Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Abstract

Oxidatieve stress speelt een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een pathologie die wereldwijd ~ 30 miljoen patiënten treft. Het leidt tot een afname van retinale pigmentepitheel (RPE) - gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, bijvoorbeeld pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), gevolgd door het verlies van RPE-cellen, en uiteindelijk fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood. We veronderstellen dat de reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpresseren, het potentieel heeft om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontsteking te remmen en celoverleving te ondersteunen. Met behulp van het Doornroosje transposonsysteem(SB100X)zijn menselijke RPE-cellen getransfecteerd met de PEDF- en GM-CSF-genen en hebben ze stabiele genintegratie, genexpressie op lange termijn en eiwitsecretie aangetoond met behulp van qPCR, western blot, ELISA en immunofluorescentie. Om de functionaliteit en de potentie van de PEDF en GM-CSF uitgescheiden door de getransfecteerde RPE-cellen te bevestigen, hebben we een in vitro assay ontwikkeld om de reductie van H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress op RPE-cellen in cultuur te kwantificeren. Celbescherming werd geëvalueerd door celmorfologie, dichtheid, intracellulair niveau van glutathion, UCP2-genexpressie en levensvatbaarheid van cellen te analyseren. Zowel getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en/of GM-CSF overexpressie geven als cellen die niet-getransfecteerd zijn maar voorbehandeld met PEDF en/of GM-CSF (in de handel verkrijgbaar of gezuiverd uit getransfecteerde cellen) vertoonden een significante antioxidant celbescherming in vergelijking met niet-behandelde controles. Het huidige H2O2-model is een eenvoudige en effectieve benadering om het antioxiderende effect te evalueren van factoren die effectief kunnen zijn om AMD of vergelijkbare neurodegeneratieve ziekten te behandelen.

Introduction

Het hier beschreven model biedt een nuttige benadering om de efficiëntie van biofarmaceutische middelen te evalueren voor het verminderen van oxidatieve stress in cellen. We hebben het model gebruikt om de beschermende effecten van PEDF en GM-CSF op de H2O2-gemedieerde oxidatieve stress op retinale pigmentepitheelcellen te onderzoeken, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van O2en zichtbaar licht, en de fagocytose van fotoreceptor buitenste segmentmembranen, die aanzienlijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren1, 2. Ze worden beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van avasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (aAMD)3,4,5,6,7,8. Bovendien is er een afname van RPE-gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, met name de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), insuline-achtige groeifactoren (IGF's) en granulocyt macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) die leidt tot de disfunctie en het verlies van RPE-cellen, gevolgd door fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood3,4,5 . AMD is een complexe ziekte die het gevolg is van de interactie tussen metabole, functionele, genetische en omgevingsfactoren4. Het gebrek aan behandelingen voor aAMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij patiënten ouder dan 60 jaar in geïndustrialiseerde landen9,10. De reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van genetisch gemodificeerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpressie geven, heeft het potentieel om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontstekingen te remmen en celoverleving te ondersteunen11,12,13,14,15,16 . Hoewel er verschillende methodologieën zijn om genen aan cellen te leveren, hebben we gekozen voor het niet-virale hyperactieve Doornroosje transposonsysteem om de PEDF- en GM-CSF-genen aan RPE-cellen te leveren vanwege het veiligheidsprofiel, de integratie van de genen in het genoom van de gastheercellen en de neiging om de afgeleverde genen te integreren in niet-transcriptioneel actieve sites zoals we eerder hebben aangetoond17, 18,19.

Cellulaire oxidatieve stress kan worden geïnduceerd in cellen die in vitro zijn gekweekt door verschillende oxidatieve middelen, waaronder waterstofperoxide (H2O2),4-hydroynonenaal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), hoge zuurstofspanningen en zichtbaar licht (volledig spectrum of UV-straling)20,21. Hoge zuurstofspanningen en licht vereisen speciale apparatuur en omstandigheden, die de overdraagbaarheid naar andere systemen beperken. Middelen zoals H 2 O2,HNE en tBH induceren overlappende oxidatieve stress moleculaire en cellulaire veranderingen. We kozen H2O2 om de antioxiderende activiteit van PEDF en GM-CSF te testen omdat het handig en biologisch relevant is omdat het wordt geproduceerd door RPE-cellen als een reactief zuurstoftussenproduct tijdens fotoreceptor buitenste segment fagocytose22 en het wordt gevonden in oculaire weefsels in vivo23. Aangezien de oxidatie van glutathion gedeeltelijk verantwoordelijk kan zijn voor de productie van H2O2 in het oog, hebben we de niveaus van GSH / glutathion in onze studies geanalyseerd, die verband houden met H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress en het regeneratieve vermogen van cellen21,22. De analyse van glutathionspiegels is vooral relevant omdat het deelneemt aan de anti-oxidatieve beschermingsmechanismen in het oog24. Blootstelling aan H2O2 wordt vaak gebruikt als een model om de oxidatieve stressgevoeligheid en antioxiderende activiteit van RPE-cellen1,25,26,27,28,29,30te onderzoeken en bovendien vertoont het overeenkomsten met door licht geïnduceerde oxidatieve stressschade, een "fysiologische" bron van oxidatieve stress21.

Om de functionaliteit en de effectiviteit van neuroprotectieve factoren te evalueren, hebben we een in vitro model ontwikkeld dat de analyse mogelijk maakt om het anti-oxidatieve effect van groeifactoren uitgedrukt door cellen die genetisch gemodificeerd zijn om PEDF en GM-CSF te overexpressie te kwantificeren. Hier laten we zien dat RPE-cellen getransfecteerd met de genen voor PEDF en GM-CSF beter bestand zijn tegen de schadelijke effecten van H2O2 dan niet-getransfecteerde controlecellen, zoals blijkt uit celmorfologie, dichtheid, levensvatbaarheid, intracellulair niveau van glutathion en expressie van het UCP2-gen, dat codeert voor het mitochondriale ontkoppelingseiwit 2 waarvan is aangetoond dat het reactieve zuurstofsoorten (ROS) vermindert31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke ogen werden goedgekeurd door de Kantonnale Ethische Commissie voor Onderzoek (nr. 2016-01726).

1. Celisolatie en kweekomstandigheden

  1. Menselijke ARPE-19 cellijn
    1. Kweek 5 x 105 ARPE-19 cellen, een menselijke RPE-cellijn, in Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 U/ml penicilline, 80 μg/ml streptomycine en 2,5 μg/ml amfotericine B (volledig medium) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht in een T75-kolf (voor andere celdichtheden zie tabel 1).
    2. Verander het medium drie keer per week.
    3. Zodra de cellen zijn gegroeid tot ongeveer 90% confluentie (kwalitatief geëvalueerd), zuigt u het medium op en wast u de cellen met steriele 1x PBS.
    4. Incubeer de cellen met een 5% Trypsine-2% EDTA-oplossing gedurende 7-10 min bij 37 °C (voor volumes zie tabel 1). Monitor onthechting visueel.
    5. Stop de trypsinisatie door toevoeging van een volledig medium met 10% FBS (voor volumes zie tabel 1).
    6. Transfecteer de cellen (zie stap 2. van het protocol), subkweek de cellen in een verhouding van 1:10 (eenmaal per week), of zaad in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stappen 3.3 en 3.4 van het protocol).
Medium (ml)
Oppervlakte (cm²) Zaaidichtheid voor ARPE-19 cellen (cellen/put) Toepassing Voor celkweek Om trypsine te stoppen Volume trypsine (ml)
Kolf T75 75 5,00,000 ARPE-19 celgroei 10 7 3
6 Put plaat 9.6 1,00,000 Zaaien van getransfecteerde ARPE-19 cellen 3 1 0.5
24 Put plaat 2 50,000 Zaaien van getransfecteerde hRPE-cellen 1 0.8 0.2
96 Put plaat 0.32 5.000 voor oxidatieve stressexperimenten met getransfecteerde cellen (fig. 1) Oxidatieve stress experimenten 0.2
3.000 voor oxidatieve stressexperimenten met niet-getransfecteerde cellen plus eiwitten (fig. 1)

Tabel 1: Celkweekvolumes. Aanbevolen mediavolumes voor celkweekplaten en -kolven voor de kweek van ARPE-19 en primaire menselijke RPE-cellen.

  1. Primaire menselijke RPE-cellen
    1. Isoleer primaire menselijke RPE-cellen zoals beschreven door Thumann et al.17, en kweekcellen in volledig medium aangevuld met 20% FBS.
    2. Verander het medium twee keer per week. Zodra de cellen confluentie bereiken (visueel gecontroleerd), verlaagt u FBS tot 1% om overgroei te voorkomen.
    3. Transfecteer de cellen (zie stap 2 van het protocol) of zaad in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stappen 3.3 en 3.4 van het protocol).
      OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens werden verzameld uit de kweek van RPE-cellen verkregen uit de ogen van vier menselijke donoren. Tabel 2 geeft de demografie weer van de donoren van de Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). De ogen werden 12,7 ± 5,7 uur (gemiddelde ± SD) post-mortem gegraveerd nadat geïnformeerde toestemming was verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
Nee leeftijd geslacht dood tot behoud (uren) dood door isolement teelt teelt Symbool in grafiek
(dagen) vóór transfectie (dagen) na transfectie (dagen)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
bedoelen 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabel 2: Demografie van menselijke donoren voor retinale pigmentepitheelcellen.

2. Elektroporatie van ARPE-19 en primaire menselijke RPE-cellen

  1. Trypsinize ARPE-19 cellen of primaire menselijke RPE cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol.
  2. Voer elektroporatie uit met de in de handel verkrijgbare transfectiekit (zie Tabel met materialen).
    1. Voor transfectie van ARPE-19 cellen verwijzen naar Johnen et al.32 en voor primaire hRPE naar Thumann et al.17. Resuspend 1 x 105 ARPE-19 cellen of 5 x 104 primaire hRPE-cellen in 11 μL R-buffer en voeg 2 μL plasmidemengsel toe met 0,03 μg pSB100X transposase33 en 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His of pT2-CMV-GMCSF-His transposon (verhouding transposase:transposon 1:16). Gebruik voor PEDF en GM-CSF dubbel getransfecteerde cellen een verhouding van 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His, en 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Gebruik de volgende elektroporatieparameters: twee pulsen van 1.350 V voor 20 ms (pulsbreedte) voor ARPE-19-cellen; twee pulsen van 1.100 V voor 20 ms voor primaire cellen.
  3. Zaad 1 x 105 getransfecteerde ARPE-19 of 5 x 104 getransfecteerde primaire hRPE-cellen in respectievelijk 6-well en 24-well platen, in medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica of antimycotica. Voeg penicilline (80 E / ml), streptomycine (80 μg / ml) en amfotericine B (2,5 μg / ml) toe met de eerste mediumuitwisseling 3 dagen na transfectie.
  4. Bepaal de celgroei door wekelijkse microscopische monitoring van de cellen. Transfectie-efficiëntie wordt bewaakt door de analyse van genexpressie door RT-PCR en eiwitsecretie door ELISA en WB (methoden uitgelegd in aanvullend materiaal).
    OPMERKING: Transfectie-efficiëntie kan voor de eerste keer worden geëvalueerd zodra de cellen confluentie bereiken, d.w.z. op ~ 7 dagen en 4 weken na transfectie voor respectievelijk ARPE-19-cellen en primaire hRPE-cellen.
  5. Zaadcellen in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stap 3.5 van het protocol).

3. Oxidatieve stress inductie (H2O2 behandeling) en neuroprotectie (PEDF en/of GM-CSF behandeling)

  1. Bereiding van geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19-cellen
    1. Gebruik ARPE-19-cellen getransfecteerd met de genen PEDF, GM-CSF of beide (zie stap 2 van het protocol); kweekcellen gedurende 28 dagen zoals beschreven in stap 1.1 van het protocol.
    2. 28 dagen na de transfectie trypsiniseren cellen (zie stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol), cellen tellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35en zaaien 5 x 105 cellen in T75-kolven in volledig medium zoals beschreven in stap 1.1.1 van het protocol. Wissel het medium uit wanneer de celcultuur ongeveer 80% confluent is (ongeveer na 1 week; kwalitatief geverifieerd). Verzamel het medium na 24 uur.
    3. Bewaar het medium bij -20 °C tot gebruik.
      OPMERKING: De voldoende concentratie van de recombinante PEDF en GM-CSF in het geconditioneerde medium werd geverifieerd door WB en gekwantificeerd door ELISA zoals beschreven in Aanvullend materiaal.
  2. Zuivering van PEDF en GM-CSF uit geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19 cellen
    1. Centrifugeer het verzamelde medium uit stap 3.1.2 bij 10.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    2. Gebruik de Ni-NTA superflow (zie Tabel met materialen) volgens de protocollen van de fabrikant om His-tagged eiwitten te zuiveren zoals hieronder beschreven.
      1. Pipetteer 30 μL Ni-NTA-mengsel in een buis van 1,5 ml en centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg. Was de pellet tweemaal met 200 μL 1x incubatiebuffer.
      2. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg. Voeg 40 μL 4x incubatiebuffer toe en resuspend.
      3. Voeg 900 μL gecentrifugeerd geconditioneerd medium toe en incubeer bij 70 rpm (orbitale shaker) gedurende 1 uur bij RT. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 1 min en de weggooidoorstroom.
      4. Was de pellet tweemaal met 175 μL 1x incubatiebuffer. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg.
      5. Om His-tagged PEDF- en GM-CSF-eiwitten te elueren, voegt u 20 μL elutiebuffer toe en incubeert u gedurende 20 tpm (orbitale shaker) gedurende 20 minuten bij RT. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s. Bewaar het supernatant dat recombinant PEDF of GM-CSF bevat.
    3. Kwantificeer het totale eiwit met behulp van de in de handel verkrijgbare BCA-eiwittestkit (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Bewaar de eiwitoplossing bij -20 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Incubatiebuffer (4x) bevat 200 mM NaH2PO4,1,2 M NaCl en 40 mM imidazool; Elutiebuffer bevat 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl en 250 mM Imidazol.
  3. Behandeling van niet-getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met geconditioneerd medium plus H2O2 (Figuur 1A)
    1. Zaad 3.000 niet-getransfecteerde ARPE-19 (vanaf stap 1.1.6 van het protocol) of primaire hRPE (vanaf stap 1.2.3 van het protocol) cellen per put in 96-well plaat en cultuur in 200 μL geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19 cellen.
    2. Kweek de cellen gedurende 10 dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Verander het geconditioneerde medium elke dag. Stel de cellen gedurende 24 uur bloot aan 350μMH2 O 2.
    3. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol) en cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 12 dagen. Heldere microwellplaten met platte bodem worden gebruikt om luminescentie en celmorfologie te evalueren. Om tegelijkertijd de cytotoxiciteits- en glutathiontest uit te voeren, moeten twee platen op dezelfde dag met cellen worden gezaaid.
  4. Behandeling van niet-getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met PEDF- en GM-CSF-groeifactoren plus H2O2 (Figuur 1B)
    1. Zaad 3.000 niet-getransfecteerde ARPE-19 (vanaf stap 1.1.6 van het protocol) of primaire hRPE (vanaf stap 1.2.3 van het protocol) cellen per put (96-putplaten met een heldere vlakke bodem) in 200 μL volledig kweekmedium met 500 ng/ml recombinant PEDF en/of 50 ng/ml recombinant GM-CSF, gezuiverd uit het medium van getransfecteerde ARPE-19-cellen of in de handel verkrijgbaar. Kweekcellen gedurende 48 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Vernieuw het medium inclusief PEDF en GM-CSF groeifactoren dagelijks.
      OPMERKING: Voeg de groeifactoren vers toe aan het medium.
    2. Na 48 uur behandeling van de cellen met de groeifactoren, verwijdert u het medium en voegt u het volledige medium toe dat 350 μM H2O2 plus 500 ng / ml PEDF en / of 50 ng / ml GM-CSF bevat.
    3. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol) en cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 3 dagen.
  5. Behandeling van getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met H2O2 (Figuur 1C)
    1. Controleer voldoende genexpressie en eiwitsecretie van getransfecteerde cellen door WB en ELISA zoals beschreven in het aanvullend materiaal.
    2. Verwijder het medium uit de putjes met de getransfecteerde cellen (zie stap 2 van het protocol).
    3. Trypsinize cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35.
    4. Zaad 5.000 getransfecteerde cellen/put in 96-well plaat in 200 μL volledig medium. Kweekcellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Stel de cellen na 24 uur gedurende 24 uur bloot aan 350μMH2 O 2.
    5. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol), cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol) en bepaling van UCP2-genexpressie (zie stap 4.3 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 2 dagen.

Figure 1
Figuur 1: Tijdlijnen van de H2O2-test in de drie verschillende experimentele benaderingen. 3.000 niet-getransfecteerde cellen behandeld met het geconditioneerde medium / recombinante eiwitten of 5.000 getransfecteerde cellen werden gezaaid in 96-well platen voor behandeling met H2O2. Om het effect van geconditioneerd medium te bepalen, werden cellen gedurende 10 opeenvolgende dagen in 100% gekweekt medium gekweekt, waarbij het medium elke dag werd vervangen. Om het effect van recombinante groeifactoren te bepalen, werden cellen gekweekt door elke dag gedurende 3 opeenvolgende dagen de juiste hoeveelheid groeifactoren toe te voegen. Merk op dat niet-getransfecteerde cellen werden gezaaid met 3.000 cellen per put om overgroei te voorkomen tijdens de langere kweekduur in vergelijking met getransfecteerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Analyse van oxidatieve stressniveaus en antioxidantcapaciteit

  1. Glutathion assay
    1. Meet de glutathion (GSH) niveaus met behulp van de in de handel verkrijgbare kit (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, bereid en geschikt volume van 1x Reagensmengsel (100 μL reagens / put): Luciferin-NT substraat en Glutathion S-Transferase verdund 1:100 in reactiebuffer.
      OPMERKING: Een 96-well plaat vereist 10 ml 1x reagensmengsel, dat wordt bereid door 100 μL Luciferine-NT-substraat en 100 μL glutathion S-Transferase toe te voegen aan 10 ml reactiebuffer. Bereid de 1x Reagensmix direct voor gebruik. Bewaar geen bereide reagensmix voor toekomstig gebruik.
    2. Bereid het Luciferin Detection Reagens voor door één fles Reconstitution buffer over te brengen naar het gelyofiliseerde Luciferin Detection Reagens.
    3. Bereid een standaardcurve voor met een glutathion (GSH) standaardoplossing (5 mM). Verdun 5 mM GSH-oplossing 1:100 met dH2O (voeg 10 μL 5 mM GSH-oplossing toe aan 990 μL dH2O). Voer 7 seriële 1:1 verdunning uit in 500 μL dH2O. Breng 10 μL van elke verdunde standaard over naar een geschikte put in tweevoud.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie glutathion zal variëren van 0,039 μM tot 5 μM.
    4. Bereid de blanco (1x reagensmengsel) en breng 10 μL (duplicaten) over in de juiste putjes.
    5. Verwijder de met H2O2behandelde cellen uit de couveuse.
      OPMERKING: Documenteer de morfologie van de met H2O2behandelde cellen door middel van brightfield-microscopie (40x).
      Wanneer de cellen geoxideerd zijn, zien ze er meer afgerond en minder verspreid uit.
    6. Aspirateer het cultuurmedium zorgvuldig. Voeg 100 μL bereid 1x reagensmengsel toe aan elk putje. Meng de cellen met het reagens gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker.
    7. Incubeer de plaat bij RT gedurende 30 minuten. Voeg 100 μL gereconstitueerd Luciferin Detection Reagens toe aan elke put.
    8. Meng de oplossing gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT.
    9. Bepaal luminescentie met behulp van een plaatlezer met behulp van een vooraf geïnstalleerd programma ADP-Glo.
      OPMERKING: Plaats de plaat in de plaatlezer zonder deksel.
      1. Klik op Lay-out wijzigen en kies de volgende instellingen in Basisparameters:Costar 96-well plaat; top optiek; positioneringsvertraging: 0,1; meetstarttijd: 0,0; meetinterval tijd: 1.0; tijd om de resultaten te normaliseren: 0,0; de versterking wordt automatisch aangepast door het apparaat. Definieer spaties, standaarden en monsters. Klik op Meting starten.
      2. Exporteer de gegevens als een Excel-bestand. Bereken de concentratie van GSH in elk monster door interpolatie van de standaardcurve.
  2. Cytotoxiciteitstest en microscopische analyse
    1. Zuig het medium uit de cellen en voeg 100 μL volledig medium met 1% FBS toe aan elke put. Breng de cellen terug naar de couveuse.
      OPMERKING: 1% FBS wordt gebruikt omdat hogere percentages FBS de meting van de luminescentie kunnen verstoren, daarom wordt in dit geval 1% FBS gebruikt.
    2. Meet de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitstestkit (zie Tabel met materialen)volgens de instructies van de fabrikant. Bereid kort het reagensmengsel voor en voeg de assaybuffer toe aan het gelyofiliseerde substraat. Bereid het Lysis-reagens door 33 μL Digitonin toe te voegen aan 5 ml assaybuffer (voor één 96-well plaat). Meng goed door op en neer te pipetteren om homogeniteit te garanderen.
      OPMERKING: Gebruik voor een optimaal resultaat een vers bereid reagensmengsel. Gebruik binnen 12 uur indien bewaard bij RT. Reagensmengsel kan maximaal 7 dagen bij 4 °C worden bewaard en kan tot 4 maanden bij -70 °C in aliquots voor eenmalig gebruik worden bewaard. Bevriezing en ontdooien moeten worden vermeden. Het Lysis-reagens kan maximaal 7 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    3. Bereid een standaardcurve voor met onbehandelde ARPE-19-cellen.
      1. Trypsiniseren van de cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol en tellen de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35. Centrifugeer de cellen bij 120 g gedurende 10 minuten bij RT. Zuig het supernatant op en resuspend de celkorrel in DMEM/Ham's F12 medium met 1% FBS tot een eindconcentratie van 1 x 105 cellen/ml.
      2. Bereid 7 seriële 1:1 verdunningen in een medium van 200 μL met 1% FBS. Breng 100 μL van elke standaard over naar de juiste putten (duplicaten). Voeg 50 μL reagensmengsel toe aan alle putjes.
    4. Meng de cellen met het reagens gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT. Meet luminescentie met behulp van de plaatlezer zoals beschreven in stap 4.1.9 van het protocol. Voeg 50 μL van het lysisreagens toe en incubeer gedurende 15 minuten. Meet luminescentie met behulp van de plaatlezer zoals beschreven in stap 4.1.9 van het protocol.
    5. Bereken het percentage levensvatbare cellen: (100 - % dode cellen) en het percentage dode cellen = [1e luminescentiemeting ((dode cellen in het monster))) / 2e luminescentiemeting (alle cellen dood na digitoninebehandeling)] x 100.
  3. UCP2-expressieanalyse door RT-qPCR
    1. Trypsinize getransfecteerde cellen zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol).
    2. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35.
    3. Zaad 5.000 getransfecteerde ARPE-19 cellen/put in 96-well platen.
    4. Behandel na 24 uur cultuur de cellen met 350 μM H2O2 gedurende 24 uur.
    5. Isoleer totaal RNA met behulp van een commerciële kit voor isolatie van RNA uit een laag aantal cellen (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Voer real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) uit zoals beschreven in Aanvullend materiaal. Genereer in het kort cDNA door retrotranscriptie met behulp van een in de handel verkrijgbare mix die een geoptimaliseerd M-MLV Reverse Transcriptase bevat (zie Tabel met materialen).
    7. Gebruik voor qPCR een kant-en-klare reactiecocktail met alle componenten (inclusief SYBR Green) behalve primers (zie tabel S1 van aanvullend materiaal)en DNA-sjabloon. Gebruik de volgende thermocyclische omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 10 minuten, 40 cycli met denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en rek bij 72 °C gedurende 32 s.
    8. Gebruik de 2^(-ΔΔCT)-methode voor analyse36.
  4. Voorbereiding van cellysaat voor SDS-PAGE en WB analyse van pAkt (Ser473)
    1. Zaad 3 x 105 GM-CSF-getransfecteerde ARPE-19 cellen/put in 6-put platen (≥21 dagen na transfectie) om te bepalen of GM-CSF RPE-cellen beschermt tegen schade door H2O2 door de activering van de Akt overlevingsroute15.
    2. Na 24 uur kweek worden cellen gedurende 24 uur blootgesteld aan 350 μM H2O2.
    3. Meng 1 ml RIPA-buffer met 10 μl proteasefosfataseremmercocktail, 10 μl 0,5 M EDTA en 25 μl 8 m ureum (volumes gebruikt voor één put).
    4. Aspirateer het medium zorgvuldig en was de cellen met 1x PBS.
    5. Voeg het volledige volume RIPA-buffermix toe aan de cellen.
    6. Pipet op en neer.
    7. Verzamel het lysaat in buizen van 1,5 ml.
    8. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    9. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    10. Bepaal de niveaus van pAkt in 15 μL onverdund cellysaat door WB zoals beschreven in Aanvullend materiaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inductie van oxidatieve stress in menselijke retinale pigmentepitheelcellen
ARPE-19 en primaire hRPE-cellen werden behandeld met verschillende concentraties van H2O2 gedurende 24 uur en het intracellulaire niveau van de antioxidant glutathion werd gekwantificeerd (Figuur 2A,B). H2O2 bij 50 μM en 100 μM had geen invloed op de glutathionproductie, terwijl er bij 350 μM een significante afname van glutathion was in ARPE-19- en primaire hRPE-cellen. Analyse van cytotoxiciteit toonde aan dat 350 μM de laagste concentratie van H2O2 is die een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel veroorzaakt(figuur 2C). Morfologisch lijken ARPE-19-cellen behandeld met H2O2 minder verspreid en meer afgerond, kenmerken die duidelijker worden bij toenemende H 2 O2-concentratie(figuur 3). Het effect was minder prominent voor PEDF- en GM-CSF-getransfecteerde cellen behandeld met H2O2 (figuur 3). Om het effect van het celnummer op H2O2-gemedieerde oxidatieve stress aan te tonen, werden 5.000 en 10.000 ARPE-19 cellen per put gezaaid in een witte 96-well plaat; de dag erna werden de cellen gedurende24uur behandeld met 350 μM H 2 O2 en werden de glutathionspiegels bepaald. Figuur 4 laat zien dat het niveau van glutathion alleen afnam in de putjes (n = 3) gezaaid met 5.000 cellen. Voor experimenten om het effect van antioxidanten van H2O2-gegenereerde ROS te bepalen, is het essentieel om rekening te houden met het aantal cellen; voor het specifieke protocol dat in dit rapport wordt gepresenteerd, zijn 3.000-5.000 cellen/put (96-putplaten) die gedurende 24 uur zijn behandeld met 350 μM H2O2 geschikt om significante celschade aan te tonen met behoud van het vermogen om te herstellen en een subacute respons op oxidatieve stress-geïnduceerde celschade na te bootsen.

Figure 2
Figuur 2: Oxidatieve stressniveau aangetoond als glutathionniveau en levensvatbaarheid van cellen, in menselijke RPE-cellen behandeld met H2O2. (A) ARPE-19-cellen blootgesteld aan verschillende concentraties van H2O2 vertoonden significant verlaagde glutathionspiegels (tussen haakjes) bij 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) en 700 μM (0,002 μM) vergeleken met H2O2-niet-behandelde cellen (2,9 μM) (p < 0,0001 voor 350, 500 en 700 μM H2O2). (B)Primaire menselijke RPE-cellen vertoonden verlaagde niveaus van glutathion; het effect was echter minder prominent dan voor ARPE-19, maar nog steeds statistisch significant in vergelijking met de controles bij 350, 500 en 700 μM H2O2. 350 μM was de laagste H2O2-concentratie die significante oxidatieve schade veroorzaakte, zoals blijkt uit verlaagde glutathionspiegels in vergelijking met niet-behandelde controlecellen (p = 0,0022). Glutathionspiegels daalden met toenemende H2O2-concentraties (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) Cytotoxiciteitsanalyse toonde aan dat 350 μM H2O2 de laagste concentratie was die een significante afname van het percentage levensvatbare cellen veroorzaakte (p < 0,0001 voor 350, 500 en 700 μM). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3 replicaties) en significante verschillen worden aangegeven met (*); post-hoc berekeningen van de ANOVA werden uitgevoerd met behulp van Tukey's multi-vergelijkingstest waarbij C- werd vergeleken met de H2O2-behandelingsgroepen. C-: H2O2 niet-behandelde cellen. Dit cijfer is gewijzigd van Bascuas et al.37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Morfologie van niet-getransfecteerde en PEDF- of GM-CSF-getransfecteerde ARPE-19 cellen behandeld met H2O2. Cellen behandeld met toenemende concentraties van H2O2 vertonen minder cellen in de kweekputten en vertonen een meer afgeronde, minder verspreide morfologie, een bekend teken van cellulaire stress. Merk op dat voor PEDF- of GM-CSF-getransfecteerde cellen cellulaire stress minder prominent is en vergelijkbaar is met niet-behandelde controlecellen. C-: niet-behandelde controlecellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Invloed van het celnummer op het effect van H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress. 5.000 en 10.000 ARPE-19 cellen/put werden gezaaid in 96-well platen. Na 24 uur werden de cellen behandeld met 350 μM H2O2 gedurende 24 uur. Significante verschillen in glutathionniveaus werden waargenomen in de putten gezaaid met 5.000 cellen (p = 0,031, t-test), maar niet in de putten gezaaid met 10.000 cellen. C-: niet-behandelde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF geleverd door SB100X-getransfecteerde menselijke RPE-cellen in oxidatieve stressomstandigheden
Als positieve controles werden ARPE-19 en primaire humane RPE-cellen behandeld met 5, 50 of 500 ng / ml in de handel verkrijgbare PEDF of GM-CSF gedurende 2 dagen vóór en tijdens de 24 uur H2O2-behandeling. ARPE-19 cellen behandeld met 500 ng/ml PEDF of 50 ng/ml GM-CSF produceerden significant meer glutathion in vergelijking met onbehandelde controles onder oxidatieve omstandigheden (H2O2-behandeld) (Figuur 5A); vergelijkbare PEDF en GM-CSF gezuiverd uit kweekmedia van getransfecteerde ARPE-19-cellen vertoonden een vergelijkbaar effect(figuur 5B). In primaire hRPE-cellen verminderde de toevoeging van 500 ng / ml PEDF, 50 ng / ml GM-CSF of 500 ng / ml PEDF plus 50 ng / ml GM-CSF, commercieel of gezuiverd uit media geconditioneerd door PEDF- of GM-CSF getransfecteerde ARPE-19-cellen, de celschade zoals weerspiegeld door een significante toename van glutathionspiegels (figuur 5C). Primaire hRPE-cellen die gedurende 10 dagen werden behandeld met geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19-cellen vertoonden ook hogere glutathionspiegels in vergelijking met controlecellen(figuur 5D). Op basis van deze resultaten zijn verdere experimenten gedaan met 500 ng / ml voor PEDF en 50 ng / ml voor GM-CSF.

ARPE-19 en primaire hRPE-cellen werden getransfecteerd met de genen die coderen voor PEDF en / of GM-CSF met behulp van het Doornroosje transposonsysteem in combinatie met elektroporatie. Na transfectie en analyse van genexpressie door RT-qPCR, WB, ELISA en immunohistochemie (zie Aanvullend Materiaal, Figuur S1en Figuur S2) vertoonden getransfecteerde ARPE-19 cellen blootgesteld aan 350 μM H2O2 gedurende 24 uur significant hogere glutathionspiegels dan niet-getransfecteerde H2O2-behandelde cellen (Figuur 6A ). Voor primaire hRPE-cellen is er een significante toename van glutathionspiegels in PEDF-getransfecteerde cellen in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen behandeld met H2O2 toen alle donoren in de analyse werden opgenomen. Bovendien vertonen donoren 2 en 3 een significante toename van glutathionspiegels voor alle getransfecteerde groepen (PEDF, GM-CSF, PEDF en GM-CSF) (gegevens niet weergegeven).

De studie van de UCP2-genexpressie voltooide de analyse door onderzoek van mitochondriale oxidatieve stress. Een proof-of-concept serie werd uitgevoerd in getransfecteerde ARPE-19 cellen behandeld met 350 μM H2O2 gedurende 24 uur. Zoals te zien is in figuur 7,zijn in getransfecteerde ARPE-19-cellen de niveaus van UCP2-genexpressie na behandeling met H2O2 verhoogd, maar de toename is niet statistisch significant. Figuur 8 toont een WB van gefosforyleerde Akt (pAkt) uit een lysaat van GM-CSF-getransfecteerde cellen blootgesteld aan H2O2; de genormaliseerde gegevens tonen slechts een kleine afname in vergelijking met de onbehandelde controle, wat aangeeft dat GM-CSF de cellen kan beschermen tegen oxidatieve stressschade.

Figure 5
Figuur 5: Glutathiongehalte als marker van de antioxidantcapaciteit van PEDF en GM-CSF. (A) Behandeling van ARPE-19-cellen met 500 ng / ml PEDF of 50 ng / ml GM-CSF gedurende 3 dagen vóór en gedurende 24 uur H2O2 blootstelling verhoogde het niveau van glutathion van 0,83 μM (C) tot 1,83 μM (PEDF) en 1,3 μM (GM-CSF), p = respectievelijk 0,026 en p = 0,031. Bij een concentratie van 5 ng/ml werd geen toename van glutathion waargenomen; het verschil in het glutathiongehalte tussen 50 en 500 ng/ml was noch voor PEDF, noch voor GG-CSF significant. (B)PEDF (500 ng/ml) en GM-CSF (50 ng/ml) gezuiverd uit geconditioneerde media van getransfecteerde ARPE-19-cellen vertoonden een effect dat vergelijkbaar is met in de handel verkrijgbare PEDF of GM-CSF (p = 0,018, ANOVA). C)De toevoeging van 500 ng/ml PEDF, 50 ng/ml GM-CSF of 500 ng/ml PEDF plus 50 ng/ml GM-CSF gedurende 3 dagen vóór en gedurende 24 uur H2O2 behandeling aan het kweekmedium van primaire hRPE-cellen verhoogde de niveaus van glutathion in cellen behandeld met PEDF aanzienlijk (2,6 μM [commercieel]; 2,5 μM [gezuiverd]), GM-CSF (2,9 μM [commercieel], 3,3 μM [gezuiverd]) en PEDF plus GM-CSF (3,0 μM [commercieel], 2,9 μM [gezuiverd]) in vergelijking met niet-behandelde cellen (1,9 μM) (p = 0,006, Kruskal-Wallis-test). (D)Een significante toename van glutathionspiegels werd waargenomen voor hRPE-cellen die gedurende 10 dagen werden gekweekt in geconditioneerd medium van PEDF-, GM-CSF- of PEDF-GM-CSF-getransfecteerde ARPE-19-cellen voordat de cellen werden behandeld met H2O2 (p = 0,003, Kruskal-Wallis-test) (gegevens aangetoond voor één donor). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3 replicaties). Significante verschillen worden aangegeven met (*); post-hoc berekeningen van de variantieanalyses werden uitgevoerd door de multivergelijkingstests van Tukey of Dunnett te berekenen door "C" te vergelijken met de met PEDF/GM-CSF behandelde groepen. C: cellen die alleen worden behandeld met H2O2, P: cellen behandeld met PEDF, G: cellen behandeld met GM-CSF, P +G: cellen behandeld met PEDF plus GM-CSF. Dit cijfer is gewijzigd van Bascuas et al.37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Glutathiongehalte als marker van de antioxidantcapaciteit van PEDF- en GM-CSF-getransfecteerde menselijke RPE-cellen. (A) De niveaus van glutathion van getransfecteerde ARPE-19-cellen blootgesteld aan 350 μM H2O2 gedurende 24 uur (56 dagen na transfectie) waren significant hoger in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen (1,9 μM), d.w.z. 3,0 μM voor PEDF- en GM-CSF-getransfecteerde cellen, en 3,4 μM voor dubbel getransfecteerde cellen (p = 0,0001, ANOVA). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3 replicaties). B)De dot plot toont de gemiddelde glutathionwaarden voor vier verschillende donoren (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), wat significant verschilt tussen niet-getransfecteerde en PEDF-getransfecteerde cellen (p = 0,028, post-hoc berekeningen van de ANOVA werden uitgevoerd met behulp van Tukey's multi-vergelijkingstests waarbij "C" werd vergeleken met de met PEDF/GM-CSF behandelde groepen). Wanneer de donoren afzonderlijk worden geanalyseerd, vertonen donor nr. 2 en nr. 3 (zie tabel 2 voor symbool in de grafiek) significante verschillen voor alle getransfecteerde groepen in vergelijking met de niet-getransfecteerde controle (significanties worden niet weergegeven) behandeld met H2O2. C: niet-getransfecteerde cellen, P: PEDF-getransfecteerde cellen, G: GM-CSF-getransfecteerde cellen, P+G: PEDF- en GM-CSF-getransfecteerde cellen. Dit cijfer is gewijzigd van Bascuas et al.37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: UCP2-genexpressie in getransfecteerde ARPE-19-cellen behandeld met H2O2. Omdat UCP2-genexpressie kan worden gebruikt om mitochondriale oxidatieve schade te onderzoeken, onderzochten we het effect van de overexpressie van PEDF en GM-CSF door getransfecteerde ARPE-19-cellen. Getransfecteerde ARPE-19-cellen behandeld met H2O2, hoewel niet statistisch significant, vertonen verhoogde UCP2-genexpressie in vergelijking met de niet-getransfecteerde controle die wijst op oxidatieve stressvermindering, de vouwtoename was 1,57 voor PEDF-, 1,51 voor GM-CSF- en 2,36 voor PEDF- plus GM-CSF-getransfecteerde cellen in vergelijking met de niet-getransfecteerde controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Western Blot van gefosforyleerd Akt (Ser473) uit een cellysaat van GM-CSF-getransfecteerde ARPE-19 cellen. De WB toonde aan dat GM-CSF de fosforylering van Akt in beide onbehandelde en H2O2-behandelde culturen verbetert (UT: 3,32; H2O2: 2.69). De waarden worden genormaliseerd naar niet-getransfecteerde niet-H2O2-behandelde cellen (C/UT). C: niet-getransfecteerde, G: GM-CSF-getransfecteerde cellen, UT: cellen niet behandeld met H2O2,H2O2: cellen behandeld met H2O2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel S1: Primerpaarsequenties en gloeitijd/temperatuur gebruikt voor RT-qPCR. Klik hier om deze tabel te downloaden. 

Figuur S1: PEDF en GM-CSF genexpressie analyse in getransfecteerde hRPE cellen. De RT-qPCR verifieerde dat getransfecteerde primaire hRPE-cellen een significante toename vertoonden in PEDF (p = 0,003, Kruskal-Wallis-test) en GM-CSF (p = 0,013, Kruskal-Wallis-test) genexpressie in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen. In dit geval werd de methode 2^(-ΔΔCT) gebruikt36. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 4 donoren). Elke stip vertegenwoordigt het gemiddelde van drie replicaties. Dit cijfer is gewijzigd van Bascuas et al.37. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S2: Eiwitsecretie in getransfecteerde primaire hRPE- en ARPE-19-cellen. A)De kwantificering van uitgescheiden eiwitten door ELISA toonde aan dat getransfecteerde hRPE-cellen significant meer PEDF en GM-CSF uitscheidden dan niet-getransfecteerde cellen (p = 0,014 voor PEDF en p = 0,006 voor GM-CSF, Kruskal-Wallis-test). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 4 donoren). Elke stip vertegenwoordigt het gemiddelde van drie replicaties. BDe PEDF-GM-CSF dubbele kleuring bevestigde de co-secretie van PEDF en GM-CSF in dubbel getransfecteerde ARPE-19 cellen (samengevoegde figuur). Dit cijfer is gewijzigd van Bascuas et al.37. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol biedt een benadering om de anti-oxidatieve en beschermende functie van PEDF en GM-CSF geproduceerd door getransfecteerde cellen te analyseren, die kunnen worden toegepast op cellen die zijn getransfecteerd met elk vermeend gunstig gen. In gentherapeutische strategieën die tot doel hebben eiwitten aan weefsel te leveren door genetisch gemodificeerde cellen te transplanteren, is het van cruciaal belang om informatie te verkrijgen over het niveau van eiwitexpressie, de levensduur van expressie en de effectiviteit van het tot expressie gebrachte eiwit in een model van de ziekte. In ons laboratorium is het hier gepresenteerde protocol nuttig geweest om de effectiviteit van PEDF en GM-CSF op oxidatieve stress te definiëren, waarvan is verondersteld dat het een belangrijk element is in de pathogenese van aAMD6,7. In het bijzonder hebben we het protocol gebruikt om het anti-oxidatieve effect van SB100X-gemedieerdePEDF / GM-CSF-getransfecteerde primaire hRPE-cellen te definiëren. Verschillende onderzoekers hebben aangetoond dat H2O2 significante symptomen van oxidatieve stress induceert, maar nog steeds celregeneratie28,29,38mogelijk maakt, vergelijkbaar met de resultaten van onze experimenten die hebben aangetoond dat 350 μM gedurende 24 uur effectieve oxidatieve stress induceert in menselijke ARPE-19 en primaire RPE-cellen die kunnen worden gebruikt om het beschermende effect van de PEDF en GM-CSF te analyseren. H2O2 als oxidatief middel is gekozen voor de studie vanwege de fysiologische aanwezigheid in het oog en de bijbehorende afweermechanismen, bijvoorbeeld glutathionmetabolisme20,21. Ons laboratorium heeft andere modellen van oxidatieve stress onderzocht, zoals de behandeling van cellen met tBH, die lipideperoxidatie initieert in de aanwezigheid van redox-actieve metaalionen1; oxidatieve stress was echter verwaarloosbaar. In de hier gepresenteerde experimenten werden cellen behandeld met H2O2 gedurende 24 uur omdat we ontdekten dat kortere behandelingstijden van 2-6 uur voldoende zijn om veranderingen in genexpressie20te induceren, maar latere gevolgen, bijvoorbeeld celproliferatie, levensvatbaarheid van cellen en glutathionniveaus, zijn mogelijk nog niet zichtbaar. Anders leidt de kleine omvang van de putten, noodzakelijk voor de cytotoxiciteit en glutathiontests, snel tot een confluente cultuurput; dit kan leiden tot contactremming en een maskering van het effect van het oxidatieve middel. Daarom lijkt een lange incubatie met H2O2 niet nuttig, hoewel de degeneratie die wordt gezien bij aAMD wordt veroorzaakt door chronische oxidatieve stress6,7.

Een beperking van de hier gepresenteerde experimenten is dat het aantal gezaaide cellen het oxidatieve effect van H2O2beïnvloedt, d.w.z. voor dezelfde H2O2-behandeling werden significante verschillen in de glutathionspiegels tussen H2O2-behandelde en niet-behandelde cellen waargenomen wanneer 5.000 cellen, maar niet wanneer 10.000 cellen werden gezaaid (Figuur 4 ). Het protocol dat we presenteren vereist het zaaien van een laag aantal cellen, d.w.z. 3.000 wanneer cellen gedurende 3 dagen worden gekweekt en 5.000 wanneer cellen gedurende 2 dagen worden gekweekt(figuur 1). Een andere beperking is dat de concentratie van H2O2 met de tijd uitgeput raakt; Kaczara et al.39 hebben gedurende een paar uur uitputting van H2O2 aangetoond in ARPE-19 celculturen, wat de ontwikkeling van chronische oxidatieve stressmodellen beïnvloedt. Deze onderzoekers hebben een alternatieve methode voorgesteld voor langdurige H 2 O2-behandeling, met name het continu genereren van H2O2 uit glucose in het medium met behulp van glucoseoxidase, maar een gestandaardiseerde concentratie van H2O2 kan niet worden gegarandeerd. Aan de andere kant heeft het protocol dat we hebben vastgesteld met de afgifte van het oxidatieve middel in één enkele puls, het voordeel dat het sneller en eenvoudiger uit te voeren is in vergelijking met chronische modellen waarin de H2O2-behandeling meerdere dagen moet worden herhaald38.

Het vermogen van cellen om de oxidatieve schade tegen te gaan wordt bepaald door de balans tussen ROS-productie en het vermogen om antioxidanten te genereren. In de cel is het tripeptide glutathion (GSH) het overheersende reductiemiddel, dat kan worden geoxideerd tot glutathiondisulfide (GSSG) en geregenereerd door glutathionreductase met behulp van NADPH40. In gezonde cellen is meer dan 90% van de totale glutathionpool aanwezig in de gereduceerde vorm. Wanneer cellen worden blootgesteld aan een verhoogd niveau van oxidatieve stress, hoopt GSSG zich op en neemt de verhouding tussen GSSG en GSH toe. Bijgevolg is het monitoren van de glutathion redoxtoestand in biologische monsters essentieel voor de evaluatie van de ontgiftingsstatus van cellen en weefsels van vrije radicalen gegenereerd tijdens oxidatieve stress en celbeschadiging. Het hier beschreven protocol voor de kwantificering van glutathion is gevoelig genoeg om het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF te detecteren, uitgedrukt door RPE-cellen genetisch gemodificeerd.

Aangezien oxidatieve stress mitochondriale activiteitenbeïnvloedt 40, is het bijzonder interessant dat de controle van ROS-niveaus door PEDF gerelateerd is aan de regulatie van het mitochondriale ontkoppelingseiwit 2 (UCP2), en PEDF verzwakt de effecten van oxidatieve stress door UCP2-expressie11,41te verhogen . De belangrijkste functie van UCP2 is het beheersen van mitochondria-afgeleide ROS en het fungeren als een sensor van mitochondriale oxidatieve stress41,42. Hier, naast het onderzoeken van het effect van PEDF en GM-CSF op glutathionspiegels, hebben we de genexpressie van UCP2 de neiging om toe te nemen (Figuur 7); aanvullend onderzoek is nodig om de rol van PEDF en GM-CSF op UCP2-genexpressie vast te stellen.

Over het algemeen biedt het huidige H2O2-model een alomvattende aanpak om het gunstige effect van transposon-gebaseerde gentherapieën te onderzoeken die gericht zijn op het leveren van antioxiderende therapeutische genen aan de cellen van de patiënt om neurodegeneratieve ziekten als AMD te behandelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen Gregg Sealy en Alain Conti bedanken voor hun uitstekende technische assistentie en Prof. Zsuzsanna Izsvák van het Max-Delbrück Center in Berlijn voor het leveren van de pSB100X en pT2-CAGGS-Venus plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Sciences Foundation en de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma. Z.I werd gefinancierd door european research council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Geneeskunde Nummer 166 oculaire gentherapie leeftijdsgebonden maculaire degeneratie oxidatieve stressschade Doornroosje transposon niet-virale genafgifte RPE-cellen PEDF GM-CSF
Inductie en analyse van oxidatieve stress in <em>doornroosje</em> Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter