal kemiklerin çıkarılması (ix) beyin gösterimi ve çıkarılması (x) beyin dekolmanı (xi) hipofiz görünümü (xii) hipofiz çıkarılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Diseksiyon Kurulum İstasyonu. Bu görüntü, beyin ve hipofiz dokularının çıkarılması sonrası beyin diseksiyonu için kurulumu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Beyin Diseksiyonu. Beyin çıkarılması için aşamalı prosedür (i) beynin üstten görünümü (ii) beynin dorsal görünümü (iii) beyincik çıkarılması (iv) serebral ayırma (v) yarımküreler diseksiyonu (vi) koku alma ampulünün çıkarılması (vii) MPFC, FCX ve aksesuar koku alma diseksiyonu (viii) SE, VS ve ST diseksiyonu (ix) PFM çıkarılması (x) Limbik sistem diseksiyonu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Örnek Toplandıktan Sonra Üretilen Veriler (A) Beyin dokusunun ağırlığı ve (B) RNA konsantrasyonu ve (C) Beyin dokusunun her birinden OD 260/280 gösterilmiştir. Burada veriler, daha önce15,16'da bildirildiği gibi bir çalışma grubundan kontrol gruplarından (n= 3-6) toplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| # | Kısaltma | Beyin bölgesinin tanımı |
| 1 | Cb | Beyincik |
| 2 | Hb | Beyin sapı/arka beyin (pons ve medulla oblongata) |
| İki yarımküreye ayırın | ||
| 3 | Ob | Koku alma ampulleri ve aksesuar koku alma ampulleri |
| 4 | cesaret | Medial prefrontal korteks |
| 5 | cesaret | Lateral prefrontal korteks |
| 6 | Se | Septum veya septal bölge |
| 7 | Vs | Ventral striatum, çekirdek akümülatörlerini (NAC) ve koku alma tüberkülünü (OT) içerir. |
| 8 | cesaret | Anterior ve posterior korpus striatum |
| 9 | Hy | Hipotalamus |
| 10 | cesaret | Piriform korteks |
| 11 | Hc | Hipokampus |
| 12 | cesaret | Entorinal korteks |
| 13 | cesaret | Posterior singulat korteks |
| 14 | AY | Amigdala |
| 15 | MB | Talamuslu orta beyin |
| 16 | Roc | Serebral korteksin geri kalanı |
Tablo 1: Fare Beyninden Farklı Bölgelerin Tanımı. Bu tablo, kısaltmasıyla toplanan tüm beyin bölgelerinin listesini içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memeli beyni, çeşitli moleküler imzalara ve uzmanlaşmış ve ayrık işlevleri yerine getiren çoklu bölgelere sahip bir dizi morfolojik olarak farklı ve işlevsel olarak benzersiz hücrelerden oluşan karmaşık bir organdır. Burada bildirilen diseksiyon prosedürü, laboratuvarın gereksinimlerine bağlı olarak birden fazla hedefe sahip olabilir. Laboratuvarımızda stres gibi TSSB'ye maruz kalan farelerden toplanan çoklu beyin bölgelerinde transkripsiyonu değerlendirdik16 . Suş genetik arka planı24'ün çoklu beyin bölgelerindeki ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisini daha fazla incelemek istiyoruz. Bu protokol, deneylerin başarılı bir şekilde yeniden üretilebilirliği için dikkate alınması gereken birden çok kritik adıma sahiptir. Beynin lokalize bölgelerinin her biri nöropatolojik durumda ayrı bir rol oynar ve incelenecek uygun beyin bölgesi hakkında ayrıntılı bilgi eksikliği vardır. Bu nedenle beyin bölgesine ait veri setinin oluşturulması önemlidir. Böylece, veriler sadece beyin bölgesi seçilerek değil, aynı zamanda daha kesin bilgiye yol açan veri kategorisi (örneğin, Transkriptom, protein, hücre (sitomimari) veya diğer) tarafından da sorgulanabilir. Daha önce, taze sıçan beyin dokularındaki koku alma ampulü, frontal korteks, striatum ve hipokampus gibi dokuların mikroskop25 kullanılarak diseke edildiği gösterilmiştir. Alternatif olarak bölümler, beyin dondurulmuşkendiseke edilebilir 14 , ardından RNA ve protein ekstraksiyonları ile takip edilir, ancak bu yöntem net yer işaretleri ile tanımlanabilen beyin bölgeleriyle sınırlıdır. Toplam RNA ekstraksiyonları, mikrodiseksiyonsonrası 25 ana beyin bölgelerinden ve gen ekspresyon çalışmaları için lazer olmayan yakalama mikroskopisi yaklaşımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir13. Burada, fizyolojik ve davranışsal işlevler üzerinde özel kontrole sahip belirli beyin yapılarını ayırmak için taze fare beyninin diseksiyonuna odaklanıyoruz. Yöntemimiz, daha önce yayınlanmış raporlardan daha fazla bölgenin diseksiyonunu açıklamaktadır, ancak mevcut diğer diseksiyon yöntemlerini tamamlayıcı niteliktedir. Bu yaklaşım, dokuların ve zayıflatıcı koşullarla ilişkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamaya yardımcı olabilir. Bu diseksiyon stratejisi, yeni keşifler için olasılıklar açan mevcut örnek toplama stratejilerine uygun bir seçenek sunar.
Burada açıklanan yöntemle, beyin dokuları uzun süreli depolama için -80 ° C'ye aktarılmadan önce sıvı azotta dondurularak dondurulur. Nükleik asitlerin veya proteinlerin korunması için tüm prosedür boyunca aletlerin ve dokuların soğuk tutulması önemlidir. Bu dondurulmuş dokular daha sonra laboratuvar standardı çalışma prosedürleri kullanılarak homojenize edilir. Bu beyin dokularının bazıları çok küçüktür ve homojenizasyon ve ekstraksiyon işlemi sırasında hedef molekülleri daha yüksek sıcaklıklarda bozulmaya karşı korumaya özen gösterilmelidir.
Bu süreçte, belirli doku bölgelerini belirlemek için net işaretler belirlemek önemlidir. Bu, dokunun hızlı bir şekilde yumuşamasını önlemek ve sağlamlığını bir süre korumak için tuzlu su çözeltisi ile nemli tutulmasıyla elde edilir. Önceki çalışmalarımız, kontrol ve saldırgan maruz kalan fare dokuları arasındaki gen ekspresyon değişikliklerini karşılaştırdı15 ve diseksiyon sırasında kullanılan salinden kaynaklanan herhangi bir değişikliği incelemedi. Deneyimlerimize göre, bu özellikle hipotalamustan başlayan kesi sırasında ve limbik bölgelerin (AY, HC, ERC) bölgesel ayrılık gölgelemesini ortaya çıkardığı ve daha net hale getirdiği için 180 ° çevirme sırasında önemlidir. Limbik sistem beynin derinliklerinde bulunur ve çeşitli uyaranlardan zarar görür ve bu nedenle tanısal ve terapötik olarak önemlidir. Limbik sistem beyin bölgelerinden oluşur, ancak bu liste26 üzerinde evrensel bir anlaşma yoktur. Çalışılmamış olsa da, salin kullanımının minimal veya hiç etkisi olmadığını düşünüyoruz. Bunun nedeni, tüm işlem boyunca soğuk koşulları takiben tüm prosedürün yaklaşık 20 dakika sürmesidir.
Beyin dokusu içindeki bölgeler, beyin atlaslarında belirtilen işaretler kullanılarak tanımlanır. Bu tekniği kullanarak, yer işaretlerinin açık olması ve bu prosedürün sırayla yapılması gerekir. Diseksiyon, beyin hala taze ve sağlamken yapılmalıdır; (ilk 15 ila 20 dakika ile yapılmalıdır) - aksi takdirde beyin daha uzun süre kalırsa ve daha yumuşak hale gelirse, yerler net olmayacak ve bölgeler farklı olmayacaktır.
Yukarıda açıklandığı gibi, beyin içinde, bağımsız olarak veya içsel bağ ağlarıyla koordineli olarak hareket eden birden fazla fonksiyonel alan içeren alt bölgeler vardır. Geniş boyutlarını incelemek için bu bölgeleri büyük bir hassasiyetle geri almak önemlidir. Bu, her birinin terapötik bir potansiyele sahip ayrı bir sürece hizmet ettiği uzmanlaşmış bölgeleri birleştirerek bu kavramların entegre edilmesine yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Deneysel yardımları için Bayan Seshmalini Srinivasan, Bay Stephen Butler ve Bayan Pamela Spellman'a ve el yazmasını düzenledikleri için Bayan Dana Youssef'e teşekkür ederiz. USAMRDC'nin finansman desteği minnetle kabul edilmektedir. Cenevre Vakfı bu çalışmaya katkıda bulundu ve ABD Ordusu Araştırma Ofisi aracılığıyla Askeri ve Operasyonel Tıp Araştırma Alanı Müdürlüğü III'ten gelen fonlarla desteklendi.
Feragatname:
Materyaller Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiştir. Sunumuna ve/veya yayınlanmasına itiraz yoktur. Burada yer alan görüşler veya iddialar yazarın özel görüşleridir ve resmi olarak veya Ordu Bakanlığı veya Savunma Bakanlığı'nın gerçek görüşlerini yansıttığı şeklinde yorumlanmamalıdır. Araştırma, Hayvan Refahı Yasası ve hayvanları içeren hayvanlar ve deneylerle ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü kapsamında yürütülmüştür ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, NRC Yayını, 2011 baskısında belirtilen ilkelere uygundur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
