Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering og udvidelse af humane kardiomyocytter fra patientens perifere blod mononukleare celler

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Her præsenterer vi en protokol til robust at generere og udvide menneskelige kardiomyocytter fra patientens perifere blodmonnukleare celler.

Abstract

Generering patient-specifikke kardiomyocytter fra en enkelt blodprøve har tiltrukket enorm interesse i præcision medicin på hjerte-kar-sygdom. Hjertedifferentiering fra human inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) moduleres ved definerede signalveje, der er afgørende for embryonal hjerteudvikling. Talrige hjertedifferentieringsmetoder på 2D- og 3D-platforme er blevet udviklet med forskellige effektivitetsgevinster og kardiomyocytudbytte. Dette har undret efterforskere uden for feltet, da de mange forskellige af disse metoder kan være vanskelige at følge. Her præsenterer vi en omfattende protokol, der uddyber robust generering og udvidelse af patientspecifikke kardiomyocytter fra perifere blodmonnukleare celler (PBMCs). Vi beskriver først en højeffektiv iPSC-omprogrammeringsprotokol fra en patients blodprøve ved hjælp af sendai-virusvektorer uden integration. Vi beskriver derefter en lille molekylemedieret monolayer differentieringsmetode, der robust kan producere slå kardiomyocytter fra de fleste menneskelige iPSC-linjer. Derudover introduceres en skalerbar kardiomyocyt ekspansionsprotokol ved hjælp af et lille molekyle (CHIR99021), der hurtigt kan udvide patientafledte kardiomyocytter til industrielle og kliniske applikationer. I slutningen er detaljerede protokoller for molekylær identifikation og elektrofysiologisk karakterisering af disse iPSC-CMs afbildet. Vi forventer, at denne protokol er pragmatisk for begyndere med begrænset viden om hjerte-kar-udvikling og stamcellebiologi.

Introduction

Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller har revolutioneret moderne hjerte-kar-medicin1,2. Humane iPSCs er i stand til selvfornyelse og generering af alle celletyper i hjertet, herunder kardiomyocytter, endotelceller, glatte muskelceller og hjertefibroblaster. Patient iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) kan tjene som ubestemte ressourcer til modellering genetisk arvelige hjerte-kar-sygdomme (CVD'er) og test af hjertesikkerhed for nye lægemidler3. Især er patient iPSC-CMs godt klar til at undersøge genetiske og molekylære ætiologier af CVD'er, der er afledt af defekter i kardiomyocytter, såsom lange QT syndrom4 og udvidet kardiomyopati (DCM)5. Kombineret med CRISPR/Cas9-medieret genomredigering har patient iPSC-CMs åbnet en hidtil uset vej til at forstå det komplekse genetiske grundlag for CVD'er, herunder medfødte hjertefejl (CHDs)6,7,8. Human iPSC-CMs har også udstillet potentialer til at tjene som autologe celle kilder til genopfyldning af den beskadigede myokardie under et hjerteanfald9. I de senere år er det blevet altafgørende at generere højkvalitets menneskelige iPSC-CMs med definerede undertyper (atrie, ventrikulær og nodal) til hjerteregenerering og lægemiddeltest10.

Hjertedifferentiering fra menneskelige iPSCs har været meget avanceret i det seneste årti. Differentieringsmetoderne er gået fra embryoidkroppen (EB)-baseret spontan differentiering til kemisk defineret og styret hjertedifferentiering11. Centrale signalmolekyler, der er afgørende for embryonal hjerteudvikling, såsom Wnt, BMP, Nodal og FGF, manipuleres for at forbedre kardiomyocytdifferentiering fra humane iPSCs10,12. Væsentlige fremskridt omfatter sekventiel graduering af Wnt-signalering (aktivering efterfulgt af hæmning) for robust generering af kardiomyocytter fra humane iPSC'er13,14. Kemisk definerede hjertedifferentiering opskrifter er blevet undersøgt for at lette storstilet produktion af slå kardiomyocytter15,16, som har potentiale til at blive opgraderet til industriel og klinisk niveau produktion. Desuden opnås en robust udvidelse af tidlige humane iPSC-CMs ved at blive udsat for konstituerende Wnt-aktivering ved hjælp af et lille kemikalie (CHIR99021)17. Senest genereres subtypespecifikke kardiomyocytter gennem manipulation af retinsyre (RA) og Wnt-signalveje ved specifikke differentieringsvinduer under kardiomyocyt-afstamningforpligtelse fra humane iPSCs18,19,20,21,22.

I denne protokol beskriver vi en fungerende procedure for robust generering og spredning af menneskelige DM'er, der stammer fra patientens perifere blodmonnukleare celler. Vi præsenterer protokoller for 1) omprogrammering af menneskelige PBMCs til iPSCs, 2) robust generation af slå kardiomyocytter fra menneskelige iPSCs, 3) hurtig udvidelse af tidlige iPSC-CMs, 4) molekylær karakterisering af menneskelige iPSC-CMs, og 5) elektrofysiologisk måling af humane iPSC-CMs på enkeltcellet niveau ved patch clamp. Denne protokol dækker de detaljerede eksperimentelle procedurer for konvertering af patientens blodlegemer til at slå kardiomyocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokoller og informeret samtykke til mennesker blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på Nationwide Children's Hospital.

1. Forberedelse af cellekulturmedier, løsninger og reagenser

  1. Forbered PBMC-medier
    1. Bland 20 mL basal PBMC kultur medier (1x) og 0,52 mL supplement. Der tilsættes hver 20 μL SCF og FLT3 (lagerkoncentration: 100 μg/mL), 4 μL IL3, IL6 og EPO (lagerkoncentration: 100 μg/mL) og 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Bland dem grundigt. Filtrer i en steril hætte ved hjælp af en 0,22-μm filterenhed. Nævn dette som Complete Blood Media.
    2. Bland 20 mL basal PBMC kultur medier (1x) og 0,52 mL af tillægget. Der tilsættes 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Bland dem grundigt. Filtrer ved hjælp af en 0,22-μm filterenhed. Navngiv dette som Supplement Blood Media.
  2. Forbered komplette E8-medier
    1. Bland 500 mL af E8 basal medier og 10 mL E8 supplement (optøet natten over ved 4 °C) for at gøre komplet E8 medier. Ekvilibrere til stuetemperatur (RT) før brug.
  3. Forberede iPSC-adgangsmedier
    1. Tilsæt 40 μL Y-27632 Rock-hæmmer (1:5.000 fortynding, lagerkoncentration: 10 mM) til 200 mL komplette E8-medier. Bland det grundigt. Ekvilibrere til RT før brug.
  4. Forbered kardiomyocyt differentiering medier
    1. Medie I: Bland 500 mL RPMI1640 med 10 mL B27 minus insulintilskud (50x).
    2. Medie II: Tilføj en passende mængde CHIR99021 (GSK3-hæmmer) lager til Media I (CHIR99021 endelig koncentration på 6 μM). Bland grundigt.
    3. Medie III: Tilsættes en passende mængde IWR-1 (Wnt-hæmmer) lager til Media I (IWR-1 endelig koncentration på 5 μM). Bland grundigt.
    4. Medie IV: Bland 500 mL RPMI1640 med 10 mL B27-tillæg (50x). Bland grundigt.
    5. Medie V: Bland 500 mL RPMI1640 (ingen glukose) med 10 mL B27 supplement (50x). Bland grundigt.
    6. Media VI: Tilføj en passende mængde CHIR99021-lager til Media IV (CHIR99021 endelig koncentration på 2 μM). Bland grundigt.
  5. Forberede iPSC-CM-adgangsmedier
    1. Tilføj 10 mL af Knockout Serum Replacement (KSR) til 90 mL af Media IV (KSR endelige koncentration: 10%). Bland godt.
  6. Forberede iPSC-CM-frysemedier
    1. Tilsæt 1 mL DMSO til 9 mL KSR (endelige koncentrationer: 10% DMSO/90% KSR) og bland godt.
  7. Forbered kældermembran matrix medium-coatede plader
    1. Optø kældermembranmatrixmediet ved 4 °C natten over og aliquot i 1,5 mL rør. Tilføj 1 mL af dette medium til 250 mL DMEM/F12 medier (1:250 fortynding) og bland dem grundigt. Påfør 2 mL af den fortyndede opløsning pr. brønd i en 6-brøndsplade og inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C i 30 min før brug.

2. omprogrammering af PBMCs iPSC

  1. Adskil PBPC'er fra blodprøver.
    1. Indsamle patientens blodprøver (~ 5 mL) og overføre til blodcelle separation rør (se tabellen af materialer). Bland ved at invertere 10x.
    2. Centrifuge ved 1.500 x g i 30 min ved stuetemperatur.
    3. Tag rørene forsigtigt ud og spray med 70% ethanol. Under en biosikkerhedshætte fjernes hætterne uden at forstyrre de mononukleare celler (buffy lag). PBMCs vil være i et hvidligt lag lige under plasmalaget (Figur 1A). Saml hele buffy lag ved hjælp af en 1000 μL pipette og overføre til en 15 mL konisk rør.
    4. Tæl cellenummeret ved hjælp af en automatiseret celletæller. Drej røret ved 300 x g i 25 min på RT.
    5. Kassér supernatanten. Vask med 10 mL DPBS (Ca2+/Mg2+ gratis).
    6. Drej røret ved 300 x g i 15 min på RT.
    7. Fjern supernatanten. Resuspend celle pellets i 1 mL af frysende medier (KSR plus 10% DMSO). Juster celletætheden til at lave 1 x 106 celler pr. hætteglas.
    8. Placer PBMC cryovials i en cellefrysning beholder og holde på -80 ° C natten over. Overfør til en flydende nitrogentank til langtidsopbevaring den næste dag.
  2. iPSC omprogrammering.
    1. Tilføj 3 mL supplement blod medier i en 15 mL konisk rør. Optø PBMCs i 37 °C vandbad og overfør dem til et konisk rør. Spin ved 300 x g i 7 min på RT.
    2. Kassér supernatanten. Resuspend PBMCs med Komplet Blood Media. Frø dem i to brønde af en 24 brøndvævskulturplader (ingen kældermembranmatrix).
    3. Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C natten over. Den næste dag forsigtigt fjerne halvdelen af de gamle medier (0,5 ml) og tilsæt 0,5 ml frisk Complete Blood Media.
    4. Skift medier hver anden dag ved at opdatere halvdelen af de gamle medier.
    5. Efter en uge, aggressivt vaske brønden med 1 mL af Supplement Blood Media og overføre celler til en 15 mL centrifuge rør.
    6. Tæl cellenummeret. Tag 2 x 105 celler og centrifuge ved 300 x g i 7 min.
    7. Kassér supernatanten. Resuspend celler med 300 μL af Complete Blood Media. Udfør transfection ved at tilføje passende volumen af Sendai virus omprogrammering vektorer i henhold til producentens anvisninger. Overfør dem til en brønd af en 24-brønds plade (ingen kældermembranmatrix). Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C natten over.
    8. Den næste dag spin på 300 x g i 7 min. Fjern supernatanten og genbrug i 2 mL complete blood media. Overfør til en brønd af en 6 brøndplade forbelagt med kældermembranmatrix. Dette er dag 1 (D1).
    9. Rør ikke pladen næste dag.
    10. Fjern 1 mL af de gamle medier på D3. Tilføj 1 mL supplement blod medier.
    11. Gentag trin 2.2.10 på D5.
    12. På D7 skal du fjerne 1 mL af de gamle medier. Tilføj 1 mL komplet E8 medier.
    13. Gentag trin 2.2.12 på D8.
    14. Fjern de gamle medier på D9. Tilføj 2 mL komplet E8-medier. Helt omprogrammerede celler forventes at vedhæfte og begynde at danne kolonier.
    15. Opdater med 2 mL komplette E8-medier hver dag.
    16. Omkring 2 uger efter Sendai virus transduktion, store iPSC kolonier vil blive vist og være klar til at plukke.
    17. Skær iPSC kolonier under et stereomikroskop i hætten og overføre individuelle kolonier til en kælder membran matrix-belagt 24-brønd plade forbelastet med 0,5 mL iPSC passaging medier.
    18. Opdater med 0,5 mL komplette E8-medier hver dag, indtil iPSC-kolonier vokser sig store nok til at passere ind i en ny kældermembranmatrixbelagt 6-brønds plade.

3. Menneskelig iPSC vedligeholdelse og passaging

  1. Når menneskelige iPSC'er når over 90% sammenløb, skal du fjerne gamle medier. Skyl med 3 mL DPBS én gang.
  2. Tilføj 1 mL 0,5 mM EDTA i DPBS-opløsning. Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C i 5-8 min.
  3. Fjern EDTA med aspiration. Tilføj 1 mL iPSC-adgangsmedier. Fjern iPSC'er manuelt.
  4. Tag 600-900 μL enkeltcelleaffjedring og omplade dem på en kældermembranmatrix-belagt 6-brøndsplade (fortynding: 1:6 til 1:10). Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C natten over.
  5. Opdater med 2 mL komplette E8-medier hver dag. IPSC kulturer normalt nå sammenløb efter 3-4 dage.

4. Kemisk defineret kardiomyocyt differentiering

  1. Kultur menneskelige iPSCs i komplette E8 medier indtil 95% sammenløb (3-4 dage).
  2. Fjern det gamle medie. Der tilsættes 2 mL CM differentiering Media II (6 μM CHIR i RPMI1640 plus B27 minus insulintilskud) til hver brønd på en 6-brønds plade. Det er D0. Rør ikke ved D1.
  3. På D2 skal du udskifte med 2 mL CM differentiering Media I (RPMI1640 plus B27 minus insulintilskud).
  4. På D3 skal du udskifte med 2 mL CM differentiering Media III (5 μM IWR-1 i RPMI1640 plus B27 minus insulintilskud). Rør ikke ved D4.
  5. På D5 skal du erstatte med 2 mL CM differentiering Media I.
  6. På D7, erstatte med 2 mL cm differentiering Media IV (RPMI1640 plus B27 supplement). Derefter skal du opdatere medierne hver anden dag.
  7. På D11, når der observeres kontraherende celler, skal du erstatte med 2 mL CM-differentiering Media V (ingen glukose).
  8. På D13 skal du erstatte med 2 mL CM differentiering Media V.
  9. På D15 skal du erstatte med 2 mL CM differentiering Media IV.
  10. På D17-D21, erstatte med 2 mL af CM differentiering Media IV hver anden dag.

5. Passage menneskelige iPSC-CMs

  1. Fjern gamle medier, og skyl cellerne med 3 ML DPBS én gang.
  2. Påfør 1 mL CM dissociation opløsning (se Tabel over materialer)til hver brønd af en 6-brønds plade. Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C i 5-8 min.
  3. Afsykning af iPSC-CMs mekanisk i enkelte celler ved kraftig pipettering.
  4. Overfør celler til et 15 mL konisk rør. Tilføj 2 mL CM passaging medier (10% KSR i RMPI1640 plus B27 supplement) for at neutralisere CM dissociation løsning.
  5. Spin ved 300 x g i 5 min på RT.
  6. Kassér supernatanten. Genbrugsceller med den ønskede mængde CM-adgangsmedier. Frø dem i en kælder membran matrix-belagt plade / fad. Humane iPSC-CMs genoptage slå 1-3 dage efter passaging.

6. Udvidelse af menneskelige iPSC-CMs

  1. Skyl D10-12 slå iPSC-CMs med 3 mL DPBS for hver brønd af en 6-brønd plade én gang. Der tilføjes 1 mL CM-dissociationsopløsning (trin 5.2). Inkuberes i 5% CO2 ved 37 °C i 7-10 min.
  2. Afsykning af iPSC-CMs mekanisk i enkelte celler ved kraftig pipettering.
  3. Overfør celler til et 15 mL konisk rør. Tilføj 2 mL CM-adgangsmedier for at neutralisere CM-dissociationsløsningen.
  4. Spin ved 300 x g i 5 min på RT.
  5. Kassér supernatanten. Genbrugsceller med en passende mængde CM-adgangsmedier. Pipette op og ned for at gøre enkelt celle suspension. Seed en million iPSC-CMs i en kælder membran matrix-belagt 10 cm fad.
  6. Den næste dag fjerne gamle medier. Tilsæt 10 mL af kardiomyocyt spredning medier (Media VI: 2 μM CHIR99021). Skift medier hver anden dag.
  7. Når iPSC-CMs bliver sammenflydende efter 7-9 dages kultur, gentages passaging-trinet for yderligere udvidelse af iPSC-CMs.

7. Immunofluorescence

  1. Før immunofluorescence farvning, frø iPSC-CMs på kælderen membran matrix-coated coverlips, der er placeret i en 24 brønd plade (såning tæthed: 0,5-1 x 106 celler / mL). Vedligehold iPSC-CMs i kulturen i mindst 4 dage.
  2. Vask celler med 1 mL DPBS én gang.
  3. Tilsæt 0,5 mL 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuberes i 15 min på RT.
  4. Vask celler ved hjælp af 1 mL DPBS. Gentag en gang.
  5. Tilsæt 0,5 mL på 0,1% Triton X-100 og inkuber i 20 min på RT.
  6. Vask med 1 mL DPBS to gange.
  7. Tilføj 0,5 mL 0,2% BSA i DPBS (blokeringsløsning). Inkuber på RT i 1 time.
  8. Der tilsættes 200 μL primær antistof fortyndet med blokerende opløsning (fortynding: 1:400-1:1000). Inkuberes ved 4 °C natten over.
  9. Vask celler med 0,5 mL blokeringsopløsning i 3 min med rystelser. Gentag to gange.
  10. Der tilsættes 200 μL sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsningen. Inkuber på RT i 1 time.
  11. Skyl cellerne tre gange med 0,5 mL DPBS, hver i 3 min med rystelser.
  12. Counterstain kerner med DAPI (1:2000 fortynding) og inkuberes i 5 min på RT.
  13. Skyl cellerne tre gange med 0,5 mL DPBS.
  14. Monter celler på omslagene på et mikroskopdias ved hjælp af 5 μl monteringsmedier. Opbevar ved 4 °C og beskyt mod lys.

8. Flowcytometriprøvepræparat

  1. Vask menneskelige iPSC-CMs med 3 mL DPBS én gang.
  2. Der tilsættes 1 mL CM-dissociationsopløsning og inkuberes i 5 % CO2 ved 37 °C i 7-10 min.
  3. Fjern celler ved hjælp af en 1.000-μL pipette. Overfør celleaffjedring til et rundt FACS-rør gennem en sihætte. FACS-røret er fyldt på forhånd med 1 mL iPSC-CM-passaging-medier (10% KSR) for at neutralisere enzymaktiviteten.
  4. Drej ved 300 x g i 5 min.
  5. Fjern supernatant uden at forstyrre cellepillen. Der tilsættes 250 μL fikserings-/permeabiliseringsopløsning (se Materialetabel). Inkuberes i 20 min ved 4 °C.
  6. Tilføj 1 minut perm/vaskebuffer. Vortex kort og spin ved 300 x g i 4 min.
  7. Kassér supernatanten. Der tilsættes 100 μL fortyndede primære antistoffer (1:200-1:500) i 1x Perm/Wash buffer. Vortex kortvarigt og inkuberes natten over ved 4 °C.
  8. Vask celler ved at tilføje 1 mL perm/vaskebuffer. Vortex kort og spin ved 300 x g i 4 min.
  9. Kassér supernatanten. Der tilsættes 100 μL fortyndede sekundære antistoffer (1:500-1:1.000). Vortex kort og inkubere på RT i 1 time. Beskyt mod lys, hvis sekundære antistoffer konjugeres med lysfølsom fluorescens.
  10. Vask celler ved at tilføje 1 mL perm/vaskebuffer. Vortex kort og spin på 300g i 4 min.
  11. Kassér supernatanten. Resuspend celler med 400 μL FACS farvning buffer (PBS/4% FBS). Opbevares ved 4 °C, indtil det lastes på et FACS-instrument.

9. QPCR i realtid

  1. Fjern gamle medier i menneskelig iPSC-CM-kultur. Tilsæt 500-700 μL lysis buffer til lysate celler. Inkuberes i 3 min ved RT. Scape cellelysate og overføres til et 1,5 ml RNase-frit rør. Fortsæt straks til total RNA-udvinding, eller opbevares ved -80 °C.
  2. Isoler total RNA ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt efter producentens anvisninger.
  3. Mål RNA-koncentrationen, og vurder kvaliteten af det samlede RNA med et spektrofotometer.
  4. Udfør omvendt transskription reaktion ved hjælp af en cDNA syntese kit. Den samlede mængde RT-reaktion er 20 μL inklusive 4 μL reaktionsmiks (5x), 1 μL omvendt transskriptase,1 μg af det samlede RNA- og RNasefrie vand.
  5. Inkuberes hele RT-reaktionsblandingen i en termisk cycler ved hjælp af følgende protokol: 25 °C i 5 min. 46 °C i 20 min. 95 °C i 1 min. hold ved 4 °C.
  6. Fortynd cDNA med 1:10 ved hjælp af nucleasefrit vand. Opsæt qPCR-reaktion i realtid ved blanding af 1 μL cDNA-skabelon, 1 μL primere/sonde, 10 μL qPCR master mix og 8 μL nucleasefrit vand.
  7. Kør i et PCR-system i realtid. Cykelprotokollen er 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 sek, 60 °C 1 min, gentag i 40 cyklusser.
  8. Saml CT-værdier for hvert gen i hver prøve. Relativ mRNA-overflod beregnes ved at trække CT-værdien af målgenet fra CT-værdien af et husholdningsgen. Relativ genekspression analyseres ved 2-ΔΔCT-metoden.

10. Fuldcellet plaster klemme optagelse

  1. Fjern iPSC-CMs fra enkelte celler ved hjælp af CM-dissociationsopløsning som tidligere beskrevet.
  2. Frøceller ved lav densitet på kældermembran matrix-coated coverlips. Kultur dem i 3-4 dage i Media IV.
  3. Træk pipetter (modstand 0,9-1,5 MΩ) fra borosilicate glas kapillærer ved hjælp af en vandret mikroelektrode trækker.
  4. Inkuber celler i Tyroders opløsning (pH=7,35).
  5. Fyld pipetter med elektrodeopløsning (pH=7,3) bestående af følgende kemikalier: 120 mM aspartsyre, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatin, 4 mM K-ATP og 2mM kreatinphokinase.
  6. Placer celler i den aktuelle klemmetilstand ved hjælp af en 1,5-2 diastolisk tærskel 5 ms strømimpuls ved 1 Hz.
  7. Optag action potentialer (APs) ved hjælp af en mikroelektrode forstærker og en software-drevet erhvervelse bord.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Human iPSC omprogrammering fra PBMCs
Efter prækultur med Complete Blood Media i 7 dage bliver PBMCs store med synlige kerner og cytoplasma (Figur 1B), hvilket indikerer, at de er klar til virustransfektion. Efter transfection med Sendai virus omprogrammering faktorer, PBMCs vil gennemgå en epigenetisk omprogrammering proces for en anden uge. Typisk får vi 30-50 iPSC kolonier fra transfection af 1 x 105 PBMCs og omprogrammering effektivitet er 0,03%-0,05%. Helt omprogrammerede celler vil vedhæfte og begynde at danne kolonier, når de introduceres til hele E8-mediet (Figur 1C). Disse tidlige iPSC kolonier er udvidet i yderligere 7 dage og derefter mekanisk skåret og afhentet individuelt. Hver iPSC koloni overføres til en brønd af en 6-brønd plade til at etablere individuelle iPSC linjer. Efter 4-5 passager bliver iPSC-kolonier rene med meget få differentierede celler omkring (Figur 1D). På dette stadium er de fleste celler i iPSC-kolonier OCT4 og NANOG-positive (Figur 1E), der viser deres pluripotency. Stabile iPSC linjer er etableret ved den femte passage.

Hjertedifferentiering
Hjertedifferentieringsprotokollen er afbildet i figur 1F. Hjertedifferentiering påbegyndes, når iPSCs opretholdes i mindst 10 passager. Graden af iPSC-sammenløb er kritisk, når CHIR99021 anvendes. Celletætheden er mere end 90% sammenflyttet, men ikke over sammenløbet. Hvis iPSC kolonier bliver for overfyldt, vil de starte spontan differentiering, som vil have en negativ indvirkning på den rettet kardiomyocyt differentiering effektivitet. Slå kardiomyocytter observeres normalt efter dag 12 af differentiering (Video 1). Den dato, hvor starten af prygl opstår, varierer og afhænger af de iPSC-linjer, der er i brug. Efter glukose sult og replating, iPSC-CMs viser spontane slå (Video 2) og justeret sarkom struktur med intercalated hjerte troponin T (TNNT2) og α-actinin (Figur 1G-H). Desuden er renheden af iPSC-CMs høj, idet mere end 93 % af cellerne er TNNT2+ som vist ved FACS-analyse (Figur 1I).

Selvom iPSC-CMs er relativt umodne sammenlignet med voksne kardiomyocytter, viser de ventrikulære og atrielignende handlingspotentialer målt ved helcellet plasterklemme (Figur 2A, B). I en typisk hjertedifferentiering er dag 30 iPSC-CMs en blanding af ventrikulære, atrie- og nodallignende undertyper, hvor ventrikulære CMs tegner sig for flertallet (60%, figur 2C) ved hjælp af ovennævnte differentieringsprotokol (Figur 1F). Forskellige differentieringsprotokoller giver varierende procentdele af kardiomyocytundertyper på grund af tydelig aktivering af signalveje under cellelinjebestemmelse10. Ventrikulære CMs er mærket med MYL2 (MLC2v, Figur 2D),mens atrie iPSC-CMs er markeret med NR2F2 (COUP-TFII, Figur 2E). Disse markører er stærkt udtrykt i mere modne iPSC-CMs (>D30) snarere end dem i det tidlige stadium.

Udvidelse af iPSC-CMs ved Wnt-aktivering
Hos pattedyr deler voksne kardiomyocytter ikke aktivt for selvfornyelse. Dette fænomen finder også sted for menneskelige iPSC-CMs. Når de er modnet ud over D30, er celledeling af iPSC-CMs en sjælden begivenhed, hvilket begrænser deres evne til klinisk- og industriel masseproduktion. For at efterligne udviklingsmiljøet under embryonal kardiomyocyt spredning, aktiverer vi Wnt-vejen ved CHIR99021 for at stimulere multiplikationen af tidlige iPSC-CMs. D12-14 iPSC-CMs (efter rensning af glukosemangel) er seedet ved en lav densitet i nærværelse af 2 μM CHIR99021. Wnt aktivering stimulerer celledeling af iPSC-CMs og fremmer ekspressionen af cellecyklusregulatorer som Cyclin D1 (Figur 3A), som kan skubbe cellecyklussen for at gå videre gennem G1-fasen. Interessant nok muliggør CHIR99021 en robust spredning af tidlige iPSC-CMs for 2 passager sammenlignet med kontrollerne (figur 3B). IPSC-CMs'ers spredningsevne mindskes imidlertid med omfattende passage (figur 3B), hvilket er i overensstemmelse med den begrænsede og velkontrollerede hjertespredning under embryonal hjerteudvikling. Desuden ser det ikke ud til, at CHIR99021 er i stand til at stimulere udvidelsen af mere modne iPSC-CMs, når de når over 30 dages differentiering og udvikler stabile sarkomstrukturer.

Figure 1
Figur 1: Human iPSC omprogrammering og kardiomyocyt differentiering. (A) Et skemadiagram, der viser PBMC-laget efter adskillelse af patientens blodprøver. (B) Udvidede PBMCs er klar til transfektion. (C) Tidlige menneskelige iPSC kolonier. (D) En etableret iPSC-linje ved passage 5. (E) Humane iPSC'er er positive for pluripotency markører OCT4 (grøn) og NANOG (rød). Kerner er counterstained af DAPI (blå). (F) Oversigt over en kardiomyocyt differentiering protokol. (G-H) Sarcomere struktur iPSC-CMs er afsløret ved immunofluorescence farvning ved hjælp af antistoffer mod TNNT2 (grøn) og α-actinin (rød). Kerner er counterstained af DAPI (blå). (I) FACS-analyse af iPSC-CMs ved hjælp af et antistof mod TNNT2. Vægtstænger: 200 μm (B-D), 50 μm (E og G) og 20 μm (H). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kardiomyocytundertyper i humane iPSC-CMs. (A-B) Repræsentative aktionspotentialevarigheder for ventrikulære(A)og atrielignende (B) iPSC-CMs. (C) Repræsentative procentdele af ventrikulære, atrie- og nodallignende undertyper i humane iPSC-CMs. (D-E) D30 iPSC-CMs er plettet med antistoffer mod ventrikulær kardiomyocyt markør MYL2 (D) og atrie markør NR2F2 (E). Celler farves samtidig med et TNNT2 antistof. Kerner er counterstained af DAPI (blå). Skalastænger: 50 μm (D-E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Udvidelse af menneskelige iPSC-CMs ved Wnt aktivering. (A) Procentdelen af cykliske D1 positive iPSC-CMs øges i nærværelse af CHIR99021. Cellerne er dobbeltfarvede med antistoffer mod TNNT2 (rød) og cyklisk D1 (grøn). Kerner er counterstained af DAPI (blå). (B) Celle antal gange ændringer under udvidelsen af menneskelige iPSC-CMs med eller uden CHIR99021 i de første 3 passager. Y-akse viser ændringer i celletallet. CHIR99021 stimulerer den robuste spredning af tidlige iPSC-CMs. Skalastænger: 50 μm (A). Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1. Slå menneskelige iPSC-CMs på dag 18 af differentiering. Klik her for at downloade denne video.

Video 2. Slå menneskelige iPSC-CMs på dag 25 efter metabolisk rensning. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under iPSC omprogrammering, er det afgørende for kultur PBMCs i 1 uge, indtil de er udvidet med klare kerner og cytoplasma. Da PBMCs ikke formerer sig, er et passende cellenummer til viral transduktion vigtigt for vellykket omprogrammering af iPSC. Celletal af PBMCs, mangfoldighed af infektion (MOI) og titer af virus bør overvejes og justeres for at nå de optimale transduktionsresultater. For hjertedifferentiering er den indledende såningstæthed afgørende for, at iPSCs når over 90% sammenløb den dag, hvor CHIR99021 administreres. På den ene side, hvis iPSCs er mindre sammenflyttede på tidspunktet for hjertedifferentiering, chir99021 vil være giftigt og føre til betydelig celledød. På den anden side, hvis iPSCs er over sammenflyttet, vil de gennemgå spontan differentiering, som vil kompromittere effektiviteten af rettet hjertedifferentiering. For at udvide tidlige iPSC-CMs bør der tages hensyn til timingen og kardiomyocytkvaliteten. Tidlige iPSC-CMs kan robust formere sig kun, når renheden af kardiomyocytter er høj nok. Eksisterende ikke-kardiomyocytter i kulturen kan også formere sig som reaktion på CHIR99021 behandling, hvilket vil påvirke spredningen af tidlige iPSC-CMs negativt. Derudover er det afgørende at stimulere kardiomyocyt ekspansion af dag 20 af differentiering. Når iPSC-CMs passerer over dag 30, vil det være svært for dem at genoptage robust opdeling.

Humane iPSC'er blev oprindeligt afledt af dermale og lungefibrobroblaster via retrovirusmedieret transfection1,2. Der er to store problemer med disse omprogrammeringsmetoder, der forhindrer fremskridt i klinisk oversættelse af patient-iPSC'er: 1) retrovirussen integreres i værtsgenomet og introducerer dermed potentielle genetiske mutationer; 2) patient-afledt fibroblaster kræver hudbiopsier, som mange patienter kan falde. I denne protokol beskriver vi en protokol, der bruger kommercielle ikke-integration Sendai virus23 og PBMCs til robust udlede patient iPSCs. Disse iPSC'er er fri for udefrakommende omprogrammeringsvektorer og kan opretholdes med selvfornyelse og pluripotency på ubestemt tid. Derudover indsamles patientens blodprøver let i kliniske laboratorier. Vores protokol er alsidig og kan bruges til masseproduktion af patient- og sygdomsspecifikke iPSCs til store depoter og kliniske oversættelser24.

Robust kardiomyocyt differentiering opnås ved sekventiel graduering af specifikke signalveje under hjertedifferentiering fra menneskelige iPSCs. De vigtigste veje, der er involveret i hjertespecifikation og spredning, omfatter Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF og retinosyre (RA) 10,12. Her præsenterer vi en effektiv hjertedifferentiering protokol ved sekventiel graduering af Wnt signalering af små kemikalier: først aktivering af CHIR99021 og derefter hæmning af IWR-113,14. Små kemikalier er stabile og giver konsekvent differentiering resultater i forhold til dem, der bruger vækstfaktorer. De fleste iPSC-CMs genereret af denne protokol er ventrikulære-lignende kardiomyocytter, blandet med atrie- og nodal-lignende celler. Præcisionsgenerering af subtypespecifikke kardiomyocytter opnås ved at finjustere senere differentieringstrin10,12. For eksempel giver tilsætning af RA umiddelbart efter IWR-1-behandling en høj procentdel af atrielignende kardiomyocytter, mens RA-hæmning fremmer generering af ventrikulære iPSC-CMs18,22. Wnt signalering aktivering på et senere tidspunkt af differentiering fremmer induktion af hjerte stamfader celler til nodal-lignende kardiomyocytter19,21, hvilket er lovende for dannelsen af patient-specifikke biologiske pacemaker celler.

Human iPSC-CMs er umodne og har begrænset spredning evne25. Under embryonale hjerte udvikling, modningen fortsætter, mens spredningen mindskes. Der er et smalt vindue, hvor iPSC-CMs kan stimuleres til robust spredning, hvilket afspejler embryonale kardiomyocyt ekspansion. Her bruger vi en Wnt aktivator CHIR99021 til at fremme udbredelsen af tidlige iPSC-CMs i en begrænset periode, hvilket er i overensstemmelse med en nylig rapport17. Det spekuleres i, at Wnt signalering vej påvirker kardiomyocyt spredning muligvis gennem krydstale med flere opstrøms veje såsom NOTCH og Hippo26,27. NOTCH signalering fremmer kardiomyocyt spredning mens Hippo vej begrænser hjertevækst og hjerte størrelse28,29,30. Det er stadig ukendt, hvordan samspillet mellem NOTCH og Hippo bestemmer downstream Wnt aktivitet og fine-melodier en passende grad af hjertespredning. Vores protokol har givet en interessant model for kardiomyocyt spredning til at studere sygdomsmekanismer af medfødte hjertefejl, der er forårsaget af hypoplasi af ventrikulære kardiomyocytter, såsom hypoplastisk venstre hjerte syndrom (HLHS) og lunge atresi med intakt ventrikulær septum (PA-IVS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Yderligere Ventures AVIF og SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) giver 1R01HL124245, 1R01HL132520 og R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao blev også støttet af start midler fra Abigail Wexner Research Institute på Nationwide Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Udviklingsbiologi Udgave 168 perifere blodmonnukleare celler PBBC'er menneskeskabte pluripotente stamceller iPSCs hjertedifferentiering iPSC omprogrammering kardiomyocyt ekspansion.
Generering og udvidelse af humane kardiomyocytter fra patientens perifere blod mononukleare celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter