Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Induktion og analyse af oxidativ stress i tornerose Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol for udvikling og brug afan oxidativ stress-model ved at behandle retinale pigment epitelceller med H2O2, analysere celle morfologi, levedygtighed, tæthed, glutathion, og UCP-2 niveau. Det er en nyttig model til at undersøge antioxidanteffekten af proteiner udskilt af transposon-transfected celler til behandling af neuroretinal degeneration.

Abstract

Oxidativ stress spiller en afgørende rolle i flere degenerative sygdomme, herunder aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en patologi, der påvirker ~ 30 millioner patienter på verdensplan. Det fører til et fald i retinal pigment epitel (RPE)-syntetiseret neuroprotektive faktorer, f.eks pigment epitel-afledt faktor (PEDF) og granulocyte-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), efterfulgt af tabet af RPE celler, og i sidste ende fotoreceptor og retinal ganglion celle (RGC) død. Vi hypotese, at rekonstitution af neuroprotektive og neurogene retinale miljø ved subretinal transplantation af transfected RPE celler overekspressere PEDF og GM-CSF har potentiale til at forhindre retinal degeneration ved at afbøde virkningerne af oxidativ stress, hæmme inflammation, og støtte celle overlevelse. Ved hjælp af Tornerose transposon system (SB100X)menneskelige RPE celler er blevet transfected med PEDF og GM-CSF gener og vist stabil genintegration, langsigtet genekspression, og protein sekretion ved hjælp af qPCR, vestlige blot, ELISA, og immunofluorescence. For at bekræfte funktionaliteten og styrken af PEDF og GM-CSF udskilles af de transfected RPE celler, har vi udviklet en in vitro assay til at kvantificere reduktionen af H2O2-induceretoxidativ stress på RPE celler i kultur. Cellebeskyttelse blev evalueret ved at analysere cellemorfologi, tæthed, intracellulært niveau af glutathion, UCP2 genekspression og celle levedygtighed. Begge transfected RPE-celler, der overekspresserer PEDF og/eller GM-CSF, og celler, der ikke er transfected, men forbehandlet med PEDF og/eller GM-CSF (kommercielt tilgængelige eller renset fra transficerede celler), viste signifikant antioxidantcellebeskyttelse sammenlignet med ikke-behandlede kontroller. Den nuværende H2O2-modeler en enkel og effektiv tilgang til at evaluere antioxidanteffekten af faktorer, der kan være effektive til behandling af AMD eller lignende neurodegenerative sygdomme.

Introduction

Modellen beskrevet her, tilbyder en nyttig tilgang til at evaluere effektiviteten afbiofarmaceutiske midler til at reducere oxidativ stress i celler. Vi har brugt modellen til at undersøge de beskyttende virkninger af PEDF og GM-CSF på H2O2-medieret oxidativ stress på retinale pigment epitelceller, som udsættes for høje niveauer af O2, og synligt lys, og fagocytose af fotoreceptor ydre segment membraner, genererer betydelige niveauer af reaktive iltarter (ROS)1, 2. De betragtes som en væsentlig bidragyder til patogenesen af avaskulær aldersrelateret makuladegeneration (aAMD)3,4,5,6,7,8. Desuden er der et fald i RPE-syntetiserede neuroprotektive faktorer, specielt pigment epitel-afledt faktor (PEDF), insulin-lignende vækstfaktorer (IGFs), og granulocyte makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), der fører til dysfunktion og tab af RPE celler, efterfulgt af fotoreceptor og retinal ganglion celle (RGC) død3,4,5 . AMD er en kompleks sygdom, der skyldes samspillet mellem metaboliske, funktionelle, genetiske og miljømæssige faktorer4. Manglen på behandlinger for aAMD er den vigtigste årsag til blindhed hos patienter over 60 år i de industrialiserede lande9,10. Rekonstitutionen af det neuroprotektive og neurogene retinale miljø ved subretinal transplantation af genetisk modificerede RPE-celler, der overekspresserer PEDF og GM-CSF, har potentiale til at forhindre retinal degeneration ved at afbøde virkningerne af oxidativ stress, hæmme inflammation og understøtte celleoverlevelse11,12,13,14,15,16 . Selvom der er flere metoder til at levere gener til celler, har vi valgt det ikke-virale hyperaktive Tornerose transposon-system til at levere PEDF- og GM-CSF-generne til RPE-celler på grund af dets sikkerhedsprofil, integrationen af generne i værtscellernes genom og dets tilbøjelighed til at integrere de leverede gener i ikke-transskriptionsaktive steder, som vi tidligere har vist17, 18,19.

Cellulær oxidativ stress kan induceres i celler, der dyrkes in vitro af flere oxidative agenser, herunder hydrogenperoxid (H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxid (tBH), høje iltspændinger og synligt lys (fuldspektret eller UV-bestråling)20,21. Høje iltspændinger og lys kræver særligt udstyr og forhold, hvilket begrænser overførselsevnen til andre systemer. Stoffer som H2O2,HNE og tBH fremkalder overlappende oxidative stress molekylære og cellulære ændringer. Vi valgte H2O2 til at teste antioxidant aktivitet PEDF og GM-CSF, fordi det er praktisk og biologisk relevant, da det er produceret af RPE celler som en reaktiv ilt mellemliggende under fotoreceptor ydre segment fagocytose22 og det findes i okulære væv in vivo23. Da oxidation af glutathion kan være delvist ansvarlig for produktionen af H2O2 i øjet, har vi analyseret niveauet af GSH / glutathion i vores undersøgelser, som er knyttet til H2O2-induceret oxidativ stress og den regenerative kapacitet af cellerne21,22. Analysen af glutathion niveauer er særligt relevant, da det deltager i de anti-oxidative beskyttelsesmekanismer i øjet24. Eksponering for H2O2 bruges ofte som model til at undersøge RPE-cellernes oxidative stressmodalitet og antioxidantaktivitet1,25,26,27,28,29,30, og derudover viser den ligheder med lysinduceret oxidativ stressskade, en "fysiologisk" kilde til oxidativ stress21.

For at evaluere funktionaliteten og effektiviteten af neuroprotektive faktorer har vi udviklet en in vitro-model, der gør det muligt for analysen at kvantificere den antioxidative effekt af vækstfaktorer udtrykt af celler, der er genetisk modificeret til at overekspressere PEDF og GM-CSF. Her viser vi, at RPE-celler transfected med generne for PEDF og GM-CSF er mere resistente over for de skadelige virkninger af H2O2 end ikke-transfected kontrolceller, som det fremgår af cellemorfologi, tæthed, levedygtighed, intracellulær niveau af glutathion og ekspression af UCP2-genet, som koder for mitokondrie upcouplingprotein 2, der har vist sig at reducere reaktive iltarter (ROS)31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne for indsamling og brug af menneskelige øjne blev godkendt af Den Kantonale Etiske Forskningskommission (nr. 2016-01726).

1. Celleisolation og kulturforhold

  1. Human ARPE-19 cellelinje
    1. Kultur 5 x 105 ARPE-19 celler, en menneskelig RPE-cellelinje i Dulbeccos Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12) suppleret med 10% fosterkvægserum (FBS), 80 U/mL penicillin, 80 μg/mL streptomycin og 2,5 μg/mL amphotericin B (komplet medium) ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 og 95% luft i en T75-kolbe (for andre celletætheder se tabel 1).
    2. Skift medium tre gange om ugen.
    3. Når cellerne er vokset til ca. 90% sammenløb (evalueret kvalitativt), aspirere mediet og vask cellerne med steril 1x PBS.
    4. Inkuber cellerne med en 5 % Trypsin-2 % EDTA-opløsning i 7-10 min ved 37 °C (for bind se tabel 1). Monitor løsrivelse visuelt.
    5. Stop trypsinisering ved at tilføje hele medium, der indeholder 10% FBS (for mængder se tabel 1).
    6. Transfekt cellerne (se protokollens trin 2. ), deldyr cellerne i et forhold på 1:10 (en gang om ugen) eller frø i en 96-brønds plade som beskrevet nedenfor (se trin 3.3 og 3.4 i protokollen).
Mellem (mL)
Areal (cm²) Seeding tæthed for ARPE-19 celler (celler / brønd) Ansøgning Til cellekultur Sådan stoppes trypsin Volumen af trypsin (mL)
Kolbe T75 75 5,00,000 ARPE-19 cellevækst 10 7 3
6 Godt plade 9.6 1,00,000 Såning af transfected ARPE-19 celler 3 1 0.5
24 Godt plade 2 50,000 Såning af transfected hRPE-celler 1 0.8 0.2
96 Brønd plade 0.32 5.000 til oxidative stressforsøg med transfected celler (fig. 1) Oxidative stresseksperimenter 0.2
3.000 til oxidative stressforsøg med ikke-transfected celler plus proteiner (fig. 1)

Tabel 1: Cellekulturmængder. Anbefalede medievolumener til cellekulturplader og kolber til kulturen af ARPE-19 og primære menneskelige RPE-celler.

  1. Primære menneskelige RPE-celler
    1. Isoler primære menneskelige RPE-celler som beskrevet af Thumann et al.17, og kulturceller i komplet medium suppleret med 20% FBS.
    2. Skift medium to gange om ugen. Når cellerne når sammenløb (overvåges visuelt), reducere FBS til 1% for at undgå overvækst.
    3. Transfekt cellerne (se trin 2 i protokollen) eller frø i en 96-brønds plade som beskrevet nedenfor (se trin 3.3 og 3.4 i protokollen).
      BEMÆRK: Data præsenteret her blev indsamlet fra kulturen af RPE-celler opnået fra øjnene af fire menneskelige donorer. Tabel 2 beskriver demografien hos donorerne fra Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Øjnene blev indledt 12,7 ± 5,7 timer (gennemsnit ± SD) efter informeret samtykke blev opnået i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.
Nej alder køn død til bevarelse (timer) død af isolation dyrkning dyrkning Symbol i graf
(dage) før transfection (dage) efter transfection (dage)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
betyde 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabel 2: Demografi af menneskelige donorer for retinale pigment epitelceller.

2. Elektroporering af ARPE-19 og primære humane RPE-celler

  1. Trypsinize ARPE-19-celler eller primære humane RPE-celler som beskrevet i trin 1.1.3-1.1.5 i protokollen.
  2. Udfør elektroporering med det kommercielt tilgængelige transfection kit (se Materialetabel).
    1. For transfection af ARPE-19 celler henvises til Johnen et al.32 og for primær hRPE til Thumann et al.17. Kort sagt genbruge 1 x 105 ARPE-19 celler eller 5 x 104 primære hRPE celler i 11 μL R buffer og tilsæt 2 μL plasmid blanding indeholdende 0,03 μg pSB100X transposase33 og 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-Hans eller pT2-CMV-GMCSF-Hans transposon (ratio transposase:transposon 1:16). For pedf og GM-CSF dobbelttransmiterede celler skal du bruge et forhold på 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His og 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Brug følgende elektroporeringsparametre: to impulser på 1.350 V for 20 ms (pulsbredde) for ARPE-19-celler; to impulser på 1.100 V for 20 ms for primære celler.
  3. Frø 1 x 105 transfected ARPE-19 eller 5 x 104 transfected primære hRPE celler i henholdsvis 6-brønd og 24-brønd plader, i medium suppleret med 10% FBS uden antibiotika eller antimykotika. Penicillin (80 U/mL), streptomycin (80 μg/mL) og amphotericin B (2,5 μg/mL) med den første mellembytte 3 dage efter transfektion.
  4. Bestem cellevækst ved ugentlig mikroskopisk overvågning af cellerne. Transfection effektivitet overvåges af analyse af genekspression af RT-PCR, og protein sekretion af ELISA og WB (metoder forklaret i supplerende materiale).
    BEMÆRK: Transfection effektivitet kan evalueres for første gang, når cellerne når sammenløb, dvs. på ~ 7 dage og 4 uger efter transfection for ARPE-19 celler og primære hRPE celler, henholdsvis.
  5. Frøceller i en 96-brønds plade som beskrevet nedenfor (se trin 3.5 i protokollen).

3. Oxidativ stressinduktion (H2O2-behandling) og neuroprotektion (PEDF- og/eller GM-CSF-behandling)

  1. Fremstilling af konditioneret medium af transfected ARPE-19 celler
    1. Brug ARPE-19-celler, der er transfected med generne PEDF, GM-CSF eller begge dele (se protokollens trin 2); kulturceller i 28 dage som beskrevet i trin 1.1 i protokollen.
    2. Efter 28 dage efter transfektionen trypsiniserer celler (se trin 1.1.3-1.1.5 i protokollen), tælle celler ved hjælp af et Neubauer-kammer34,35og frø 5 x 105 celler i T75 kolber i komplet medium som beskrevet i trin 1.1.1 i protokollen. Byt mediet, når cellekulturen er ca. 80% sammenflyttet (ca. efter 1 uge; verificeret kvalitativt). Saml mediet efter 24 timer.
    3. Opbevar mediet ved -20 °C, indtil det er brugt.
      BEMÆRK: Wb verificerede en tilstrækkelig koncentration af den rekombinante PEDF og GM-CSF i det konditionerede medium og kvantificeret af ELISA som beskrevet i supplerende materiale.
  2. Rensning af PEDF og GM-CSF fra konditioneret medium af transfected ARPE-19 celler
    1. Centrifugere det opsamlede medium fra trin 3.1.2 ved 10.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    2. Brug Ni-NTA superflow (se Tabel over materialer) i henhold til producentens protokoller til at rense Hans-taggede proteiner som beskrevet nedenfor.
      1. Pipette 30 μL Ni-NTA blanding i en 1,5 mL rør og centrifuge ved 2.600 x g for 30 s og kassere flow-through. Pellet vaskes to gange med 200 μL 1x inkubationsbuffer.
      2. Centrifuge ved 2.600 x g i 30 s og kassér gennemstrømningen. Der tilsættes 40 μL 4x inkubationsbuffer og genanvendes.
      3. Tilsæt 900 μL centrifugeret konditioneret medium og inkuberes ved 70 omdr./min. (orbital shaker) i 1 time ved RT. Centrifuge ved 2.600 x g i 1 min og kassationsstrømmen.
      4. Pellet vaskes to gange med 175 μL 1x inkubationsbuffer. Centrifuge ved 2.600 x g i 30 s og kassér gennemstrømningen.
      5. For at elute His-tagged PEDF og GM-CSF proteiner, tilføje 20 μL af Elution buffer og inkubere ved 70 rpm (orbital shaker) i 20 min på RT. Centrifuge ved 2.600 x g for 30 s. Hold supernatanten, der indeholder rekombinant PEDF eller GM-CSF.
    3. Kvantificer det samlede protein ved hjælp af det kommercielt tilgængelige BCA-proteinanalysesæt (se Materialetabel)i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
    4. Proteinopløsningen opbevares ved -20 °C, indtil den anvendes.
      BEMÆRK: Inkubationsbuffer (4x) indeholder 200 mM NaH2PO4,1,2 M NaCl og 40 mM Imidazol; Elution buffer indeholder 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl og 250 mM Imidazol.
  3. Behandling af ikke-transfected ARPE-19/primær hRPE celler med konditioneret medium plus H2O2 (Figur 1A)
    1. Frø 3.000 ikke-transfected ARPE-19 (fra trin 1.1.6 i protokollen) eller primære hRPE (fra trin 1.2.3 i protokollen) celler pr. brønd i 96-brøndsplade og kultur i 200 μL af konditioneret medium fra transfected ARPE-19 celler.
    2. Kultur cellerne i 10 dage ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 og 95% luft. Skift det konditionerede medium hver dag. Cellerne udsættes for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    3. Vurder oxidativ stressskade, og der fastlægges antioxidanteffekten af PEDF og GM-CSF ved kvantificering af glutathionniveauer (se protokollens trin 4.1), mikroskopi (se protokollens trin 4.2) og cytotoksicitetsanalyse (se protokollens trin 4.2).
      BEMÆRK: Varigheden af eksperimentet er 12 dage. Klare flade bund mikrowell plader bruges til at evaluere luminescens samt celle morfologi. For samtidig at udføre cytotoksicitet og glutathion assay, to plader skal sås med celler på samme dag.
  4. Behandling af ikke-transfected ARPE-19/primær hRPE celler med PEDF og GM-CSF vækstfaktorer plus H2O2 (Figur 1B)
    1. Frø 3.000 ikke-transfected ARPE-19 (fra trin 1.1.6 i protokollen) eller primær hRPE (fra trin 1.2.3 i protokollen) celler pr. brønd (96-brøndplader med en klar flad bund) i 200 μL af komplet kulturmedium indeholdende 500 ng/mL rekombinant PEDF og/eller 50 ng/mL rekombinant GM-CSF, renset fra det transfected af transfected ARPE-19 celler eller kommercielt tilgængelige. Kulturceller i 48 timer ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 og 95% luft. Forny mediet, herunder PEDF og GM-CSF vækstfaktorer dagligt.
      BEMÆRK: Tilføj vækstfaktorerne friske til mediet.
    2. Efter 48 timer for at behandle cellerne med vækstfaktorerne skal mediet fjernes og tilsættes komplet medium, der indeholder 350 μM H2O2 plus 500 ng/mL PEDF og/eller 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Vurder oxidativ stressskade, og der fastlægges antioxidanteffekten af PEDF og GM-CSF ved kvantificering af glutathionniveauer (se protokollens trin 4.1), mikroskopi (se protokollens trin 4.2) og cytotoksicitetsanalyse (se protokollens trin 4.2).
      BEMÆRK: Varigheden af eksperimentet er 3 dage.
  5. Behandling af transfected ARPE-19/primær hRPE celler med H2O2 (Figur 1C)
    1. Kontroller tilstrækkelig genekspression og proteinsekretion af transfected celler af WB og ELISA som beskrevet i det supplerende materiale.
    2. Fjern mediet fra de brønde, der indeholder de transfected celler (se trin 2 i protokollen).
    3. Trypsinisere celler som beskrevet i trin 1.1.3-1.1.5 i protokollen. Tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer kammer34,35.
    4. Frø 5.000 transfected celler / godt i 96-brønd plade i 200 μL af komplet medium. Kulturceller i 24 timer ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 og 95% luft. Efter 24 timer udsættes cellerne for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    5. Vurder oxidativ stressskade, og fastlæg antioxidanteffekten af PEDF og GM-CSF ved kvantificering af glutathionniveauer (se protokollens trin 4.1), mikroskopi (se protokollens trin 4.2), cytotoksicitetsanalyse (se trin 4.2 i protokollen) og bestemmelse af UCP2-genekspression (se protokollens trin 4.3).
      BEMÆRK: Eksperimentets varighed er 2 dage.

Figure 1
Figur 1: Tidslinjer for H2O2-analysen i de tre forskellige eksperimentelle tilgange. 3.000 ikke-transfected celler behandlet med de betingede medium /rekombinante proteiner eller 5.000 transfected celler blev seedet i 96-brønd plader til behandling med H2O2. For at bestemme effekten af konditioneret medium blev celler kultiveret i 100% kultiveret medium i 10 på hinanden følgende dage og skiftede medium hver dag. For at bestemme effekten af rekombinante vækstfaktorer blev cellerne kultiveret ved at tilføje den passende mængde vækstfaktorer hver dag i 3 på hinanden følgende dage. Bemærk, at ikke-transfected celler blev sået på 3.000 celler pr brønd for at undgå overvækst i løbet af den længere kultur varighed i forhold til transfected celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

4. Analyse af oxidativt stressniveau og antioxidantkapacitet

  1. Glutathion assay
    1. Mål glutathione-niveauerne (GSH) ved hjælp af det kommercielt tilgængelige sæt (se Materialetabel)i kølvandet på producentens anvisninger. Kort, forberede og passende volumen af 1x Reagens mix (100 μL reagens / brønd): Luciferin-NT substrat og Glutathion S-Transferase fortyndet 1:100 i Reaktion Buffer.
      BEMÆRK: En 96-brønds plade kræver 10 mL 1x Reagensblanding, som fremstilles ved at tilsætte 100 μL Luciferin-NT substrat og 100 μL glutathion S-Transferase til 10 mL reaktionsbuffer. Tilbered 1x Reagensblandingen umiddelbart før brug. Opbevar ikke forberedt reagensblanding til fremtidig brug.
    2. Forbered Luciferin Detection Reagent ved at overføre en flaske Rekonstitution buffer til den lyophilized Luciferin Detection Reagent.
    3. Forbered en standardkurve ved hjælp af en Frådser (GSH) standardopløsning (5 mM). Fortynd 5 mM GSH-opløsning 1:100 med dH2O (tilsættes 10 μL på 5 mM GSH-opløsning til 990 μL dH2O). Udfør 7 seriel 1:1 fortynding i 500 μL dH2O. Overfør 10 μL af hver fortyndet standard til en passende brønd i dupliker.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af glutathion vil variere fra 0,039 μM til 5 μM.
    4. Den tomme (1x Reagensblanding) forberedes, og der overføres 10 μL (dubletter) til de relevante brønde.
    5. Fjern de H2O2-behandledeceller fra inkubatoren.
      BEMÆRK: Dokumentér morfologien af H2O2-behandledeceller ved lysfeltmikroskopi (40x).
      Når cellerne oxideres, ser de mere afrundede og mindre spredte ud.
    6. Sug forsigtigt kulturmediet. Tilsæt 100 μL af forberedt 1x Reagens mix til hver brønd. Bland cellerne med reagenset i 15 s ved 500 rpm på en orbital shaker.
    7. Inkuber pladen på RT i 30 min. Tilsæt 100 μL rekonstitueret Luciferin Detection Reagens til hver brønd.
    8. Bland opløsningen til 15 s ved 500 rpm på en orbital shaker. Inkuber pladen i 15 minutter på RT.
    9. Bestem luminescens ved hjælp af en pladelæser ved hjælp af et forudinstalleret program ADP-Glo.
      BEMÆRK: Sæt pladen inde i pladelæseren uden låget.
      1. Klik på Skift layout, og vælg følgende indstillinger i Grundlæggende parametre: Costar 96-well plade; topoptik; positioneringsforsinkelse: 0.1; målingsstarttidspunkt: 0.0; måleintervaltid: 1.0; tid til at normalisere resultaterne: 0.0; forstærkningen justeres automatisk af enheden. Definer emner, standarder og eksempler. Klik på Start måling.
      2. Eksporter dataene som en Excel-fil. Koncentrationen af GSH beregnes i hver prøve ved interpolation af standardkurven.
  2. Cytotoksicitetsanalyse og mikroskopisk analyse
    1. Aspirere mediet fra cellerne og tilsæt 100 μL komplet medium, der indeholder 1% FBS til hver brønd. Returner cellerne til inkubatoren.
      BEMÆRK: 1% FBS anvendes, fordi højere procentdele af FBS kan forstyrre målingen af luminescensen, derfor anvendes 1% FBS i dette tilfælde.
    2. Mål celle levedygtighed ved hjælp af kommercielt tilgængelige cytotoksicitet assay kit (se Tabel over materialer)efter fabrikantens anvisninger. Forbered kort reagensblandingen, der tilføjer assaybufferen til det lyophiliserede substrat. Klargør Lysis Reagens ved at tilsætte 33 μL Digitonin til 5 mL Assay buffer (for en 96-brønd plade). Bland godt ved pipetter op og ned for at sikre homogenitet.
      BEMÆRK: For at opnå optimale resultater skal du bruge frisklavet reagensblanding. Anvendes inden for 12 timer, hvis det opbevares på RT. Reagensblandingen kan opbevares ved 4 °C i op til 7 dage og kan opbevares i engangs aliquots i op til 4 måneder ved -70 °C. Frysning og optøning skal undgås. Lysis reagenset kan opbevares ved 4 °C i op til 7 dage.
    3. Forbered en standardkurve med ubehandlede ARPE-19-celler.
      1. Trypsinize cellerne som beskrevet i trin 1.1.3-1.1.5 i protokollen og tælle cellerne ved hjælp af en Neubauer kammer34,35. Centrifuge cellerne ved 120 g i 10 min ved RT. Aspirer supernatanten og genbrug cellepillen i DMEM/Hams F12-medium, der indeholder 1% FBS til en endelig koncentration på 1 x 105 celler/mL.
      2. 7 seriel 1:1 fortyndinger i 200 μL medium indeholdende 1% FBS. Overfør 100 μL af hver standard til de relevante brønde (dubletter). Tilsæt 50 μL reagensblanding til alle brøndene.
    4. Bland cellerne med reagenset i 15 s ved 500 rpm på en orbital shaker. Pladen inkuberes i 15 min ved RT. Mål luminescensen ved hjælp af pladelæseren som beskrevet i protokollens trin 4.1.9. Der tilsættes 50 μL af lysis reagenset og inkuberes i 15 min. Mål luminescens ved hjælp af pladelæseren som beskrevet i trin 4.1.9 i protokollen.
    5. Procentdelen af levedygtige celler: (100 - % døde celler) og procentdelen af døde celler = [1. luminescensmåling ((døde celler i prøven))/ 2. luminescensmåling (alle celler døde efter digitoninbehandling)] x 100.
  3. UCP2-udtryksanalyse af RT-qPCR
    1. Trypsinize transfected celler som beskrevet ovenfor (trin 1.1.3-1.1.5 i protokollen).
    2. Tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer kammer34,35.
    3. Frø 5.000 transfected ARPE-19 celler / brønd i 96-brønd plader.
    4. Efter 24 timers kultur behandles cellerne med 350 μM H2O2 i 24 timer.
    5. Isoler det samlede RNA ved hjælp af et kommercielt sæt til isolering af RNA fra lavt antal celler (se Materialetabel) efter producentens instruktion.
    6. Udfør kvantitativ PCR (REAL-Time Quantitative PCR) som beskrevet i supplerende materiale. Kort, generere cDNA ved retrotranscription ved hjælp af en kommercielt tilgængelig blanding, der indeholder en optimeret M-MLV Reverse Transcriptase (se Tabel over materialer).
    7. For qPCR anvende en klar til brug reaktion cocktail, der indeholder alle komponenter (herunder SYBR Green) undtagen primere (se tabel S1 af supplerende materiale) og DNA skabelon. Anvendelse af følgende termocyklingsforhold: indledende denaturering ved 95 °C i 10 min, 40 cyklusser med denaturering ved 95 °C i 15 s, udglødning ved 60 °C i 30 s og forlængelse ved 72 °C i 32 s.
    8. Brug 2^(-ΔΔCT)-metoden til analyse36.
  4. Forberedelse af cellelyt til SDS-PAGE og WB analyse af pAkt (Ser473)
    1. Frø 3 x 105 GM-CSF-transfected ARPE-19 celler / brønd i 6-brønd plader (≥21 dage efter transfection) for at afgøre, om GM-CSF beskytter RPE celler mod skader ved H2O2 gennem aktivering af Akt overlevelse vej15.
    2. Efter 24 timers kulturceller udsættes for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    3. Bland 1 mL RIPA-buffer med 10 μL proteasephosphatase-hæmmercocktail, 10 μL på 0,5 M EDTA og 25 μL 8 M urinstof (mængder, der anvendes til en brønd).
    4. Opsyve forsigtigt medium og vask cellerne med 1x PBS.
    5. Føj hele volumenet af RIPA-bufferblandingen til cellerne.
    6. Pipette op og ned.
    7. Lysatet opsamles i 1,5 ML rør.
    8. Centrifuge ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    9. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 mL rør.
    10. Bestemme niveauet af pAkt i 15 μL af ufortyndet celle lysat af WB som beskrevet i supplerende materiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion af oxidativ stress i human Retinal Pigment Epitelceller
ARPE-19 og primære hRPE-celler blev behandlet med varierende koncentrationer på H2O2 i 24 timer, og antioxidantglutalsens intracellulære niveau blev kvantificeret (figur 2A,B). H2O2 ved 50 μM og 100 μM påvirkede ikke produktionen af glutathion, mens der ved 350 μM var et betydeligt fald i glutathion i ARPE-19- og primære hRPE-celler. Analyse af cytotoksicitet viste, at 350 μM er den laveste koncentration af H2O2, der forårsager et betydeligt fald i celle levedygtigheden (Figur 2C). Morfologisk synes ARPE-19-celler behandlet med H2O2 mindre spredte og mere afrundede egenskaber, der bliver mere tydelige med stigende H2O2 koncentration (Figur 3). Virkningen var mindre fremtrædende for PEDF- og GM-CSF-transfected celler behandlet med H2O2 (figur 3). For at påvise virkningen af cellenummer på H2O2-medieret oxidativ stress blev 5.000 og 10.000 ARPE-19 celler pr. brønd sået i en hvid 96-brøndsplade; dagen efter blev cellerne behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer, og glutathionniveauet blev bestemt. Figur 4 viser, at glutathionniveauet kun blev reduceret i brøndene (n = 3) seedet med 5.000 celler. For forsøg til bestemmelse af effekten af antioxidanter af H2O2-genereretROS, er det vigtigt at overveje antallet af celler; for den specifikke protokol, der præsenteres i denne rapport, er 3.000-5.000 celler/brønd (96 brøndplader), der behandles i 24 timer med 350 μM H2O2, egnede til at påvise betydelige celleskader, samtidig med at evnen til at komme sig, der efterligner en sub-akut reaktion på oxidativ stress-induceret skade.

Figure 2
Figur 2: Oxidativt stressniveau, der fremgår som glutathionniveau og celleafskalitet, i humane RPE-celler behandlet med H2O2. (A) ARPE-19-celler eksponeret for flere koncentrationer af H2O2 viste signifikant nedsat glutathionniveauer (i parentes) ved 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) og 700 μM (0,002 μM) sammenlignet med H2O2-ikke-behandlede celler (2,9 μM) (p < 0,0001 for 350 500 og 700 μM H2O2). (B) Primære RPE-celler fra primære humane stoffer viste et nedsat niveau af glutathion; virkningen var dog mindre fremtrædende end for ARPE-19, men stadig statistisk signifikant sammenlignet med kontrollerne ved 350, 500 og 700 μM H2O2. 350 μM var den laveste H2O2-koncentration, der medførte betydelig oxidativ skade som påvist ved nedsat glutathionniveauer sammenlignet med ikke-behandlede kontrolceller (p = 0,0022). Glutathionniveauet faldt med stigende H2O2-koncentrationer (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) Cytotoksicitetsanalyse viste, at 350 μM H2O2 var den laveste koncentration, der medførte et betydeligt fald i procentdelen af levedygtige celler (p < 0,0001 for 350, 500 og 700 μM). Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD (n = 3 replikerer), og signifikante forskelle er angivet med (*); post hoc-beregninger af ANOVA blev udført ved hjælp af Tukeys multisammenligningstest, der sammenlignede C- med H2O 2-behandlingsgrupperne. C-: H2O2 ikke-behandlede celler. Dette tal er blevet ændret fra Bascuas et al.37. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Morfologi af ikke-transfected og PEDF- eller GM-CSF-transfected ARPE-19 celler behandlet med H2O2. Celler behandlet med stigende koncentrationer af H2O2 viser færre celler i kulturtønderne og viser en mere afrundet, mindre spredt morfologi, et kendt tegn på cellulær stress. Bemærk, at for PEDF- eller GM-CSF-transfected celler, cellulære stress er mindre fremtrædende og vokse ligner ikke-behandlede kontrolceller. C-: ikke-behandlede kontrolceller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Celletallets indflydelse på virkningen af H2O2-induceret oxidativ stress. 5.000 og 10.000 ARPE-19 celler / brønd blev sået i 96-brønd plader. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer. Signifikante forskelle i glutathion niveauer blev observeret i brønde sået med 5.000 celler (p = 0,031, t-test), men ikke i brønde sået med 10.000 celler. C-: ikke-behandlede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Analyse af antioxidanteffekten af PEDF og GM-CSF leveret af SB100X-transfected humane RPE-celler i oxidative stressforhold
Som positiv kontrol blev ARPE-19 og primære humane RPE-celler behandlet med 5, 50 eller 500 ng/mL kommercielt tilgængelige PEDF- eller GM-CSF i 2 dage før og under behandlingen på 24 h H2O2. ARPE-19-celler behandlet med 500 ng/mL PEDF eller 50 ng/mL GM-CSF producerede betydeligt mere glutathion sammenlignet med ubehandlet kontrol under oxidative forhold (H2O2-behandlet) (Figur 5A); sammenlignelige PEDF- og GM-CSF renset fra kulturmedier af transfected ARPE-19-celler viste en lignende effekt (figur 5B). I primære hRPE-celler reducerede tilsætning af 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF eller 500 ng/mL PEDF plus 50 ng/mL GM-CSF, uanset om de var kommercielle eller renses fra medier, der var konditioneret af TRANSF- eller GM-CSF-celler, celleskader som afspejlet af en betydelig stigning i glutathionniveauer (figur 5C). Primære hRPE-celler behandlet i 10 dage med konditioneret medium fra transfected ARPE-19 celler viste også højere glutathion niveauer sammenlignet med kontrolceller (Figur 5D). På grundlag af disse resultater er der udført yderligere forsøg med 500 ng/mL for PEDF og 50 ng/mL for GM-CSF.

ARPE-19 og primære hRPE-celler blev transfected med generne, der koder for PEDF og/eller GM-CSF ved hjælp af Tornerosetransposonsystemet kombineret med elektroporation. Efter transfektion og analyse af genekspression af RT-qPCR, WB, ELISA og immunohistochemistry (se Supplerende materiale, Figur S1og figur S2) viste transfected ARPE-19 celler eksponeret for 350 μM H2O2 i 24 timer signifikant højere glutathionniveauer end ikke-transfected H2O2-behandlede celler (Figur 6A ). For primære hRPE-celler er der en signifikant stigning i glutathionniveauer i PEDF-transfected celler sammenlignet med ikke-transfected celler behandlet med H2O2, da alle donorer blev inkluderet i analysen. Desuden viser donor 2 og 3 en betydelig stigning i glutathionniveauer for alle transfectedgrupper (PEDF, GM-CSF, PEDF og GM-CSF) (data, der ikke er vist).

Undersøgelsen af UCP2-genekspressionen afsluttede analysen ved undersøgelse af mitokondrieoxidativ stress. Der blev udført en proof-of-concept-serie i transfected ARPE-19-celler behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer. Som vist i figur 7øges niveauet af UCP2-genekspression efter H 2 O2-behandlingi transfected ARPE-19-celler, men stigningen er ikke statistisk signifikant. Figur 8 viser en WB af fosforyleret Akt (pAkt) fra et lysat af GM-CSF-transfected celler eksponeret for H2O2; de normaliserede data viser kun et lille fald i forhold til den ubehandlede kontrol, hvilket indikerer, at GM-CSF kan beskytte cellerne mod oxidativ stressskade.

Figure 5
Figur 5: Glutathion niveau som en markør for antioxidantkapaciteten i PEDF og GM-CSF. (A) Behandling af ARPE-19-celler med 500 ng/mL PEDF eller 50 ng/mL GM-CSF i 3 dage før og i løbet af 24 h H2O2 eksponering steg glutathionniveauet fra 0,83 μM (C) til 1,83 μM (PEDF) og 1,3 μM (GM-CSF) p = henholdsvis 0,026 og p = 0,031. Ved en koncentration på 5 ng/mL blev der ikke observeret nogen stigning i glutathion; forskellen i glutathion-niveauet mellem 50 og 500 ng/mL var ikke signifikant for hverken PEDF eller GM-CSF. (B) PEDF (500 ng/mL) og GM-CSF (50 ng/mL), der er renset fra betingede medier af transfected ARPE-19-celler, viste en effekt svarende til kommercielt tilgængelige PEDF- eller GM-CSF (p = 0,018, ANOVA). (C) Tilsætning af 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF eller 500 ng/mL PEDF plus 50 ng/mL GM-CSF i 3 dage før og under 24 h H2O2 behandling til kulturmediet primære hRPE-celler øgede glutathionniveauet i celler behandlet med PEDF betydeligt (2,6 μM [kommerciel], 2,5 μM [renset]), GM-CSF (2,9 μM [kommerciel], 3,3 μM [renset]) og PEDF plus GM-CSF (3,0 μM [kommerciel], 2,9 μM [renset]) sammenlignet med ikke-behandlede celler (1,9 μM) (p = 0,006, Kruskal-Wallis test). (D) Der blev observeret en signifikant stigning i glutathionniveauer for hRPE-celler, der dyrkes i 10 dage i konditioneret medium fra PEDF-, GM-CSF-, eller PEDF-GM-CSF-transfected ARPE-19 celler, før cellerne blev behandlet med H2O2 (p = 0,003, Kruskal-Wallis-test) (data viste for en donor). Data udtrykkes som gennemsnitlige ± SD (n = 3 replikerer). Der er angivet betydelige forskelle med (*); post hoc-beregninger af variansanalyserne blev udført ved at beregne Tukeys eller Dunnetts multisammenligningstest, der sammenlignede "C" med de PEDF-/GM-CSF-behandlede grupper. C: celler, der kun behandles med H2O2, P: celler behandlet med PEDF, G: celler behandlet med GM-CSF, P+G: celler behandlet med PEDF plus GM-CSF. Dette tal er blevet ændret fra Bascuas et al.37. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Glutathion som en markør for antioxidantkapaciteten hos PEDF- og GM-CSF-transfected humane RPE-celler. (A) Glutathionen af transfected ARPE-19-celler udsat for 350 μM H2O2 i 24 timer (56 dage efter transfektion) var betydeligt højere sammenlignet med ikke-transfected celler (1,9 μM), dvs. 3,0 μM for PEDF- og GM-CSF-transfected celler og 3,4 μM for dobbelttransfected celler (p = 0,0001, ANOVA). Data udtrykkes som gennemsnitlige ± SD (n = 3 replikerer). (B) Prikplottet viser de gennemsnitlige glutathionværdier for fire forskellige donorer (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), som adskiller sig væsentligt mellem ikke-transfected og PEDF-transfected celler (p = 0,028, post-hoc beregninger af ANOVA blev udført ved hjælp af Tukey's multi-sammenligning tests sammenligne "C" med PEDF-/GM-CSF-behandlede grupper). Når donorerne analyseres separat, viser donor N°2 og N°3 (se tabel 2 for symbol i grafen) betydelige forskelle for alle transfected grupper sammenlignet med den ikke-transfected kontrol (betydninger er ikke vist) behandlet med H2O2. C: ikke-overførte celler, P: TRANSF-transfectedceller, G: GM-CSF-transfected celler, P+G: PEDF- og GM-CSF-transfected celler. Dette tal er blevet ændret fra Bascuas et al.37. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: UCP2-genekspression i transfected ARPE-19-celler behandlet med H2O2. Da UCP2 genekspression kan bruges til at undersøge mitokondrie oxidative skader, undersøgte vi effekten af overekspression af PEDF og GM-CSF af transfected ARPE-19 celler. Transfected ARPE-19 celler behandlet med H2O2, selv om det ikke er statistisk signifikant, viser øget UCP2 genekspression sammenlignet med den ikke-transfected kontrol, der indikerer oxidativ stressreduktion, var foldstigningen 1,57 for PEDF-, 1,51 for GM-CSF-og 2,36 for PEDF- plus GM-CSF-transfected celler sammenlignet med den ikke-transfected kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Western Blot af fosforyleret Akt (Ser473) fra et cellelysat af GM-CSF-transfected ARPE-19 celler. WB påviste, at GM-CSF øger fosforyleringen af Akt i både ubehandlede og H2O2-behandledekulturer (UT: 3.32; H2O2: 2.69). Værdierne normaliseres til ikke-transfected ikke-H2O2-behandlede celler (C/UT). C: ikke-transfected, G: GM-CSF-transfected celler, UT: celler, der ikke er behandlet med H2O2, H2O2: celler behandlet med H2O2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel S1: Primer par sekvenser og udglødning tid / temperatur, der anvendes til RT-qPCR. Klik her for at downloade denne tabel. 

Figur S1: PEDF og GM-CSF genekspression analyse i transfected hRPE celler. RT-qPCR verificerede, at transfected primære hRPE-celler viste en signifikant stigning i PEDF (p = 0,003, Kruskal-Wallis-testen) og GM-CSF (p = 0,013, Kruskal-Wallis-test) genekspression sammenlignet med ikke-transfected celler. 2^(-ΔΔCT)-metoden blev brugt i dette tilfælde36. Data udtrykkes som gennemsnitlige ± SD (n = 4 donorer). Hver prik repræsenterer gennemsnittet af tre replikater. Dette tal er blevet ændret fra Bascuas et al.37. Klik her for at downloade denne fil.

Figur S2: Proteinsekretion i transfected primære hRPE- og ARPE-19-celler. (A) Elisas kvantificering af udskillede proteiner viste, at transfected hRPE-celler udskilles betydeligt mere PEDF og GM-CSF end ikke-transfected celler (p = 0,014 for PEDF og p = 0,006 for GM-CSF, Kruskal-Wallis-testen). Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD (n = 4 donorer). Hver prik repræsenterer gennemsnittet af tre replikater. (B) PeDF-GM-CSF dobbelt farvning bekræftede co-sekretion af PEDF og GM-CSF i dobbelt-transfected ARPE-19 celler (fusioneret tal). Dette tal er blevet ændret fra Bascuas et al.37. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende materiale. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her tilbyder en tilgang til at analysere anti-oxidative og beskyttende funktion af PEDF og GM-CSF produceret af transfected celler, som kan anvendes til celler transfected med enhver putative gavnlige gen. I genterapistrategier, der har til formål at levere proteiner til væv ved at transplantere genetisk modificerede celler, er det afgørende at indhente oplysninger om niveauet af proteinudtryk, udtryks levetiden og effektiviteten af det udtrykte protein i en model af sygdommen. I vores laboratorium har den protokol, der præsenteres her, været nyttig til at definere effektiviteten af PEDF og GM-CSF på oxidativ stress, som er blevet antaget som et vigtigt element i patogenesen af aAMD6,7. Specifikt har vi brugt protokollen til at definere den anti-oxidative effekt af SB100X-medieret PEDF / GM-CSF-transfected primære hRPE celler. Flere efterforskere har vist, at H2O2 fremkalder signifikante symptomer på oxidativstress,men stadig tillader celle regenerering28,29,38, svarende til resultaterne af vores eksperimenter, der har vist, at 350 μM for 24 timer fremkalder effektiv oxidativ stress i humanE ARPE-19 og primære RPE-celler, der kan bruges til at analysere den beskyttende virkning af PEDF og GM-CSF. H2O2 som oxidativt middel er blevet valgt til undersøgelsen på grund af dets fysiologiske tilstedeværelse i øjet og tilsvarende forsvarsmekanismer, f.eks. glutathion metabolisme20,21. Vores laboratorium har undersøgt andre modeller af oxidativ stress såsom behandling af celler med tBH, som indleder lipidperoxidation i nærværelse af rødox-aktive metalioner1; oxidativ stress var imidlertid ubetydelig. I de eksperimenter, der præsenteres her, blev cellerne behandlet med H2O2 i 24 timer, fordi vi fandt ud af, at kortere behandlingstider på 2-6 timer er tilstrækkelige til at fremkalde ændringer i genekspression20, men efterfølgende konsekvenser, f.eks. cellespredning, cellelevedygtighed og glutathionniveauer, er måske ikke synlige endnu. Ellers fører brøndenes lille størrelse, der er nødvendig for cytoksicitet og glutathion assays, hurtigt til en sammenløbskultur godt; dette kan føre til kontakthæmning og en maskering af virkningen af det oxidative middel. Derfor synes en lang inkubation med H2O2 ikke nyttig, selvom degenerationen, der ses i aAMD, er forårsaget af kronisk oxidativ stress6,7.

En begrænsning af de eksperimenter, der præsenteres her, er, at antallet af seedede celler påvirker den oxidative virkning af H2O2, dvs. for samme H2O2-behandling blev signifikante forskelle i glutathionniveauet mellem H2O2-behandledeog ikke-behandlede celler observeret, når 5.000 celler, men ikke når 10.000 celler blev sået (Figur 4 ). Den protokol, vi præsenterer, kræver såning af et lavt antal celler, dvs. 3.000, når celler dyrkes i 3 dage og 5.000, når celler dyrkes i 2 dage (Figur 1). En anden begrænsning er, at koncentrationen af H2O2 er udtømt med tiden; Kaczara et al.39 har vist udtømning af H2O2 over et par timer i ARPE-19 cellekulturer, som påvirker udviklingen af kroniske oxidative stressmodeller. Disse investigatorer har foreslået en alternativ metode til vedvarende H2O2-behandling, der specifikt kontinuerligt genererer H2O2 fra glukose i mediet ved hjælp af glukoseoxidase, men en standardiseret koncentration af H2O2 kan ikke garanteres. På den anden side har den protokol, vi etablerede med levering af oxidantmidlet i en enkelt puls, den fordel at være hurtigere og enklere at udføre sammenlignet med kroniske modeller, hvor H2O2-behandlingen skal gentages i flere dage38.

Cellernes evne til at modvirke den oxidative skade bestemmes af balancen mellem ROS-produktion og evnen til at generere antioxidanter. I cellen er tripeptid glutathion (GSH) det fremherskende reducerende middel, som kan oxideres til glutathion disulfid (GSSG) og regenereres ved glutathion reductase ved hjælp af NADPH40. I raske celler er mere end 90% af den samlede glutathion pool til stede i den reducerede form. Når celler udsættes for et øget niveau af oxidativ stress, akkumuleres GSSG, og forholdet mellem GSSG og GSH øges. Derfor er overvågning af glutathion redox-tilstanden i biologiske prøver afgørende for vurderingen af afgiftningsstatus for celler og væv fra frie radikaler genereret under oxidativ stress og celleskade. Protokollen, der er beskrevet her for kvantificering af glutathion, er følsom nok til at påvise antioxidanteffekten af PEDF og GM-CSF udtrykt af RPE-celler, der er genetisk modificerede.

Da oxidativ stress påvirker mitokondrieaktiviteter40, er det særlig interessant , at PEDF's kontrol med ROS-niveauer er relateret til reguleringen af mitokondrieudkoblingsprotein 2 (UCP2), og PEDF dæmper virkningerne af oxidativ stress ved at øge UCP2-ekspressionen11,41. UCP2's hovedfunktion er at kontrollere mitokondrier-afledt ROS og fungere som sensor af mitokondrieoxidativ stress41,42. Her har vi ud over at undersøge virkningen af PEDF og GM-CSF på glutathionniveauer, at genekspressionen af UCP2 har tendens til at stige (figur 7); yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå PEDF's og GM-CSF's rolle på UCP2-genekspression.

Samlet set tilbyder den nuværende H2O2-modelen omfattende tilgang til at undersøge den gavnlige effekt af transposon-baserede genterapier, der har til formål at levere antioxidant terapeutiske gener til patientens celler til behandling af neurodegenerativ sygdom som AMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Gregg Sealy og Alain Conti for fremragende teknisk bistand og Prof. Zsuzsanna Izsvák fra Max-Delbrück Center i Berlin for venligt at give pSB100X og pT2-CAGGS-Venus plasmid. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Sciences Foundation og Europa-Kommissionen inden for rammerne af det syvende rammeprogram. Z.I blev finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Medicin Udgave 166 okulær genterapi aldersrelateret makuladegeneration oxidativ stressskade Tornerose transposon ikke-viral genlevering RPE-celler PEDF GM-CSF
Induktion og analyse af oxidativ stress i <em>tornerose</em> Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter