Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Induktion och analys av oxidativ stress i Törnrosa Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelial Cells

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Vi presenterar ett protokoll för utveckling och användning av en oxidativ stressmodell genom att behandla retinal pigment epitelial celler med H2O2, analysera cell morfologi, livskraft, densitet, glutationen och UCP-2 nivå. Det är en användbar modell för att undersöka antioxidanteffekten av proteiner som utsöndras av transposon-transfekterade celler för att behandla neuroretinal degeneration.

Abstract

Oxidativ stress spelar en avgörande roll i flera degenerativa sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en patologi som påverkar ~ 30 miljoner patienter över hela världen. Det leder till en minskning av retinal pigment epitel (RPE)-syntetiserade neuroprotektiva faktorer, t.ex. pigment epitel-härledda faktor (PEDF) och granulocyt-macrophage koloni-stimulerande faktor (GM-CSF), följt av förlust av RPE celler, och så småningom fotoreceptor och retinal ganglion cell (RGC) död. Vi t ställa hypotesen att rekonstitution av neuroprotektiva och neurogena retinal miljö genom subretinal transplantation av transretinal transplantation av transretinal transplantation av transfectederade RPE celler överuttryck PEDF och GM-CSF har potential att förhindra retinal degeneration genom att mildra effekterna av oxidativ stress, hämma inflammation och stödja cellen överlevnad. Med hjälp av Törnrosa transposon system (SB100X) mänskliga RPE celler har transfected med PEDF och GM-CSF gener och visat stabil genintegration, långsiktiga genuttryck och protein sekretor med qPCR, western blot, ELISA och immunofluorescens. För att bekräfta funktionaliteten och styrkan hos PEDF och GM-CSF utsöndras av de transfected RPE celler, har vi utvecklat en in vitro-analys för att kvantifiera minskningen av H2O2-induceradoxidativ stress på RPE celler i kultur. Cell skydd utvärderades genom att analysera cellen morfologi, densitet, intracellulär nivå av glutation, UCP2 genuttryck och cellen livskraft. Både transfected RPE-celler som överuttrycker PEDF och/eller GM-CSF och celler som inte är transfekterade men förbehandlade med PEDF och/eller GM-CSF (kommersiellt tillgängliga eller renade från transfekterade celler) visade betydande antioxidant cellskydd jämfört med icke-behandlade kontroller. Den nuvarande H2O2-modellenär ett enkelt och effektivt tillvägagångssätt för att utvärdera antioxidanteffekten av faktorer som kan vara effektiva för att behandla AMD eller liknande neurodegenerativa sjukdomar.

Introduction

Modellen som beskrivs här, erbjuder ett användbart tillvägagångssätt för att utvärdera effektiviteten avbiofarmaceutiska medel för att minska oxidativ stress i celler. Vi har använt modellen för att undersöka de skyddande effekterna av PEDF och GM-CSF på H2O2-medieradoxidativ stress på näthinnepigment epitelceller, som utsätts för höga nivåer av O2,och synligt ljus, och fagocytos av fotoreceptor yttre segmentmembran, vilket genererar betydande nivåer av reaktiva syrearter (ROS)1, 2. De anses vara en stor bidragsgivare till patogenesen vid avascular åldersrelaterad makuladegeneration (aAMD)3,4,5,6,7,8. Dessutom finns det en minskning av RPE-syntetiserade neuroprotektiva faktorer, särskilt pigmentepitetel-härledd faktor (PEDF), insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF) och granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) som leder till dysfunktion och förlust av RPE-celler, följt av fotoreceptor och retinal ganglion cell (RGC) död3,4,5 . AMD är en komplex sjukdom som är resultatet av interaktionen mellan metaboliska, funktionella, genetiska och miljömässiga faktorer4. Bristen på behandlingar för aAMD är den främsta orsaken till blindhet hos patienter äldre än 60 år i industrialiserade länder9,10. Rekonstitutionen av den neuroprotektiva och neurogena näthinnemiljön genom subretinal transplantation av genetiskt modifierade RPE-celler som överuttrycker PEDF och GM-CSF har potential att förhindra retinal degeneration genom att mildra effekterna av oxidativ stress, hämma inflammation och stödja cellöverlevnad11,12,13,14,15,16 . Även om det finns flera metoder för att leverera gener till celler, har vi valt det icke-virala hyperaktiva Törnrosa transposonsystemet för att leverera PEDF- och GM-CSF-generna till RPE-celler på grund av dess säkerhetsprofil, integreringen av generna i värdcellernas genom och dess benägenhet att integrera de levererade generna på icke-transkriptionellt aktiva platser som vi har visat tidigare17, 18,19.

Cellulär oxidativ stress kan induceras i celler som odlas in vitro av flera oxidativa medel, inklusive väteperoxid (H2O2),4-hydroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxid (tBH), höga syrespänningar och synligt ljus (fullt spektrum eller UV-bestrålning)20,21. Höga syrespänningar och ljus kräver särskild utrustning och förhållanden, vilket begränsar överförbarheten till andra system. Medel som H2O2, HNE och tBH inducera överlappande oxidativ stress molekylära och cellulära förändringar. Vi valde H2O2 för att testa antioxidantaktiviteten hos PEDF och GM-CSF eftersom det är bekvämt och biologiskt relevant eftersom det produceras av RPE-celler som en reaktiv syre mellanliggande under photoreceptor yttre segment fagocytos22 och det finns i okulär vävnader in vivo23. Eftersom oxidationen av glutation kan vara delvis ansvarig för produktionen av H2O2 i ögat, har vi analyserat nivåerna av GSH / glutation i våra studier, som är kopplade till H2O2-induceradoxidativ stress och den regenerativa kapaciteten hos celler21,22. Analysen av glutationen nivåer är särskilt relevant eftersom den deltar i de antioxidativa skyddsmekanismerna i ögat24. Exponering för H2O2 används ofta som modell för att undersöka den oxidativa stresskänsligheten och antioxidantaktiviteten hos RPE-cellerna1,25,26,27,28,29,30, och dessutom visar den likheter med ljusinducerade oxidativ stressskada, en "fysiologisk" källa till oxidativ stress21.

För att utvärdera funktionaliteten och effektiviteten av neuroprotektiva faktorer har vi utvecklat en in vitro-modell som gör det möjligt för analysen att kvantifiera den antioxidativa effekten av tillväxtfaktorer uttryckta av celler genetiskt modifierade för att överuttrycka PEDF och GM-CSF. Här visar vi att RPE-celler som transfekteras med generna för PEDF och GM-CSF är mer resistenta mot de skadliga effekterna av H2O2 än icke-transfekterade kontrollceller, vilket framgår av cellmorfologi, densitet, livskraft, intracellulär nivå av glutation och uttryck av UCP2-genen, som kodar för mitokondriellt frikoppling av protein 2 som har visat sig minska reaktiva syrearter (ROS)31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Förfaranden för insamling och användning av mänskliga ögon godkändes av Cantonal Ethical Commission for Research (nr 2016-01726).

1. Cellisolering och odlingsförhållanden

  1. Mänsklig ARPE-19-cellinje
    1. Kultur 5 x 105 ARPE-19 celler, en mänsklig RPE-cellinje, i Dulbeccos modifierade örns medium/näringsblandning F-12 Skinka (DMEM/Hams F-12) kompletterad med 10% fetala bovinserum (FBS), 80 U/mL penicillin, 80 μg/mL streptomycin och 2,5 μg/mL amphotericin B (komplett medium) vid 37 °C i en fuktad atmosfär av 5% CO5%
    2. Byt medium tre gånger i veckan.
    3. När cellerna har vuxit till cirka 90% sammanflöde (utvärderas kvalitativt), aspirera mediet och tvätta cellerna med steril 1x PBS.
    4. Inkubera cellerna med en 5% Trypsin-2% EDTA-lösning i 7-10 min vid 37 °C (för volymer se tabell 1). Övervaka lösgöring visuellt.
    5. Stoppa trypsiniseringen genom att lägga till komplett medium som innehåller 10 % FBS (för volymer se tabell 1).
    6. Transfektera cellerna (se steg 2 i protokollet), underodla cellerna med ett förhållande av 1:10 (en gång i veckan) eller frö i en 96-brunnsplatta enligt nedan (se steg 3.3 och 3.4 i protokollet).
Medium (mL)
Yta (cm²) Såddtäthet för ARPE-19-celler (celler/brunn) Tillämpning För cellkultur Så här stoppar du trypsin Volym trypsin (ml)
Kolv T75 75 5,00,000 ARPE-19 celltillväxt 10 7 3
6 Brunn pläterar 9.6 1,00,000 Sådd av transfekterade ARPE-19-celler 3 1 0.5
24 Brunnsplatta 2 50,000 Sådd av transfekterade hRPE-celler 1 0.8 0.2
96 Brunnsplatta 0.32 5 000 för oxidativa stressexperiment med transfekterade celler (Bild 1) Oxidativa stressexperiment 0.2
3 000 för oxidativa stressexperiment med icke-transfekterade celler plus proteiner (Fig. 1)

Tabell 1: Cellodlingsvolymer. Rekommenderade medievolymer för cellodlingsplattor och flaskor för odling av ARPE-19 och primära mänskliga RPE-celler.

  1. Primära RPE-celler för människa
    1. Isolera primära mänskliga RPE-celler som beskrivs av Thumann et al.17, och kulturceller i komplett medium kompletterade med 20% FBS.
    2. Byt medium två gånger i veckan. När cellerna når sammanflöde (övervakas visuellt), minska FBS till 1% för att undvika överväxt.
    3. Transfektera cellerna (se steg 2 i protokollet) eller frö i en 96-brunnsplatta enligt nedan (se steg 3.3 och 3.4 i protokollet).
      OBS: Data som presenteras här samlades in från kulturen av RPE celler som erhållits från ögonen på fyra mänskliga givare. Tabell 2 beskriver demografin hos donatorerna från Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Ögonen var inucleated 12,7 ± 5,7 h (medelvärde ± SD) efter att informerat samtycke erhållits i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
Nej ålder genus död till bevarande (timmar) död till isolering odling odling Symbol i diagrammet
(dagar) före transfektion (dagar) efter transfektion (dagar)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
betyda 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabell 2: Demografi hos mänskliga donatorer för näthinnepigment epitelceller.

2. Elektroporation av ARPE-19 och primära mänskliga RPE-celler

  1. Trypsinize ARPE-19 celler eller primära mänskliga RPE celler enligt beskrivningen i steg 1.1.3-1.1.5 av protokollet.
  2. Utför elektroporation med det kommersiellt tillgängliga transfekteringssatsen (se Tabell över material).
    1. För transfektion av ARPE-19-celler hänvisas till Johnen et al.32 och för primär hRPE till Thumann et al.17. Kort, resuspend 1 x 105 ARPE-19 celler eller 5 x 104 primära hRPE celler i 11 μL R buffert och tillsätt 2 μL plasmidblandning som innehåller 0,03 μg pSB100X transposase33 och 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His eller pT2- CMV- För PEDF och GM-CSF dubbeltransfekterade celler, använd ett förhållande på 1:16:16 (0,03 μg pSB100X,0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His och 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Använd följande elektroporationsparametrar: två pulser på 1 350 V för 20 ms (pulsbredd) för ARPE-19-celler; två pulser på 1 100 V för 20 ms för primärceller.
  3. Frö 1 x 105 transfected ARPE-19 eller 5 x 104 transfected primära hRPE celler i 6-väl respektive 24-brunn tallrikar, i medium kompletterat med 10% FBS utan antibiotika eller antimykotika. Tillsätt penicillin (80 U/mL), streptomycin (80 μg/mL) och amphotericin B (2,5 μg/ml) med det första mellanbytet 3 dagar efter transfektion.
  4. Bestäm celltillväxten genom mikroskopisk övervakning av cellerna varje vecka. Transfektionseffektivitet övervakas av analys av genuttryck av RT-PCR och proteinutsöndring av ELISA och WB (metoder som förklaras i kompletterande material).
    OBS: Transfekteringseffektiviteten kan utvärderas för första gången när cellerna når sammanflöde, dvs. vid ~7 dagar och 4 veckor efter transfektion för ARPE-19-celler respektive primära hRPE-celler.
  5. Fröceller i en 96-brunnsplatta enligt nedan (se steg 3.5 i protokollet).

3. Oxidativ stressinduktion (H2O2 behandling) och neuroprotektion (PEDF- och/eller GM-CSF-behandling)

  1. Beredning av konditionerat medium av transfected ARPE-19 celler
    1. Använd ARPE-19-celler som är transfekterade med generna PEDF, GM-CSF eller båda (se steg 2 i protokollet); kulturceller i 28 dagar enligt beskrivningen i steg 1.1 i protokollet.
    2. Vid 28 dagar efter transfektionen, trypsinize celler (se steg 1.1.3-1.1.5 i protokollet), räkna celler med en Neubauer kammare34,35, och frö 5 x 105 celler i T75 kolvar i komplett medium som beskrivs i steg 1.1.1 i protokollet. Byt ut mediet när cellkulturen är ungefär 80% sammanflöde (ungefär efter 1 vecka; verifierad kvalitativt). Samla in mediet efter 24 timmar.
    3. Förvara mediet vid -20 °C tills det används.
      OBS: Tillräcklig koncentration av rekombinant PEDF och GM-CSF i det konditionerade mediet kontrollerades av WB och kvantifierades av ELISA enligt beskrivningen i kompletterande material.
  2. Rening av PEDF och GM-CSF från konditionerat medium av transfekterade ARPE-19-celler
    1. Centrifugera det insamlade mediet från steg 3.1.2 vid 10 000 x g i 15 min vid 4 °C.
    2. Använd Ni-NTA-superflödet (se Tabell över material)enligt tillverkarens protokoll för att rena his-märkta proteiner enligt beskrivningen nedan.
      1. Pipettera 30 μL Ni-NTA-blandningen till ett 1,5 mL-rör och centrifugera vid 2 600 x g i 30 s och kassera genomflödet. Tvätta pelleten två gånger med 200 μL 1x inkubationsbuffert.
      2. Centrifugera vid 2 600 x g i 30 s och kassera genomströmningen. Tillsätt 40 μL 4x inkubationsbuffert och återsuspend.
      3. Tillsätt 900 μL centrifugerat konditionerat medium och inkubera vid 70 varv/min (orbital shaker) i 1 h vid RT. Centrifug vid 2 600 x g i 1 min och utkastflödet.
      4. Tvätta pelleten två gånger med 175 μL 1x inkubationsbuffert. Centrifugera vid 2 600 x g i 30 s och kassera genomströmningen.
      5. För att undkomma his-märkta PEDF- och GM-CSF-proteiner, tillsätt 20 μL Elution-buffert och inkubera vid 70 varv/min (orbital shaker) i 20 minuter vid RT. Centrifuge vid 2 600 x g i 30 s. Förvara supernatanten som innehåller rekombinant PEDF eller GM-CSF.
    3. Kvantifiera det totala proteinet med hjälp av det kommersiellt tillgängliga BCA-proteinanalyspaketet (se Tabell över material)enligt tillverkarens instruktioner.
    4. Förvara proteinlösningen vid -20 °C tills den används.
      OBS: Inkubationsbuffert (4x) innehåller 200 mM NaH2PO4,1,2 M NaCl och 40 mM Imidazol; Elution buffert innehåller 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl och 250 mM Imidazol.
  3. Behandling av icke-transfekterade ARPE-19/primära hRPE-celler med konditionerat medium plus H2O2 (figur 1A)
    1. Frö 3 000 icke-transfekterade ARPE-19 (från steg 1.1.6 i protokollet) eller primära hRPE (från steg 1.2.3 i protokollet) celler per brunn i 96-brunnsplatta och odling i 200 μL konditionerat medium från transfected ARPE-19 celler.
    2. Odla cellerna i 10 dagar vid 37 °C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 och 95% luft. Byt det konditionerade mediet varje dag. Exponera cellerna för 350 μM H2O2 för 24 timmar.
    3. Utvärdera oxidativ stressskada och bestäm antioxidanteffekten av PEDF och GM-CSF genom kvantifiering av glutationens nivåer (se steg 4.1 i protokollet), mikroskopi (se steg 4.2 i protokollet) och cytotoxicitetsanalys (se steg 4.2 i protokollet).
      Obs: Experimentets varaktighet är 12 dagar. Tydliga platta botten mikrobrunnar används för att utvärdera luminiscens samt cellmorfologi. För att samtidigt utföra cytotoxicitets- och glutationens analys måste två plattor sås med celler samma dag.
  4. Behandling av icke-transfekterade ARPE-19/primära hRPE-celler med PEDF- och GM-CSF-tillväxtfaktorer plus H2O2 (figur 1B)
    1. Frö 3 000 icke-transfekterade ARPE-19 (från steg 1.1.6 i protokollet) eller primära hRPE (från steg 1.2.3 i protokollet) celler per brunn (96-brunnsplattor med en klar platt botten) i 200 μL komplett odlingsmedium som innehåller 500 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/ml rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/mL rekombinant PEDF och/eller 50 ng/ml rekombinant PEDF och/eller 50 ng/ml rekombinant. Odlingsceller för 48 h vid 37 °C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 och 95% luft. Förnya mediet inklusive PEDF och GM-CSF tillväxtfaktorer dagligen.
      OBS: Lägg till tillväxtfaktorerna färska i mediet.
    2. Efter 48 timmar av behandling av cellerna med tillväxtfaktorerna, ta bort mediet och tillsätt komplett medium som innehåller 350 μM H2O2 plus 500 ng/mL PEDF och/eller 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Utvärdera oxidativ stressskada och bestäm antioxidanteffekten av PEDF och GM-CSF genom kvantifiering av glutationens nivåer (se steg 4.1 i protokollet), mikroskopi (se steg 4.2 i protokollet) och cytotoxicitetsanalys (se steg 4.2 i protokollet).
      Obs: Experimentets varaktighet är 3 dagar.
  5. Behandling av transfekterade ARPE-19/primära hRPE-celler med H2O2 (figur 1C)
    1. Kontrollera tillräckligt med genuttryck och proteinutsöndring av transfekterade celler med WB och ELISA enligt beskrivningen i tilläggsmaterialet.
    2. Ta bort mediet från brunnarna som innehåller de transfekterade cellerna (se steg 2 i protokollet).
    3. Trypsinize celler enligt beskrivningen i steg 1.1.3-1.1.5 i protokollet. Räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare34,35.
    4. Frö 5 000 transfekterade celler/brunn i 96-brunnsplatta i 200 μL komplett medium. Odlingsceller för 24 h vid 37 °C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 och 95% luft. Efter 24 timmar, exponera cellerna för 350 μM H2O2 för 24 h.
    5. Utvärdera oxidativ stressskada och bestäm antioxidanteffekten av PEDF och GM-CSF genom kvantifiering av glutationsnivåer (se steg 4.1 i protokollet), mikroskopi (se steg 4.2 i protokollet), cytotoxicitetsanalys (se steg 4.2 i protokollet) och bestämning av UCP2-genuttryck (se steg 4.3 i protokollet).
      Obs: Experimentets varaktighet är 2 dagar.

Figure 1
Figur 1: Tidslinjer för H2O2-analysen i de tre olika experimentella metoderna. 3 000 icke-transfekterade celler som behandlats med de konditionerade medium/rekombinanta proteinerna eller 5 000 transinfekterade celler såddes i 96-brunnsplattor för behandling med H2O2. För att bestämma effekten av konditionerat medium odlades cellerna i 100% odlat medium i 10 på varandra följande dagar och förändrades medium varje dag. För att bestämma effekten av rekombinanta tillväxtfaktorer odlades cellerna genom att lägga till lämplig mängd tillväxtfaktorer varje dag under 3 på varandra följande dagar. Observera att icke-transfekterade celler såddes vid 3 000 celler per brunn för att undvika överväxt under den längre odlingstiden jämfört med transfekterade celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

4. Analys av oxidativ stressnivå och antioxidantkapacitet

  1. Glutationens analys
    1. Mät glutationen (GSH) med hjälp av det kommersiellt tillgängliga satsen (se Tabell över material)enligt tillverkarens instruktioner. Förbered kortfattat och lämplig volym av 1x reagensblandning (100 μL reagens/brunn): Luciferin-NT substrat och glution S-Transferase utspädd 1:100 i reaktionsbuffert.
      OBS: En 96-välplatta kräver 10 ml 1x reagensblandning, som bereds genom tillsats av 100 μL Luciferin-NT-substrat och 100 μL glution S-Överförings till 10 ml reaktionsbuffert. Förbered 1x reagensblandningen omedelbart före användning. Förvara inte förberedd reagensblandning för framtida användning.
    2. Förbered Luciferin Detection Reagent genom att överföra en flaska rekonstitutionsbuffert till det frystorkade Luciferin Detection Reagent.
    3. Förbered en standardkurva med en glutationsstandardlösning (GSH). Späd 5 mM GSH-lösning 1:100 med dH2O (tillsätt 10 μL 5 mM GSH-lösning till 990 μL dH2O). Utför 7 seriella 1:1 utspädning i 500 μL dH2O. Överför 10 μL av varje utspädd standard till en lämplig brunn i duplikat.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av glutation kommer att variera från 0,039 μM till 5 μM.
    4. Förbered blindmedlet (1x reagensblandning) och överför 10 μL (dubbletter) till lämpliga brunnar.
    5. Ta bort H2O2-behandladeceller från inkubatorn.
      OBS: Dokumentera morfologin hos H2O2-behandladeceller med brightfieldmikroskopi (40x).
      När cellerna oxideras ser de mer rundade och mindre spridda ut.
    6. Aspirera försiktigt odlingsmediet. Tillsätt 100 μL beredd 1x reagensblandning till varje brunn. Blanda cellerna med reagenset i 15 s vid 500 varv/min på en orbital shaker.
    7. Inkubera plattan på RT i 30 min. Tillsätt 100 μL rekonstituerad Luciferindetekteringsreagens till varje brunn.
    8. Blanda lösningen i 15 s vid 500 varv/min på en orbital shaker. Inkubera plattan i 15 min på RT.
    9. Bestäm luminiscens med hjälp av en plattläsare med hjälp av ett förinstallerat program ADP-Glo.
      OBS: Sätt plattan i plattläsaren utan lock.
      1. Klicka på Ändra layout och välj följande inställningar i Grundläggande parametrar:Costar 96-brunnsplatta; topoptisk; Positionsfördröjning: 0.1. Mätningens starttid: 0,0; Mätintervalltid: 1,0; Tid för att normalisera resultaten: 0,0; förstärkningen justeras automatiskt av enheten. Definiera ämnen, standarder och exempel. Klicka på Startmätning.
      2. Exportera data som en Excel-fil. Beräkna koncentrationen av GSH i varje prov genom interpolering av standardkurvan.
  2. Cytotoxicitetsanalys och mikroskopisk analys
    1. Aspirera mediet från cellerna och tillsätt 100 μL komplett medium som innehåller 1% FBS till varje brunn. Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn.
      OBS: 1% FBS används eftersom högre procentandelar av FBS kan störa mätningen av luminiscensen, därför används 1% FBS i detta fall.
    2. Mät cellens livskraft med hjälp av det kommersiellt tillgängliga analyspaketet för cytotoxicitet (se tabell över material)enligt tillverkarens instruktioner. Förbered kortfattat reagensblandningen och tillsätt assaybufferten till det frystorkade substratet. Förbered Lysis Reagent genom att tillsätta 33 μL Digitonin till 5 ml analysbuffert (för en 96-brunnsplatta). Blanda väl genom pipettering upp och ner för att säkerställa homogenitet.
      OBS: För optimalt resultat, använd nyberedd reagensblandning. Använd inom 12 timmar om den förvaras i RT. Reagensblandning kan förvaras vid 4 °C i upp till 7 dagar och kan förvaras i alikvoter för engångsbruk i upp till 4 månader vid -70 °C. Frysning och upptining måste undvikas. Lysis reagens kan förvaras vid 4 °C i upp till 7 dagar.
    3. Förbered en standardkurva med obehandlade ARPE-19-celler.
      1. Prova cellerna enligt beskrivningen i steg 1.1.3-1.1.5 i protokollet och räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare34,35. Centrifugera cellerna vid 120 g i 10 min vid RT. Aspiratera supernatanten och återanvända cellpelleten i DMEM/Hams F12-medium som innehåller 1% FBS till en slutlig koncentration av 1 x 105 celler/ml.
      2. Förbered 7 seriella 1:1 utspädningar i 200 μL medium innehållande 1% FBS. Överför 100 μL av varje standard till lämpliga brunnar (dubbletter). Tillsätt 50 μL reagensblandning till alla brunnar.
    4. Blanda cellerna med reagenset i 15 s vid 500 varv/min på en orbital shaker. Inkubera plattan i 15 minuter vid RT. Mät luminiscensen med hjälp av plattläsaren enligt beskrivningen i steg 4.1.9 i protokollet. Tillsätt 50 μL av lysreagenset och inkubera i 15 minuter. Mät luminiscens med hjälp av plattläsaren enligt beskrivningen i steg 4.1.9 i protokollet.
    5. Beräkna procentandelen livskraftiga celler: (100 - % döda celler) och procentandelen döda celler = [1: a luminiscensmätningen ((döda celler i provet))/ andra luminiscensmätningen (alla celler döda efter digitoninbehandling)] x 100.
  3. UCP2 uttrycksanalys av RT-qPCR
    1. Trypsinize transfected celler som beskrivs ovan (steg 1.1.3-1.1.5 i protokollet).
    2. Räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare34,35.
    3. Frö 5 000 transfekterade ARPE-19 celler/brunn i 96-brunnsplattor.
    4. Efter 24 h av odling, behandla cellerna med 350 μM H2O2 för 24 h.
    5. Isolera totalt RNA med hjälp av ett kommersiellt kit för isolering av RNA från lågt antal celler (se Materialtabellen)enligt tillverkarens instruktioner.
    6. Utför kvantitativ PCR (RT-qPCR) i realtid enligt beskrivningen i kompletterande material. Generera cDNA genom retrotranscription med hjälp av en kommersiellt tillgänglig blandning som innehåller en optimerad M-MLV Reverse Transcriptase (se Tabell över material).
    7. För qPCR använd en färdig reaktionscocktail som innehåller alla komponenter (inklusive SYBR Green) utom primers (se tabell S1 i kompletterande material)och DNA-mall. Använd följande termocyklingsförhållanden: initial denaturering vid 95 °C i 10 min, 40 cykler med denaturering vid 95 °C för 15 s, glödgning vid 60 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C för 32 s.
    8. Använd 2^(-ΔΔCT) metod för analys36.
  4. Beredning av cell lysate för SDS-PAGE och WB analys av pAkt (Ser473)
    1. Frö 3 x 105 GM-CSF-transfekterade ARPE-19 celler/brunn i 6-brunnsplattor (≥21 dagar efter transfektion) för att avgöra om GM-CSF skyddar RPE-celler från skador genom H2O2 genom aktivering av Akt överlevnadsväg15.
    2. Efter 24 h av odlingsceller utsätts för 350 μM H2O2 för 24 h.
    3. Blanda 1 ml RIPA-buffert med 10 μL proteasfosfatashämmande cocktail, 10 μL 0,5 M EDTA och 25 μL 8 M urea (volymer som används för en brunn).
    4. Aspirera försiktigt medium och tvätta cellerna med 1x PBS.
    5. Lägg till hela volymen RIPA-buffertblandning i cellerna.
    6. Pipett upp och ner.
    7. Samla upp lysat i 1,5 ml rör.
    8. Centrifug vid 20 000 x g i 30 min vid 4 °C.
    9. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL-rör.
    10. Bestäm nivåerna av pAkt i 15 μL outspädd cell lysate av WB enligt beskrivningen i kompletterande material.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion av oxidativ stress i humana Retinal Pigment Epitelialceller
ARPE-19 och primära hRPE-celler behandlades med varierande koncentrationer av H2O2 för 24 h och den intracellulära nivån av antioxidanten glutationen kvantifierades(figur 2A,B). H2O2 vid 50 μM och 100 μM påverkade inte glutationsproduktionen, medan vid 350 μM signifikant minskning av glutation i ARPE-19 och primära hRPE-celler. Analys av cytotoxicitet visade att 350 μM är den lägsta koncentrationen av H2O2 som orsakar en signifikant minskning av cellens livskraft (figur 2C). Morfologiskt verkar ARPE-19-celler behandlade med H2O2 mindre spridda och mer rundade, egenskaper som blir mer uppenbara med ökande H2O2-koncentration (figur 3). Effekten var mindre framträdande för PEDF- och GM- CSF-transfekterade celler som behandlats med H2O2 (figur 3). För att påvisa effekten av cellnummer på H2O2-medieradoxidativ stress, såddes 5 000 och 10 000 ARPE-19 celler per brunn i en vit 96-brunnsplatta; Dagen efter behandlades cellerna med 350 μM H2O2 för 24 h och nivåerna av glutation fastställdes. Figur 4 visar att glutationens nivå endast minskade i brunnarna (n = 3) sådde med 5 000 celler. För experiment för att bestämma effekten av antioxidanter av H2O2-genereradROS är det viktigt att överväga antalet celler; för det specifika protokoll som presenteras i denna rapport är 3 000-5 000 celler/brunn (96-brunnsplattor) behandlade i 24 timmar med 350 μM H2O2 lämpliga för att visa betydande cellskador samtidigt som kapaciteten att återhämta sig efterliknar ett sub akut svar på oxidativa påfrestningar-inducerad cellskada.

Figure 2
Figur 2: Oxidativ stressnivå som visats som glutationsnivå och cellviabilitet, i mänskliga RPE-celler behandlade med H2O2. (A) ARPE-19-celler som exponerats för flera koncentrationer av H2O2 visade signifikant minskade glutationsnivåer (inom parentes) vid 350 μM (0, 66 μM), 500 μM (0,022 μM) och 700 μM (0,002 μM) jämfört med H2O2-icke-behandlade celler (2,9 μM) (p < 0,0001 för 350, 500 och 700 μM H2O2). B)Primära mänskliga RPE-celler visade minskade nivåer av glutationen. Effekten var dock mindre framträdande än för ARPE-19 men fortfarande statistiskt signifikant jämfört med kontrollerna vid 350, 500 och 700 μM H2O2. 350 μM var den lägsta H2O2-koncentrationen som orsakade betydande oxidativ skada, vilket framgår av minskade glutationsnivåer jämfört med icke-behandlade kontrollceller (p = 0, 0022). Glutationsnivåerna minskade med ökande H2O2-koncentrationer (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). C)Cytotoxicitetsanalys visade att 350 μM H2O2 var den lägsta koncentrationen som gav en signifikant minskning av andelen livskraftiga celler (p < 0, 0001 för 350, 500 och 700 μM). Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3 replikat) och signifikanta skillnader anges med (*); post-hoc beräkningar av ANOVA utfördes med hjälp av Tukeys multijämförelsetest som jämförde C- med behandlingsgrupperna H2O2. C-: H2O2 icke-behandlade celler. Denna siffra har ändrats från Bascuas etal.37. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Morfologi av icke-transfekterade och PEDF- eller GM-CSF-transfekterade ARPE-19-celler behandlade med H2O2. Celler som behandlas med ökande koncentrationer av H2O 2 visarfärre celler i odlingsbrunnarna och visar en mer rundad, mindre spridd morfologi, ett känt tecken på cellulär stress. Observera att för PEDF- eller GM-CSF-transfekterade celler är cellulär stress mindre framträdande och växer liknande icke-behandlade kontrollceller. C-: icke-behandlade kontrollceller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Celltalets påverkan på effekten av H2O2-induceradoxidativ stress. 5 000 och 10 000 ARPE-19 celler/brunn såddes i 96-brunnsplattor. Efter 24 h behandlades cellerna med 350 μM H2O2 för 24 h. Signifikanta skillnader i glutionnivåer observerades i brunnarna sådda med 5 000 celler (p = 0, 031, t-test) men inte i brunnarna sådda med 10 000 celler. C-: icke-behandlade celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Analys av antioxidanteffekten av PEDF och GM-CSF levererad av SB100X-transfekterademänskliga RPE-celler under oxidativa stressförhållanden
Som positiva kontroller behandlades ARPE-19 och primära mänskliga RPE-celler med 5, 50 eller 500 ng/ml kommersiellt tillgängliga PEDF eller GM-CSF i 2 dagar före och under behandlingen 24 h H2O2. ARPE-19-celler behandlade med 500 ng/mL PEDF eller 50 ng/mL GM-CSF producerade betydligt mer glutenion jämfört med obehandlade kontroller under oxidativa förhållanden (H2O2-behandlad) (figur 5A); jämförbar PEDF och GM-CSF renas från odlingsmedier av transfected ARPE-19 celler visade en liknande effekt (figur 5B). I primära hRPE-celler minskade tillsatsen av 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF eller 500 ng/mL PEDF plus 50 ng/mL GM-CSF, oavsett om de är kommersiella eller renade från media som är betingade av PEDF- eller GM-CSF-celler, cellskador, vilket återspeglas av en betydande ökning av glutationen). Primära hRPE-celler som behandlats i 10 dagar med konditionerat medium från transfected ARPE-19 celler visade också högre glutenionnivåer jämfört med kontrollceller (figur 5D). Baserat på dessa resultat har ytterligare experiment gjorts med 500 ng/mL för PEDF och 50 ng/mL för GM-CSF.

ARPE-19 och primära hRPE celler transfected med generna kodning för PEDF och/eller GM-CSF med hjälp av Törnrosa transposon systemet i kombination med elektroporation. Efter transfektering och analys av genuttryck av RT-qPCR, WB, ELISA och immunohistokemi (se kompletterande material, figur S1och figur S2),transfekterade ARPE-19-celler exponerade för 350 μM H2O2 för 24 h visade signifikant högre glutationsnivåer än icke-transfekterade H2O2-behandladeceller(figur 6A ). För primära hRPE-celler finns det en signifikant ökning av glutationen i PEDF-transfekterade celler jämfört med icke-transfekterade celler som behandlats med H2O2 när alla givare inkluderades i analysen. Dessutom visar donatorerna 2 och 3 en betydande ökning av glutationens nivåer för alla transfekterade grupper (PEDF, GM-CSF, PEDF och GM-CSF) (data som inte visas).

Studien av UCP2 genuttrycket slutförde analysen genom undersökning av mitokondriell oxidativ stress. En proof-of-concept-serie utfördes i transfekterade ARPE-19 celler behandlade med 350 μM H2O2 för 24 h. Som visas i figur 7, i transfected ARPE-19 celler, nivåerna av UCP2 genuttryck efter H2O2 behandling ökas men ökningen är inte statistiskt signifikant. Figur 8 visar en WB av fosforylerad Akt (pAkt) från en lysate av GM-CSF-transfekterade celler som exponerats för H2O2; De normaliserade data visar endast en liten minskning jämfört med den obehandlade kontrollen, vilket indikerar att GM-CSF kan skydda cellerna från oxidativ stressskada.

Figure 5
Figur 5: Glutationsnivå som markör för antioxidantkapaciteten hos PEDF och GM-CSF. (A)Behandling av ARPE-19 celler med 500 ng/mL PEDF eller 50 ng/mL GM-CSF i 3 dagar före och under 24 h H2O2 exponering ökade glutationsnivån från 0,83 μM (C) till 1,8 p = 0,026 respektive p = 0,031. Vid en koncentration av 5 ng/ml observerades ingen ökning av glutationen. Skillnaden i glutationen mellan 50 och 500 ng/ml var inte signifikant för vare sig PEDF eller GM-CSF. b)PEDF (500 ng/mL) och GM-CSF (50 ng/mL) renade från konditionerade medier av transfekterade ARPE-19-celler visade en effekt som liknar kommersiellt tillgängliga PEDF eller GM-CSF (p = 0,018, ANOVA). c)Tillsatsen av 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF eller 500 ng/mL PEDF plus 50 ng/mL GM-CSF i 3 dagar före och under 24 h H2O2 behandling till odlingsmediet för primära hRPE-celler ökade signifikant nivåerna av glutation i celler som behandlats med PEDF (2, 6 μM] 2,5 μM [renad]), GM-CSF (2,9 μM [kommersiell], 3,3 μM [renad]) och PEDF plus GM-CSF (3,0 μM [kommersiell], 2,9 μM [renad]) jämfört med icke-behandlade celler (1,9 μM) (p = 0,006, Kruskal-Wallis-test). (D) En signifikant ökning av glutationens nivåer observerades för hRPE-celler som odlades i 10 dagar i konditionerat medium från PEDF- eller GM-CSF- eller PEDF-GM-CSF-transfekterade ARPE-19-celler innan cellerna behandlades med H2O2 (p = 0, 003, Kruskal-Wallis-test) (data visade för en givare). Data uttrycks som medelvärde ± SD (n = 3 replikat). Betydande skillnader anges med (*); Post-hoc-beräkningar av variansanalyserna utfördes genom att tukeys eller Dunnetts multijämförelsetester jämförde "C" med de PEDF-/GM-CSF-behandlade grupperna. C: Celler som endast behandlas med H2O2, P: Celler som behandlats med PEDF, G: celler som behandlats med GM-CSF, P+G: celler som behandlats med PEDF plus GM-CSF. Denna siffra har ändrats från Bascuas etal.37. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Glutationsnivå som markör för antioxidantkapaciteten hos PEDF- och GM-CSF-transfekterade mänskliga RPE-celler. (A) Nivåerna av glutation av transfekterade ARPE-19-celler som exponerades för 350 μM H2O2 för 24 timmar (56 dagar efter transfektion) var betydligt högre jämfört med icke-transfekterade celler (1,9 μM), dvs. och 3,4 μM för dubbeltransfekterade celler (p = 0,0001, ANOVA). Data uttrycks som medelvärde ± SD (n = 3 replikat). b)Punktdiagrammet visar medelvärdet glutationsvärden för fyra olika donatorer (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), vilket skiljer sig avsevärt mellan icke-transfekterade och PEDF-transfekterade celler (p = 0,028, post hoc-beräkningar av ANOVA utfördes med hjälp av Tukeys multijämförelsetester som jämförde "C" med PEDF-/GM-CSF-behandlade grupper). När donatorerna analyseras separat visar donator N°2 och N°3 (se tabell 2 för symbol i diagrammet) signifikanta skillnader för alla transfekterade grupper jämfört med den icke-transfekterade kontrollen (betydelser visas inte) behandlade med H2O2. C: icke-transfekterade celler, P: PEDF-transfekterade celler, G: GM-CSF-transfekterade celler, P+G: PEDF- och GM-CSF-transfekterade celler. Denna siffra har ändrats från Bascuas etal.37. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: UCP2-genuttryck i transfekterade ARPE-19-celler behandlade med H2O2. Eftersom UCP2 genuttryck kan användas för att undersöka mitokondriell oxidativ skada, undersökte vi effekten av överuttryck av PEDF och GM-CSF av transfected ARPE-19 celler. Transfected ARPE-19 celler behandlas med H2O2, även om det inte är statistiskt signifikant, visar ökad UCP2 genuttryck jämfört med den icke-transfekterade kontrollen som indikerar oxidativ stress minskning, fold-increase var 1,57 för PEDF-, 1,51 för GM-CSF-, och 2,36 för PEDF- plus GM-CSF-transfected celler jämfört med den icke-transfekterade kontrollen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Western Blot av fosforylerade akt (Ser473) från en cell lysate av GM-CSF-transfekterade ARPE-19 celler. WB visade att GM-CSF förbättrar fosforylering av Akt i både obehandlade och H2O2-behandladekulturer (UT: 3.32; H2O2: 2,69). Värdena normaliseras till icke-transfekterade icke-H2O2-behandlade celler (C/UT). C: ej transfekterade, G: GM-CSF-transfekterade celler, UT: celler som inte behandlats med H2O2, H2O2:celler som behandlats med H2O2. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Tabell S1: Primer-parsekvenser och glödgningstid/temperatur som används för RT-qPCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. 

Figur S1: PEDF- och GM-CSF genuttrycksanalys i transfekterade hRPE-celler. RT-qPCR verifierade att transfected primära hRPE celler visade en betydande ökning av PEDF (p = 0,003, Kruskal-Wallis test) och GM-CSF (p = 0,013, Kruskal-Wallis test) genuttryck jämfört med icke-transfekterade celler. 2^(-ΔΔCT) metod användes i detta fall36. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SD (n = 4 givare). Varje dot representerar medelvärdet av tre replikat. Denna siffra har ändrats från Bascuas etal.37. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Figur S2: Proteinsekresion i transfekterade primära hRPE- och ARPE-19-celler. (A) Elisa:s kvantifiering av utsöndrade proteiner visade att transfekterade hRPE-celler utsöndrades betydligt mer PEDF och GM-CSF än icke-transfekterade celler (p = 0, 014 för PEDF och p = 0, 006 för GM-CSF, Kruskal-Wallis-test). Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 4 givare). Varje dot representerar medelvärdet av tre replikat. b)Dubbelfärgningen PEDF-GM-CSF bekräftade samsekreationen av PEDF och GM-CSF i dubbeltransfekterade ARPE-19-celler (sammanslagen figur). Denna siffra har ändrats från Bascuas etal.37. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som presenteras här erbjuder ett tillvägagångssätt för att analysera den antioxidativa och skyddande funktionen av PEDF och GM-CSF produceras av transfected celler, som kan tillämpas på celler transfected med någon förmodad fördelaktig gen. I genterapeutiska strategier som har som mål att leverera proteiner till vävnad genom transplantation av genetiskt modifierade celler är det viktigt att få information om nivån av proteinuttryck, livslängden på uttrycket och effektiviteten hos det uttryckta proteinet i en modell av sjukdomen. I vårt laboratorium har protokollet som presenteras här varit användbart för att definiera effektiviteten hos PEDF och GM-CSF på oxidativ stress, som har antagits som ett viktigt element i patogenesen vid aAMD6,7. Specifikt har vi använt protokollet för att definiera den antioxidativa effekten av SB100X-medieradePEDF/GM-CSF-transfekterade primära hRPE-celler. Flera utredare har visat att H2O2 inducerar signifikanta symtom på oxidativ stress men fortfarande tillåter cellregenerering28,29,38, liknande resultaten av våra experiment som har visat att 350 μM för 24 h inducerar effektiv oxidativ stress i mänskliga ARPE-19 och primära RPE-celler som kan användas för att analysera den skyddande effekten av PEDF och GM-CSF. H2O2 som oxidativt medel har valts för studien på grund av dess fysiologiska närvaro i ögat och motsvarande försvarsmekanismer, t.ex. glutenionmetabolism20,21. Vårt laboratorium har undersökt andra modeller av oxidativ stress såsom behandling av celler med tBH, som initierar lipidperoxidation i närvaro av redox-aktiva metalljoner1; oxidativ stress var dock försumbar. I de experiment som presenteras här behandlades cellerna med H2O2 för 24 h eftersom vi fann att kortare behandlingstider på 2-6 h är tillräckliga för att inducera förändringar i genuttryck20, men efterföljande konsekvenser, t.ex. cellproliferation, cellviabilitet och glutationsnivåer, kanske inte är synliga ännu. Annars leder brunnarnas lilla storlek, som är nödvändig för cytotoxicitet och glutionanalyser, snabbt till en sammanflödeskultur väl; detta kan leda till kontakthämning och en maskering av effekten av det oxidativa medlet. Därför verkar en lång inkubation med H2O2 inte användbar, även om degenerationen som ses i aAMD orsakas av kronisk oxidativ stress6,7.

En begränsning av de experiment som presenteras här är att antalet celler som sås påverkar den oxidativa effekten av H2O2, dvs. för samma H2O2-behandling, betydande skillnader i glutationens nivåer mellan H2O2-behandlade och icke-behandlade celler observerades när 5 000 celler men inte när 10 000 celler såddes (figur 4 ). Protokollet vi presenterar kräver sådd av ett lågt antal celler, dvs. 3 000 när celler odlas i 3 dagar och 5 000 när celler odlas i 2 dagar (figur 1). En annan begränsning är att koncentrationen av H2O2 är uttömd med tiden; Kaczara et al.39 har visat utarmning av H2O2 under några timmar i ARPE-19 cellkulturer, vilket påverkar utvecklingen av kroniska oxidativa stressmodeller. Dessa prövare har föreslagit en alternativ metod för ihållande H2O2-behandling, som specifikt kontinuerligt genererar H2O2 från glukos i mediet med glukosoxidas, men en standardiserad koncentration av H2O2 kan inte garanteras. Å andra sidan har protokollet vi etablerade med leverans av oxidantmedlet i en enda puls fördelen att vara snabbare och enklare att utföra jämfört med kroniska modeller där H2O2-behandlingen måste upprepas i flera dagar38.

Cellernas förmåga att motverka den oxidativa skadan bestäms av balansen mellan ROS-produktion och förmågan att generera antioxidanter. I cellen är tripeptidglution (GSH) det dominerande reduktionsmedlet, som kan oxideras till glutiondisulfid (GSSG) och regenereras av glutionreduktas med NADPH40. I friska celler finns mer än 90% av den totala glutationen poolen i reducerad form. När celler utsätts för en ökad nivå av oxidativ stress ackumuleras GSSG och förhållandet mellan GSSG och GSH ökar. Följaktligen är övervakning av glutationen redox tillstånd i biologiska prover avgörande för utvärderingen av avgiftningsstatus för celler och vävnader från fria radikaler som genereras under oxidativ stress och cellskada. Protokollet som beskrivs här för kvantifiering av glutationen är tillräckligt känsligt för att upptäcka antioxidanteffekten av PEDF och GM-CSF uttryckt av RPE-celler genetiskt modifierade.

Eftersom oxidativ stress påverkar mitokondriell verksamhet40, är det särskilt intressant att PEDF: s kontroll av ROS-nivåer är relaterad till regleringen av mitokondriellt frikopplingsprotein 2 (UCP2), och PEDF dämpar effekterna av oxidativ stress genom att öka UCP2-uttrycket11,41. Huvudfunktionen hos UCP2 är att kontrollera mitokondri-härledd ROS och fungera som en sensor av mitokondriell oxidativ stress41,42. Här, förutom att undersöka effekten av PEDF och GM-CSF på glutationsnivåer, har vi genuttrycket av UCP2 tenderar att öka (figur 7); ytterligare studier är nödvändiga för att fastställa PEDF: s och GM-CSF: s roll på UCP2 genuttryck.

Sammantaget erbjuder den nuvarande H2O2-modellenett omfattande tillvägagångssätt för att undersöka den positiva effekten av transposonbaserade genterapier som syftar till att leverera antioxidant terapeutiska gener till patientens celler för att behandla neurodegenerativa sjukdomar som AMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Gregg Sealy och Alain Conti för utmärkt teknisk hjälp och prof. Zsuzsanna Izsvák från Max-Delbrück Center i Berlin för att vänligt tillhandahålla pSB100X och pT2-CAGGS-Venus plasmider. Detta arbete stöddes av Den schweiziska nationella vetenskapsstiftelsen och Europeiska kommissionen inom ramen för det sjunde ramprogrammet. Z.I finansierades av Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Medicin nummer 166 okulär genterapi åldersrelaterad makuladegeneration oxidativ stressskada Törnrosa transposon icke-viral genleverans RPE-celler PEDF GM-CSF
Induktion och analys av oxidativ stress i <em>Törnrosa</em> Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelial Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter