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Developmental Biology

Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Abstract

La generazione di cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue ha attirato un enorme interesse per la medicina di precisione sulle malattie cardiovascolari. La differenziazione cardiaca dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) è modulata da percorsi di segnalazione definiti che sono essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale. Numerosi metodi di differenziazione cardiaca su piattaforme 2D e 3D sono stati sviluppati con varie efficienze e resa cardiomiocitaria. Ciò ha sconcertato gli investigatori al di fuori del campo in quanto la varietà di questi metodi può essere difficile da seguire. Qui presentiamo un protocollo completo che elabora una robusta generazione ed espansione di cardiomiociti specifici del paziente da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per prima cosa descriviamo un protocollo di riprogrammazione iPSC ad alta efficienza dal campione di sangue di un paziente utilizzando vettori di virus Sendai non integrati. Quindi descriviamo in dettaglio un piccolo metodo di differenziazione monostrato mediato da molecole che può produrre in modo robusto cardiomiociti battenti dalla maggior parte delle linee iPSC umane. Inoltre, viene introdotto un protocollo di espansione dei cardiomiociti scalabile utilizzando una piccola molecola (CHIR99021) che potrebbe espandere rapidamente i cardiomiociti derivati dal paziente per applicazioni di livello industriale e clinico. Alla fine, vengono illustrati protocolli dettagliati per l'identificazione molecolare e la caratterizzazione elettrofisiologica di questi iPSC-CM. Ci aspettiamo che questo protocollo sia pragmatico per i principianti con conoscenze limitate sullo sviluppo cardiovascolare e sulla biologia delle cellule staminali.

Introduction

La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo ha rivoluzionato la moderna medicina cardiovascolare1,2. Le iPSC umane sono in grado di auto-rinnovarsi e generare tutti i tipi di cellule nel cuore, compresi cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti cardiaci. I cardiomiociti derivati da iPSC del paziente (iPSC-CM) possono servire come risorse indefinite per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD) e testare la sicurezza cardiaca per i nuovi farmaci3. In particolare, i pazienti iPSC-CM sono ben pronti a studiare le eziologie genetiche e molecolari delle CVD derivate da difetti nei cardiomiociti, come la sindrome del QT lungo4 e la cardiomiopatia dilatativa (DCM)5. In combinazione con l'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9, i CM iPSC dei pazienti hanno aperto una strada senza precedenti per comprendere le complesse basi genetiche delle CVD, compresi i difetti cardiaci congeniti (CHD)6,7,8. Gli iPSC-CM umani hanno anche mostrato potenziali per servire come fonti cellulari autologhe per reintegrare il miocardio danneggiato durante un infarto9. Negli ultimi anni, è diventato fondamentale generare iPSC-CM umani di alta qualità con sottotipi definiti (atriale, ventricolare e nodale) per la rigenerazione cardiaca e test antidroga10.

La differenziazione cardiaca dalle iPSC umane è stata notevolmente avanzata negli ultimi dieci anni. I metodi di differenziazione sono passati dalla differenziazione spontanea basata sul corpo embrioide (EB) alla differenziazione cardiaca chimicamente definita e diretta11. Le molecole di segnalazione chiave essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale, come Wnt, BMP, Nodal e FGF sono manipolate per migliorare la differenziazione dei cardiomiociti dalle iPSC umane10,12. Progressi significativi includono la modulazione sequenziale della segnalazione Wnt (attivazione seguita da inibizione) per una robusta generazione di cardiomiociti da iPSC umane13,14. Sono state esplorate ricette di differenziazione cardiaca chimicamente definite per facilitare la produzione su larga scala di cardiomiociti battenti15,16, che hanno il potenziale per essere aggiornati alla produzione a livello industriale e clinico. Inoltre, una robusta espansione delle iPSC-CM umane precoci si ottiene mediante l'esposizione all'attivazione costitutiva di Wnt utilizzando una piccola sostanza chimica (CHIR99021)17. Più recentemente, i cardiomiociti specifici del sottotipo sono generati attraverso la manipolazione delle vie di segnalazione dell'acido retinoico (RA) e Wnt in specifiche finestre di differenziazione durante l'impegno del lignaggio dei cardiomiociti dalle iPSC umane18,19,20,21,22.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio una procedura di lavoro per la generazione e la proliferazione robuste di CM umane provenienti da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente. Presentiamo protocolli per 1) riprogrammazione di PBMC umani in iPSC, 2) robusta generazione di cardiomiociti battenti da iPSC umane, 3) rapida espansione dei primi iPSC-CM, 4) caratterizzazione molecolare di iPSC-CM umani e 5) misurazione elettrofisiologica di iPSC-CM umani a livello di singola cellula mediante patch clamp. Questo protocollo copre le procedure sperimentali dettagliate sulla conversione delle cellule del sangue del paziente in cardiomiociti pulsanti.

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Protocol

I protocolli sperimentali e il consenso informato per i soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Nationwide Children's Hospital.

1. Preparazione di terreni di coltura cellulare, soluzioni e reagenti

  1. Preparare i supporti PBMC
    1. Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL di integratore. Aggiungere 20 μL di SCF e FLT3 ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL), 4 μL di IL3, IL6 ed EPO ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL) e 200 μL di alternativa L-glutammina (100x). Mescolarli accuratamente. Filtrare in una cappa sterile utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm. Denominatelo Complete Blood Media.
    2. Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL del supplemento. Aggiungere 200 μL di alternativa L-glutammina (100x). Mescolarli accuratamente. Filtrare utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm. Chiamalo come Supplemento Blood Media.
  2. Preparare un supporto E8 completo
    1. Mescolare 500 mL di mezzi basali E8 e 10 mL di integratore E8 (scongelati durante la notte a 4 °C) per ottenere un mezzo E8 completo. Equilibrare a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
  3. Preparare i supporti di passaging iPSC
    1. Aggiungere 40 μL di inibitore della roccia Y-27632 (diluizione 1:5.000, concentrazione di stock: 10 mM) a 200 mL di fluido E8 completo. Mescolare accuratamente. Equilibrate a RT prima dell'uso.
  4. Preparare i mezzi di differenziazione dei cardiomiociti
    1. Media I: Mescolare 500 mL di RPMI1640 con 10 mL di B27 meno integratore di insulina (50x).
    2. Media II: Aggiungere un volume appropriato di chir99021 (inibitore GSK3) a Media I (concentrazione finale CHIR99021 di 6 μM). Mescolare accuratamente.
    3. Media III: Aggiungere un volume appropriato di stock IWR-1 (inibitore Wnt) a Media I (concentrazione finale IWR-1 di 5 μM). Mescolare accuratamente.
    4. Media IV: Mescolare 500 mL di RPMI1640 con 10 mL di supplemento B27 (50x). Mescolare accuratamente.
    5. Media V: Miscelare 500 mL di RPMI1640 (senza glucosio) con 10 mL di integratore B27 (50x). Mescolare accuratamente.
    6. Media VI: Aggiungere un volume appropriato di stock CHIR99021 a Media IV (concentrazione finale CHIR99021 di 2 μM). Mescolare accuratamente.
  5. Preparare i supporti di passaging iPSC-CM
    1. Aggiungere 10 ml di Knockout Serum Replacement (KSR) a 90 mL di Media IV (concentrazione finale KSR: 10%). Mescolare bene.
  6. Preparare i supporti di congelamento iPSC-CM
    1. Aggiungere 1 mL di DMSO a 9 mL di KSR (concentrazioni finali: 10% DMSO/90% KSR) e mescolare bene.
  7. Preparare piastre a matrice di membrana basale a rivestimento medio
    1. Mezzo a matrice di membrana basale di disgelo a 4 °C durante la notte e aliquota in tubi da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di questo mezzo a 250 mL di supporto DMEM/F12 (diluizione 1:250) e mescolarli accuratamente. Applicare 2 mL della soluzione diluita per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e incubare in 5% CO2 a 37 °C per 30 minuti prima dell'uso.

2. Riprogrammazione iPSC dei PBMC

  1. Separare i PBMC dai campioni di sangue.
    1. Raccogliere campioni di sangue del paziente (~ 5 ml) e trasferirli in tubi di separazione delle cellule del sangue (vedere Tabella dei materiali). Mescolare invertendo 10x.
    2. Centrifugare a 1.500 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
    3. Estrarre i tubi con cura e spruzzare con etanolo al 70%. Sotto un cappuccio di biosicurezza, rimuovere i tappi senza disturbare le cellule mononucleate (strato di buffy). I PBMC saranno in uno strato biancastro appena sotto lo strato di plasma (Figura 1A). Raccogliere l'intero strato di buffy utilizzando una pipetta da 1000 μL e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL.
    4. Contare il numero di cella utilizzando un contatore di celle automatizzato. Ruotare il tubo a 300 x g per 25 minuti a RT.
    5. Scartare il surnatante. Lavare con 10 ml di DPBS (Ca2+/Mg2+ gratis).
    6. Ruotare il tubo a 300 x g per 15 minuti a RT.
    7. Rimuovere il surnatante. Sostituire i pellet di cellule in 1 mL del mezzo di congelamento (KSR più 10% DMSO). Regolare la densità cellulare per fare 1 x 106 celle per flaconcino.
    8. Posizionare i crioviali PBMC in un contenitore di congelamento cellulare e conservare a -80 °C durante la notte. Trasferire in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine il giorno successivo.
  2. Riprogrammazione iPSC.
    1. Aggiungere 3 mL di Supplement Blood Media in un tubo conico da 15 mL. Scongelare i PBMC a bagnomaria a 37 °C e trasferirli in un tubo conico. Girare a 300 x g per 7 minuti a RT.
    2. Scartare il surnatante. Sospendere i PBMC con fluidi sanguigni completi. Seminali in due pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi (nessuna matrice di membrana basale).
    3. Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte. Il giorno successivo rimuovere delicatamente metà del vecchio supporto (0,5 ml) e aggiungere 0,5 ml di Terriccio Completo fresco.
    4. Cambia media a giorni alterni rinfrescando metà dei vecchi media.
    5. Dopo una settimana, lavare aggressivamente il pozzo con 1 mL di Supplement Blood Media e trasferire le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml.
    6. Contare il numero di cella. Prendere 2 x 105 celle e centrifugare a 300 x g per 7 min.
    7. Scartare il surnatante. Cellule risospese con 300 μL di Complete Blood Media. Eseguire la trasfezione aggiungendo il volume appropriato di vettori di riprogrammazione del virus Sendai secondo le istruzioni del produttore. Trasferirli in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (nessuna matrice di membrana basale). Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte.
    8. Il giorno successivo gira a 300 x g per 7 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 2 ml di Complete Blood Media. Trasferire in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti pre-rivestita con matrice di membrana basale. Questo è il giorno 1 (D1).
    9. Non toccare il piatto il giorno successivo.
    10. Su D3, rimuovere 1 mL del vecchio supporto. Aggiungere 1 ml di supplemento blood media.
    11. Ripetere il passaggio 2.2.10 su D5.
    12. Su D7, rimuovere 1 mL del vecchio supporto. Aggiungere 1 mL di supporto E8 completo.
    13. Su D8, ripetere il passaggio 2.2.12.
    14. Su D9, rimuovere il vecchio supporto. Aggiungere 2 ml di supporti E8 completi. Ci si aspetta che le cellule completamente riprogrammate si attacchino e inizino a formare colonie.
    15. Aggiorna con 2 ml di supporti E8 completi ogni giorno.
    16. Circa 2 settimane dopo la trasduzione del virus Sendai, appariranno grandi colonie di iPSC e saranno pronte per la raccolta.
    17. Tagliare le colonie di iPSC sotto uno stereomicroscopio nel cofano e trasferire le singole colonie in una piastra a 24 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale precaricata con 0,5 mL di mezzi di passaggio iPSC.
    18. Aggiorna con 0,5 mL di supporti E8 completi ogni giorno fino a quando le colonie di iPSC diventano abbastanza grandi da passare in una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale.

3. Manutenzione e passaging iPSC umano

  1. Quando le iPSC umane raggiungono oltre il 90% di confluenza, rimuovere i vecchi supporti. Risciacquare con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA nella soluzione DPBS. Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 5-8 min.
  3. Rimuovere EDTA per aspirazione. Aggiungere 1 mL di supporti di passaging iPSC. Rimuovere manualmente gli iPSC.
  4. Prendere 600-900 μL di sospensione monocellulare e ri-placcarli su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale (diluizione: da 1:6 a 1:10). Incubare in 5% CO2 a 37 °C durante la notte.
  5. Aggiorna con 2 ml di supporti E8 completi ogni giorno. Le colture iPSC di solito raggiungono la confluenza dopo 3-4 giorni.

4. Differenziazione dei cardiomiociti chimicamente definita

  1. Coltura di iPSC umane in mezzi E8 completi fino al 95% confluenti (3-4 giorni).
  2. Rimuovere il vecchio supporto. Aggiungere 2 ml di CM differentiation Media II (6 μM CHIR in RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina) a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Questo è D0. Non toccare D1.
  3. Su D2, sostituire con 2 mL di CM differenziazione Media I (RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina).
  4. Su D3, sostituire con 2 mL di CM differentiation Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 più B27 meno integratore di insulina). Non toccare D4.
  5. Su D5, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media I.
  6. Su D7, sostituire con 2 ml di cm di differenziazione Media IV (RPMI1640 più supplemento B27). Successivamente, aggiorna i media a giorni alterni.
  7. Su D11 quando si osservano cellule contraenti, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media V (senza glucosio).
  8. Su D13, sostituire con 2 mL di cm di differenziazione Media V.
  9. Su D15, sostituire con 2 ml di CM differenziazione Media IV.
  10. Su D17-D21, sostituire con 2 ml di differenziazione CM Media IV a giorni alterni.

5. Passaggio iPSC-CM umani

  1. Rimuovere i vecchi supporti e risciacquare le celle con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Applicare 1 mL di soluzione di dissociazione CM (vedere Tabella dei materiali)su ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 5-8 min.
  3. Dissociare meccanicamente gli iPSC-CM in singole cellule mediante pipettaggio vigoroso.
  4. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 2 ml di mezzi di passaggio CM (10% KSR in RMPI1640 più supplemento B27) per neutralizzare la soluzione di dissociazione CM.
  5. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  6. Scartare il surnatante. Risospese le cellule con un volume desiderato di mezzi di passaggio CM. Seminali in un piatto / piatto rivestito di matrice della membrana basale. Gli iPSC-CM umani riprendono a battere 1-3 giorni dopo il passaggio.

6. Espansione di iPSC-CM umani

  1. Risciacquare D10-12 battendo iPSC-CM con 3 ml di DPBS per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti una volta. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione CM (Fase 5.2). Incubare in 5% CO2 a 37 °C per 7-10 min.
  2. Dissociare meccanicamente gli iPSC-CM in singole cellule mediante pipettaggio vigoroso.
  3. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 2 ml di mezzi di passaggio CM per neutralizzare la soluzione di dissociazione CM.
  4. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  5. Scartare il surnatante. Risospese le cellule con un volume appropriato di mezzi di passaggio CM. Pipetta su e giù per fare sospensione a cella singola. Semina un milione di iPSC-CM in un piatto di 10 cm rivestito di matrice a membrana basale.
  6. Il giorno dopo rimuovi i vecchi media. Aggiungere 10 mL di mezzi di proliferazione cardiomiocitaria (Media VI: 2 μM CHIR99021). Cambia i media a giorni alterni.
  7. Quando gli iPSC-CM diventano confluenti dopo 7-9 giorni di coltura, ripetere il passaggio per un'ulteriore espansione degli iPSC-CM.

7. Immunofluorescenza

  1. Prima della colorazione dell'immunofluorescenza, seminare iPSC-CM su coperture rivestite di matrice della membrana basale che vengono poste in una piastra a 24 pozzetti (densità di semina: 0,5-1 x10 6 cellule / mL). Mantenere iPSC-CM in coltura per almeno 4 giorni.
  2. Lavare le celle utilizzando 1 mL di DPBS una volta.
  3. Aggiungere 0,5 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per 15 minuti a RT.
  4. Lavare le celle utilizzando 1 mL di DPBS. Ripeti una volta.
  5. Aggiungere 0,5 ml di 0,1% Triton X-100 e incubare per 20 minuti a RT.
  6. Lavare con 1 mL di DPBS due volte.
  7. Aggiungere 0,5 ml di BSA allo 0,2% in DPBS (soluzione di blocco). Incubare a RT per 1 ora.
  8. Aggiungere 200 μL di anticorpo primario diluito con soluzione bloccante (diluizione: 1:400-1:1000). Incubare a 4 °C durante la notte.
  9. Lavare le celle utilizzando 0,5 ml di soluzione bloccante per 3 minuti con agitazione. Ripeti due volte.
  10. Aggiungere 200 μL di anticorpo secondario diluito nella soluzione bloccante. Incubare a RT per 1 ora.
  11. Risciacquare le cellule tre volte con 0,5 ml di DPBS, ciascuna per 3 minuti con agitazione.
  12. Nuclei di controstain con DAPI (diluizione 1:2000) e incubare per 5 min a RT.
  13. Risciacquare le cellule tre volte con 0,5 ml di DPBS.
  14. Montare le celle sui coperchi su un vetrino per microscopio utilizzando 5 μl di supporto di montaggio. Conservare a 4 °C e proteggere dalla luce.

8. Preparazione del campione di citometria a flusso

  1. Lavare i CM iPSC umani con 3 ml di DPBS una volta.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione CM e incubare in CO2 al 5% a 37 °C per 7-10 min.
  3. Rimuovere le celle utilizzando una pipetta da 1.000 μL. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo FACS rotondo attraverso un cappuccio del filtro. Il tubo FACS è pre-riempito con 1 mL di mezzo passante iPSC-CM (10% KSR) per neutralizzare l'attività enzimatica.
  4. Girare a 300 x g per 5 min.
  5. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 250 μL di soluzione di fissazione/permeabilizzazione (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 20 minuti a 4 °C.
  6. Aggiungere 1 mL di tampone Permanente/Lavaggio. Vortice brevemente e ruota a 300 x g per 4 min.
  7. Scartare il surnatante. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari diluiti (1:200-1:500) in 1x tampone Perm/Wash. Vortice brevemente e incubare durante la notte a 4 °C.
  8. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone Perm/Wash. Vortice brevemente e ruota a 300 x g per 4 min.
  9. Scartare il surnatante. Aggiungere 100 μL di anticorpi secondari diluiti (1:500-1:1.000). Vortice brevemente e incubare a RT per 1 ora. Proteggere dalla luce se gli anticorpi secondari sono coniugati con fluorescenza sensibile alla luce.
  10. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone permanente/lavaggio. Vortice brevemente e girare a 300g per 4 min.
  11. Scartare il surnatante. Celle risospese con 400 μL di tampone colorante FACS (PBS/4% FBS). Conservare a 4 °C fino al caricamento su uno strumento FACS.

9. QPCR in tempo reale

  1. Rimuovere i vecchi media nella cultura umana iPSC-CM. Aggiungere 500-700 μL di tampone di lisi alle cellule lisate. Incubare per 3 minuti a RT. Scape cell lysate e trasferire in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml. Procedere immediatamente all'estrazione totale dell'RNA o conservare a -80 °C.
  2. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Misurare la concentrazione di RNA e valutare la qualità dell'RNA totale con uno spettrofotometro.
  4. Eseguire la reazione di trascrizione inversa utilizzando un kit di sintesi del cDNA. Il volume totale della reazione RT è di 20 μL di cui 4 μL di miscela di reazione (5x), 1 μL di trascrittasi inversa, 1 μg di RNA totale e acqua priva di RNasi.
  5. Incubare la miscela di reazione RT completa in un termociclatore utilizzando il seguente protocollo: 25 °C per 5 min; 46 °C per 20 min; 95 °C per 1 min; tenere a 4 °C.
  6. Diluire il cDNA entro 1:10 usando acqua priva di nucleasi. Impostare la reazione qPCR in tempo reale mescolando 1 μL di modello di cDNA, 1 μL di primer/sonda, 10 μL di miscela master qPCR e 8 μL di acqua priva di nucleasi.
  7. Esegui in un sistema PCR in tempo reale. Il protocollo di ciclo è 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, ripetere per 40 cicli.
  8. Raccogliere i valoriC T per ciascun gene in ciascun campione. L'abbondanza relativa di mRNA viene calcolata sottraendo il valore CT del gene bersaglio dal valore CT di un gene di pulizia. L'espressione genica relativa viene analizzata con il metodo2 -ΔΔCT.

10. Registrazione del morsetto patch a cella intera

  1. Dissociare iPM-CM in singole celle utilizzando la soluzione di dissociazione CM come descritto in precedenza.
  2. Cellule di semi a bassa densità su coperture rivestite con matrice di membrana basale. Coltivali per 3-4 giorni in Media IV.
  3. Tirare pipette (resistenza 0,9-1,5 MΩ) da capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di microelettrodi orizzontale.
  4. Incubare le cellule nella soluzione di Tyrode (pH=7,35).
  5. Riempire le pipette con una soluzione di elettrodi (pH=7,3) composta dalle seguenti sostanze chimiche: 120 mM di acido aspartico, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatina, 4 mM K-ATP e 2mM creatina fosfochinasi.
  6. Posizionare le celle nella modalità di bloccaggio corrente utilizzando un impulso di corrente di 1,5-2 diastolico di 5 ms a 1 Hz.
  7. Registra i potenziali d'azione (AP) utilizzando un amplificatore a microelettrodo e una scheda di acquisizione basata su software.

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Representative Results

Riprogrammazione iPSC umana da PBMC
Dopo la pre-coltura con Complete Blood Media per 7 giorni, le PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma (Figura 1B), indicando che sono pronte per la trasfezione del virus. Dopo la trasfezione con i fattori di riprogrammazione del virus Sendai, i PBMC saranno sottoposti a un processo di riprogrammazione epigenetica per un'altra settimana. In genere, otteniamo 30-50 colonie di iPSC dalla trasfezione di 1 x 105 PBMC e l'efficienza di riprogrammazione è dello 0,03% -0,05%. Le cellule completamente riprogrammate si attaccheranno e inizieranno a formare colonie quando verranno introdotte nel mezzo E8 completo (Figura 1C). Queste prime colonie di iPSC vengono espanse per altri 7 giorni e poi tagliate meccanicamente e raccolte individualmente. Ogni colonia di iPSC viene trasferita in un pozzo di una piastra a 6 pozzetti per stabilire singole linee iPSC. Dopo 4-5 passaggi, le colonie di iPSC diventeranno pure con pochissime cellule differenziate intorno (Figura 1D). In questa fase, la maggior parte delle cellule nelle colonie di iPSC sono OCT4 e NANOG positive (Figura 1E), dimostrando la loro pluripotenza. Le linee iPSC stabili sono stabilite dal quinto passaggio.

Differenziazione cardiaca
Il protocollo di differenziazione cardiaca è illustrato nella Figura 1F. La differenziazione cardiaca viene avviata quando le iPSC vengono mantenute per almeno 10 passaggi. Il grado di confluenza iPSC è fondamentale quando si applica CHIR99021. La densità cellulare è superiore al 90% confluente ma non troppo confluente. Se le colonie di iPSC diventano troppo affollate, inizieranno la differenziazione spontanea che influenzerà negativamente l'efficienza di differenziazione dei cardiomiociti diretta. I cardiomiociti battenti sono di solito osservati dopo il giorno 12 di differenziazione (Video 1). La data in cui si verifica l'inizio della battitura varia e dipende dalle linee iPSC in uso. Dopo la fame di glucosio e la ripasistemazione, le impcpctine mostrano battiti spontanei (Video 2) e struttura sarcomerica allineata con troponina cardiaca intercalata T (TNNT2) e α-actinina (Figura 1G-H). Inoltre, la purezza delle iPSC-CM è elevata, con oltre il 93% delle cellule TNNT2+ come mostrato dall'analisi FACS (Figura 1I).

Sebbene gli iPSC-CM siano relativamente immaturi rispetto ai cardiomiociti adulti, mostrano potenziali d'azione ventricolari e atriali misurati dal morsetto patch a cellule intere (Figura 2A,B). In una tipica differenziazione cardiaca, iPM iPSC-giorno 30 sono una miscela di sottotipi ventricolari, atriali e nodali, con CM ventricolari che rappresentano la maggioranza (60%, Figura 2C)utilizzando il protocollo di differenziazione sopra menzionato (Figura 1F). Diversi protocolli di differenziazione producono percentuali variabili di sottotipi di cardiomiociti a causa dell'attivazione di distinte vie di segnalazione durante la determinazione del lignaggio cellulare10. I CM ventricolari sono marcati con MYL2 (MLC2v, Figura 2D)mentre gli iPSC-CM atriali sono contrassegnati da NR2F2 (COUP-TFII, Figura 2E). Questi marcatori sono altamente espressi in iPSC-CM più maturi (>D30) piuttosto che in quelli in fase iniziale.

Espansione di iPSC-CM mediante attivazione Wnt
Nei mammiferi, i cardiomiociti adulti non si dividono attivamente per l'auto-rinnovamento. Questo fenomeno si verifica anche per gli iPSC-CM umani. Una volta maturata oltre il D30, la divisione cellulare delle iPSC-CM è un evento raro, limitando così la loro capacità di produzione di massa a livello clinico e industriale. Per imitare l'ambiente di sviluppo durante la proliferazione embrionale dei cardiomiociti, attiviamo la via Wnt di CHIR99021 per stimolare la moltiplicazione delle prime iPSC-CM. D12-14 iPSC-CM (dopo purificazione mediante privazione di glucosio) vengono seminati a bassa densità in presenza di 2 μM CHIR99021. L'attivazione di Wnt stimola la divisione cellulare di iPSC-CM e promuove l'espressione di regolatori del ciclo cellulare come la ciclina D1(Figura 3A)che possono spingere il ciclo cellulare ad avanzare attraverso la fase G1. È interessante notare che CHIR99021 consente una robusta proliferazione dei primi iPSC-CM per 2 passaggi rispetto ai controlli (Figura 3B). Tuttavia, la capacità di proliferazione delle iPSC-CM diminuisce con un ampio passaggio (Figura 3B), che è coerente con la proliferazione cardiaca limitata e ben controllata durante lo sviluppo del cuore embrionale. Inoltre, non sembra che CHIR99021 sia in grado di stimolare l'espansione di iPSC-CM più maturi quando raggiungono oltre 30 giorni di differenziazione e sviluppano strutture sarcomere stabili.

Figure 1
Figura 1: Riprogrammazione dell'iPSC umano e differenziazione dei cardiomiociti. (A) Un diagramma schematico che mostra lo strato PBMC dopo la separazione dei campioni di sangue del paziente. (B) I PBMC allargati sono pronti per la trasfezione. (C) Prime colonie umane di iPSC. (D) Una linea iPSC stabilita al passaggio 5. (E) Le iPSC umane sono positive per i marcatori di pluripotenza OCT4 (verde) e NANOG (rosso). I nuclei sono controcolorati dal DAPI (blu). (F) Panoramica di un protocollo di differenziazione dei cardiomiociti. (G-H) La struttura del sarcomero delle iPSC-CM è rivelata dalla colorazione di immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro TNNT2 (verde) e α-actinina (rosso). I nuclei sono controcolorati dal DAPI (blu). (I) Analisi FACS di iPSC-CM utilizzando un anticorpo contro TNNT2. Barre di scala: 200 μm (B-D), 50 μm (E e G) e 20 μm (H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sottotipi di cardiomiociti nelle iPSC-CM umane. (A-B) Durata del potenziale d'azione rappresentativo per iPSC-CM ventricolari(A)e atriali(B). (C) Percentuali rappresentative di sottotipi ventricolari, atriali e nodali in iPSC-CM umani. (D-E) Le IPSC-CM D30 sono colorate con anticorpi contro il marcatore di cardiomiociti ventricolari MYL2 (D) e il marcatore atriale NR2F2 (E). Le cellule sono contemporaneamente macchiate con un anticorpo TNNT2. I nuclei sono controcolorati dal DAPI (blu). Barre di scala: 50 μm (D-E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Espansione delle iPSC-CM umane mediante attivazione di Wnt. (A) La percentuale di iPSC-CM positivi alla ciclina D1 è aumentata in presenza di CHIR99021. Le cellule sono doppiamente colorate con anticorpi contro TNNT2 (rosso) e Ciclina D1 (verde). I nuclei sono controcolorati dal DAPI (blu). (B) Il numero di cellule cambia durante l'espansione di iPSC-CM umani con o senza CHIR99021 nei primi 3 passaggi. L'asse Y mostra le variazioni di piega del numero di cella. CHIR99021 stimola la robusta proliferazione dei primi iPSC-CM. Barre di scala: 50 μm (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1. Battere iPM-CM umani al giorno 18 della differenziazione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2. Battere gli iPSC-CM umani al giorno 25 dopo la purificazione metabolica. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Durante la riprogrammazione iPSC, è fondamentale coltivare PBMC per 1 settimana fino a quando non vengono ingranditi con nuclei chiari e citoplasma. Poiché i PBMC non proliferano, un numero di cellule appropriato per la trasduzione virale è importante per una riprogrammazione iPSC di successo. Il numero di cellule pbMC, la molteplicità dell'infezione (MOI) e il titolo del virus devono essere considerati e regolati per raggiungere i risultati di trasduzione ottimali. Per la differenziazione cardiaca, la densità iniziale di semina è fondamentale affinché le iPSC raggiungano oltre il 90% di confluente il giorno in cui viene somministrato CHIR99021. Da un lato, se le iPSC sono meno confluenti al momento della differenziazione cardiaca, CHIR99021 sarà tossico e porterà a una sostanziale morte cellulare. D'altra parte, se le iPSC sono troppo confluenti, subiranno una differenziazione spontanea che comprometterà l'efficienza della differenziazione cardiaca diretta. Per l'espansione delle iPSC-CM precoci, devono essere presi in considerazione i tempi e la qualità dei cardiomiociti. I primi iPSC-CM possono moltiplicarsi in modo robusto solo quando la purezza dei cardiomiociti è abbastanza alta. I non cardiomiociti esistenti nella coltura possono anche proliferare in risposta al trattamento con CHIR99021, che influenzerà negativamente la proliferazione delle iPSC-CM precoci. Inoltre, è fondamentale stimolare l'espansione dei cardiomiociti entro il giorno 20 di differenziazione. Una volta che gli iPSC-CM superano il giorno 30, sarà difficile per loro riprendere una divisione robusta.

Le iPSC umane sono state inizialmente derivate da fibroblasti dermici e polmonari tramite trasfezione mediata da retrovirus1,2. Ci sono due problemi principali con questi metodi di riprogrammazione che impediscono il progresso nella traduzione clinica delle iPSC dei pazienti: 1) il retrovirus si integra nel genoma dell'ospite introducendo così potenziali mutazioni genetiche; 2) i fibroblasti derivati dal paziente richiedono biopsie cutanee che molti pazienti possono declinare. In questo protocollo, descriviamo un protocollo che utilizza il virus Sendai23 e PBMC commerciali non di integrazione per derivare in modo robusto le iPSC dei pazienti. Queste iPSC sono prive di vettori di riprogrammazione esogena e possono essere mantenute con auto-rinnovamento e pluripotenza a tempo indeterminato. Inoltre, i campioni di sangue dei pazienti vengono facilmente raccolti nei laboratori clinici. Il nostro protocollo è versatile e può essere utilizzato per la produzione di massa di iPSC specifiche per pazienti e malattie per repository su larga scala e traduzioni cliniche24.

Una robusta differenziazione dei cardiomiociti si ottiene mediante la modulazione sequenziale di specifiche vie di segnalazione durante la differenziazione cardiaca dalle iPSC umane. Le vie chiave coinvolte nella specificazione e proliferazione cardiaca includono Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF e acido retinoico (RA) 10,12. Qui presentiamo un efficiente protocollo di differenziazione cardiaca mediante modulazione sequenziale della segnalazione Wnt da parte di piccole sostanze chimiche: prima attivazione da chiR99021 e poi inibizione da parte diIWR-1 13,14. Le piccole sostanze chimiche sono stabili e danno risultati di differenziazione coerenti rispetto a quelli che utilizzano fattori di crescita. La maggior parte delle iPSC-CM generate da questo protocollo sono cardiomiociti ventricolari, mescolati con cellule atriali e nodali. La generazione di precisione dei cardiomiociti specifici del sottotipo si ottiene attraverso la messa a punto delle fasi successive di differenziazione10,12. Ad esempio, l'aggiunta di RA immediatamente dopo il trattamento con IWR-1 produce un'alta percentuale di cardiomiociti atriali, mentre l'inibizione dell'AR promuove la generazione di iPSC-CM ventricolari18,22. L'attivazione della segnalazione Wnt in una fase successiva della differenziazione promuove l'induzione di cellule progenitrici cardiache a cardiomiociti nodali19,21, che è promettente per la generazione di cellule pacemaker biologiche specifiche del paziente.

Gli iPSC-CM umani sono immaturi e hanno una capacità di proliferazione limitata25. Durante lo sviluppo cardiaco embrionale, la maturazione procede mentre la proliferazione diminuisce. C'è una finestra stretta in cui le iPSC-CM possono essere stimolate per una robusta proliferazione, che riflette l'espansione embrionale dei cardiomiociti. Qui usiamo un attivatore Wnt CHIR99021 per promuovere la proliferazione dei primi iPSC-CM per un periodo limitato, che è coerente con un recente rapporto17. Si ipotizza che la via di segnalazione Wnt influenzi la proliferazione dei cardiomiociti possibilmente attraverso la diafonia con più vie a monte come NOTCH e Hippo26,27. La segnalazione NOTCH promuove la proliferazione dei cardiomiociti mentre la via hippo limita la crescita cardiaca e le dimensioni del cuore28,29,30. Non è ancora noto come l'interazione tra NOTCH e Hippo determini a valle l'attività Wnt e metta a punto un adeguato grado di proliferazione cardiaca. Il nostro protocollo ha fornito un interessante modello per la proliferazione dei cardiomiociti per studiare i meccanismi patologici dei difetti cardiaci congeniti causati dall'ipoplasia dei cardiomiociti ventricolari, come la sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) e l'atresia polmonare con setto ventricolare intatto (PA-IVS).

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo studio è stato supportato dall'American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) sovvenzioni 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Il Dr. Ming-Tao Zhao è stato anche supportato da fondi di avvio dell'Abigail Wexner Research Institute presso il Nationwide Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 168 cellule mononucleate del sangue periferico PBMC cellule staminali pluripotenti indotte umane iPSC differenziazione cardiaca riprogrammazione iPSC espansione cardiomiocitaria.
Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente
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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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