Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek, kardiyovasküler hastalık üzerinde hassas tıbba büyük ilgi çekmiştir. İnsan indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kardiyak farklılaşma, embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan tanımlanmış sinyal yolları ile modüle edilir. 2-B ve 3 boyutlu platformlarda çok sayıda kardiyak farklılaşma yöntemi çeşitli verimlilikler ve kardiyomiyosit verimi ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çeşitliliği takip etmek zor olabileceği için bu, alanın dışındaki araştırmacıların kafasını karıştırdı. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC' ler) hastaya özgü kardiyomiyositlerin sağlam bir şekilde üretilmesini ve genişlemesini ayrıntılı olarak anlatan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, entegrasyonsuz Sendai virüs vektörleri kullanarak bir hastanın kan örneğinden yüksek verimli bir iPSC yeniden programlama protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, çoğu insan iPSC hattından dayak kardiyomiyositleri sağlam bir şekilde üretebilen küçük bir molekül aracılı monolayer farklılaşma yöntemini detaylandırıyoruz. Ek olarak, endüstriyel ve klinik sınıf uygulamalar için hasta kaynaklı kardiyomiyositleri hızla genişletebilen küçük bir molekül (CHIR99021) kullanılarak ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit genişletme protokolü getirilmiştir. Sonunda, bu iPSC-CM'lerin moleküler tanımlaması ve elektrofizyolojik karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller tasvir edilir. Bu protokolün kardiyovasküler gelişim ve kök hücre biyolojisi hakkında sınırlı bilgiye sahip yeni başlayanlar için pragmatik olmasını bekliyoruz.

Introduction

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin keşfi modern kardiyovasküler tıpta devrim yaptı1,2. İnsan iPSC'leri kardiyomiyositler, endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve kardiyak fibroblastlar da dahil olmak üzere kalpteki tüm hücre tiplerini kendi kendine yenileyebilir ve üretebilir. Hasta iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD' ler) modellanması ve yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilebilmesi için süresiz kaynaklar olarak hizmet edebilir3. Özellikle, hasta iPSC-CM'ler, uzun QT sendromu4 ve genişlemiş kardiyomiyopati (DCM)5gibi kardiyomiyositlerdeki kusurlardan elde edilen CVD'lerin genetik ve moleküler etiyolojilerini araştırmaya hazırdır. CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme ile birlikte, hasta iPSC-CM'ler, doğumsal kalp kusurları (CHD'ler)6,7,8dahil olmak üzere CVD'lerin karmaşık genetik temelini anlamak için benzeri görülmemiş bir yol açmıştır. İnsan iPSC-CM'leri ayrıca kalp krizi sırasında hasarlı miyokard doldurmak için otolog hücre kaynakları olarak hizmet etme potansiyelleri sergilemektedir9. Son yıllarda, kardiyak rejenerasyon ve ilaç testi için tanımlanmış alt tiplere (atriyal, ventriküler ve nodal) sahip yüksek kaliteli insan iPSC-CM'leri üretmek çok önemli hale gelmiştir10.

Kardiyak farklılaşma insan iPSC'lerinden son on yılda büyük ölçüde gelişmiştir. Farklılaşma yöntemleri embriyoid cisim (EB) bazlı spontan farklılaşmadan kimyasal olarak tanımlanmış ve yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmaya geçmiştir11. Wnt, BMP, Nodal ve FGF gibi embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan anahtar sinyal molekülleri, insan iPSC'lerinden kardiyomiyosit farklılığını arttırmak için manipüle edilir10,12. Önemli gelişmeler, insan iPSC'lerinden sağlam kardiyomiyosit üretimi için Wnt sinyalinin sıralı modülasyonunu (aktivasyonu ve ardından inhibisyon)içerir 13,14. Endüstriyel ve klinik düzeyde üretime yükseltilme potansiyeline sahipolan 15 , 16dayak kardiyomiyositlerinin büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için kimyasal olarak tanımlanmış kardiyak farklılaşma tarifleri araştırılmıştır. Ayrıca, erken insan iPSC-CM'lerinin sağlam genişlemesi, küçük bir kimyasal (CHIR99021)17kullanılarak constitutive Wnt aktivasyonuna maruz kalarak elde edilir. Son zamanlarda, alt tipe özgü kardiyomiyositler, insan iPSC'lerinden kardiyomiyosit soy taahhüdü sırasında belirli farklılaşma pencerelerinde retinoik asit (RA) ve Wnt sinyal yollarının manipülasyonu yoluyla üretilir18,19,20,21,22.

Bu protokolde, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden kaynaklanan insan CD'lerinin sağlam üretimi ve çoğalması için bir çalışma prosedürünü detaylandırıyoruz. 1) insan PBMC'lerinin iPSC'lere yeniden programlanması, 2) insan iPSC'lerinden sağlam dayak kardiyomiyositleri üretimi, 3) erken iPSC-CM'lerin hızlı genişlemesi, 4) insan iPSC-CM'lerin moleküler karakterizasyonu ve 5) insan iPSC-CM'lerin yama kelepçesi ile tek hücreli düzeyde elektrofizyolojik ölçümü için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, hasta kan hücrelerinin dayak kardiyomiyositlerine dönüştürülmesiyle ilgili ayrıntılı deneysel prosedürleri kapsamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan denekler için deneysel protokoller ve bilgilendirilmiş onay, Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.

1. Hücre kültürü ortamlarının, çözümlerinin ve reaktiflerinin hazırlanması

  1. PBMC medyayı hazırlama
    1. 20 mL bazal PBMC kültür medya (1x) ve 0,52 mL takviye karıştırın. Her birine 20 μL SCF ve FLT3 (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL), her biri 4 μL IL3, IL6 ve EPO (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL) ve 200 μL L-glutamin alternatifi (100x) ekleyin. İyice karıştırın. 0,22-μm filtre ünitesi kullanarak steril bir davlumbazda filtreleyin. Bunu Tam Kan Medyası olarak adlandır.
    2. 20 mL bazal PBMC kültür medyasını (1x) ve 0,52 mL'lik Ek'i karıştırın. 200 μL L-glutamin alternatifi (100x) ekleyin. İyice karıştırın. 0,22-μm filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Bunu Supplement Blood Media olarak adlandır.
  2. Eksiksiz E8 ortamı hazırlayın
    1. Tam E8 ortam yapmak için 500 mL E8 bazal ortam ve 10 mL E8 takviyesi (4 °C'de bir gecede çözülür) karıştırın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) dengeyi kullanın.
  3. iPSC geçen medyayı hazırlama
    1. 200 mL komple E8 ortamına 40 μL Y-27632 Kaya inhibitörü (1:5.000 seyreltme, stok konsantrasyonu: 10 mM) ekleyin. İyice karıştırın. Kullanmadan önce RT'ye eşdeğer.
  4. Kardiyomiyosit farklılaşma ortamı hazırlama
    1. Medya I: 500 mL RPMI1640'ı 10 mL B27 eksi insülin takviyesi (50x) ile karıştırın.
    2. Ortam II: Ortam I'e uygun miktarda CHIR99021 (GSK3 inhibitörü) stoğu ekleyin (CHIR99021 son konsantrasyonu 6 μM). İyice karıştırın.
    3. Ortam III: Ortam I'e uygun miktarda IWR-1 (Wnt inhibitörü) stoğu ekleyin (IWR-1 son konsantrasyonu 5 μM). İyice karıştırın.
    4. Medya IV: 500 mL RPMI1640'ı 10 mL B27 takviyesi (50x) ile karıştırın. İyice karıştırın.
    5. Ortam V: 500 mL RPMI1640 'ı (glikozsuz) 10 mL B27 takviyesi (50x) ile karıştırın. İyice karıştırın.
    6. Medya VI: Media IV'e uygun miktarda CHIR99021 stoğu ekleyin (CHIR99021 son konsantrasyonu 2 μM). İyice karıştırın.
  5. iPSC-CM geçen medyayı hazırlama
    1. 90 mL Media IV'e 10 mL Nakavt Serum Replasmanı (KSR) ekleyin (KSR son konsantrasyonu: %10). İyice karıştırın.
  6. iPSC-CM dondurma medyası hazırlama
    1. 9 mL KSR'ye 1 mL DMSO ekleyin (son konsantrasyonlar: %10 DMSO/%90 KSR) ve iyice karıştırın.
  7. Bodrum membran matrisi orta kaplamalı plakaları hazırlayın
    1. Bir gecede 4 °C'de bodrum membran matrisi ortamını ve 1,5 mL tüplerde aliquot çözün. Bu ortamın 1 mL'sini 250 mL'ye kadar DMEM/F12 ortamı (1:250 seyreltme) ekleyin ve iyice karıştırın. Seyreltilmiş çözeltinin kuyu başına 2 mL'sini 6 kuyulu bir plakaya uygulayın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca 37 °C'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.

2. PBMC'lerin iPSC yeniden programlanması

  1. PBMC'leri kan örneklerinden ayırın.
    1. Hasta kan örneklerini (~5 mL) toplayın ve kan hücresi ayırma tüplerine aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). 10x ters çevirerek karıştırın.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj.
    3. Tüpleri dikkatlice dışarı alın ve% 70 etanol ile püskürtün. Biyogüvenlik başlığı altında, mononükleer hücreleri (buffy tabakası) rahatsız etmeden kapakları çıkarın. PBMC'ler plazma tabakasının hemen altında beyazımsı bir tabaka halinde olacaktır (Şekil 1A). 1000 μL pipet kullanarak tüm buffy tabakasını toplayın ve 15 mL konik bir tüpe aktarın.
    4. Otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numarasını sayın. RT'de 25 dakika boyunca tüpü 300 x g'da döndürün.
    5. Üstnatant atın. 10 mL DPBS ile yıkayın (Ca2+/ Mg2 + ücretsiz).
    6. RT'de 15 dakika boyunca tüpü 300 x g'da döndürün.
    7. Üsttekini çıkarın. Hücre peletlerini 1 mL donma ortamına (KSR artı %10 DMSO) yeniden sunun. Şişe başına 1 x 106 hücre yapmak için hücre yoğunluğunu ayarlayın.
    8. PBMC cryovials'ı bir hücre dondurma kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de tutun. Ertesi gün uzun süre depolama için sıvı azot tankına aktarın.
  2. iPSC yeniden programlama.
    1. 15 mL konik tüpe 3 mL Takviye Kan Ortamı ekleyin. PBMC'leri 37 °C su banyosunda çözün ve konik bir tüpe aktarın. RT'de 7 dakika boyunca 300 x g'da dön.
    2. Üstnatant atın. PBMC'leri Tam Kan Ortamı ile Yeniden Yüt. Onları 24 kuyu doku kültürü plakasının iki kuyusuna tohumlayın (bodrum membran matrisi yoktur).
    3. Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün eski ortamın yarısını (0,5 ml) hafifçe çıkarın ve 0,5 mL taze Tam Kan Ortamı ekleyin.
    4. Eski medyanın yarısını yenileyerek medyayı her gün değiştirin.
    5. Bir hafta sonra, kuyuyu 1 mL Takviye Kan Ortamı ile agresif bir şekilde yıkayın ve hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    6. Cep telefonu numarasını say. 2 x 10 5 hücre alın ve7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj alın.
    7. Üstnatant atın. Hücreleri 300 μL Tam Kan Ortamı ile yeniden biriktirin. Üreticinin talimatlarına göre uygun sendai virüs yeniden programlama vektörleri hacmi ekleyerek transfection gerçekleştirin. Bunları 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna aktarın (bodrum membran matrisi yoktur). Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
    8. Ertesi gün 7 dakika boyunca 300 x g'da döner. Üstnatant çıkarın ve 2 mL Tam Kan Ortamı'nda yeniden dirilt. Bodrum membran matrisi ile önceden kaplanmış 6 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın. Bugün 1.
    9. Ertesi gün tabağa dokunma.
    10. D3'te, eski ortamın 1 mL'lik kısmını çıkarın. 1 mL Takviye Kan Ortamı ekleyin.
    11. D5'te 2.2.10 adımlarını yineleyin.
    12. D7'de, eski ortamın 1 mL'lik kısmını çıkarın. 1 mL komple E8 ortam ekleyin.
    13. D8'de, 2.2.12 adımlarını yineleyin.
    14. D9'da eski medyayı kaldırın. 2 mL komple E8 ortam ekleyin. Tamamen yeniden programlanmış hücrelerin bağlanması ve koloniler oluşturmaya başlaması beklenir.
    15. Her gün 2 mL komple E8 ortamla yenileyin.
    16. Sendai virüs transdüksiyondan yaklaşık 2 hafta sonra, büyük iPSC kolonileri ortaya çıkacak ve toplamaya hazır olacaktır.
    17. Kaputtaki stereomikroskop altında iPSC kolonilerini kesin ve tek tek kolonileri 0,5 mL iPSC geçen ortamla önceden yüklenmiş bir bodrum membran matrisi kaplı 24 kuyu plakasına aktarın.
    18. iPSC kolonileri yeni bir bodrum membran matrisi kaplı 6 kuyu plakasına geçmek için yeterince büyüyene kadar her gün 0,5 mL tam E8 ortamla yenileyin.

3. İnsan iPSC bakımı ve geçişi

  1. İnsan iPSC'leri %90'ın üzerinde ifluency'ye ulaştığında, eski medyayı kaldırın. Bir kez 3 mL DPBS ile durulayın.
  2. DPBS çözümüne 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin. 5-8 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
  3. Aspirasyonla EDTA'yı kaldırın. 1 mL iPSC geçen ortam ekleyin. iPSC'leri el ile yerinden sökün.
  4. 600-900 μL tek hücreli süspansiyon alın ve bunları bir bodrum membran matrisi kaplı 6 kuyu plakasına (seyreltme: 1:6 ila 1:10) yeniden plakalayın. Bir gecede 37 °C'de%5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
  5. Her gün 2 mL komple E8 ortamla yenileyin. iPSC kültürleri genellikle 3-4 gün sonra izdiah eder.

4. Kimyasal olarak tanımlanmış kardiyomiyosit farklılaşması

  1. Kültür insan iPSC'leri% 95 birliğe (3-4 gün) kadar tam E8 medyasında.
  2. Eski medyayı kaldırın. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2 mL CM farklılaşma Media II (RPMI1640'ta 6 μM CHIR artı B27 eksi insülin takviyesi) ekleyin. Burası D0. D1'e dokunmayın.
  3. D2'de, 2 mL CM farklılaşması Media I (RPMI1640 artı B27 eksi insülin takviyesi) ile değiştirin.
  4. D3'te, 2 mL CM farklılaşma Media III (RPMI1640'ta 5 μM IWR-1 artı B27 eksi insülin takviyesi) ile değiştirin. D4'e dokunmayın.
  5. D5'te, 2 mL CM farklılaştırma Media I ile değiştirin.
  6. D7'de, 2 mL CM farklılaştırma Media IV (RPMI1640 artı B27 eki) ile değiştirin. Bundan sonra, medyayı her gün yenileyin.
  7. Büzülen hücreler gözlendiğinde D11'de, 2 mL CM farklılaşma Media V (glikoz yok) ile değiştirin.
  8. D13'te, 2 mL CM farklılaştırma Media V ile değiştirin.
  9. D15'te, 2 mL CM farklılaştırma Media IV ile değiştirin.
  10. D17-D21'de, her gün 2 mL CM farklılaştırma Media IV ile değiştirin.

5. Pasaj insan iPSC-CM'leri

  1. Eski medyayı çıkarın ve hücreleri bir kez 3 mL DPBS ile durulayın.
  2. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 mL CM ayrışma çözeltisi uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu). 5-8 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
  3. Güçlü pipetleme ile iPSC-CM'leri mekanik olarak tek hücrelere ayırır.
  4. Hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. CM ayrışma çözümünü nötralize etmek için 2 mL CM geçiş ortamı (RMPI1640'ta %10 KSR artı B27 takviyesi) ekleyin.
  5. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
  6. Üstnatant atın. İstenilen cm geçiriş ortamı hacmine sahip hücreleri yeniden biriktirin. Onları bir bodrum membran matrisi kaplı plakaya / yemeğe tohumlayın. İnsan iPSC-CM'leri geçtikten 1-3 gün sonra atmaya devam eder.

6. İnsan iPSC-CD'lerinin genişletilmesi

  1. D10-12'yi 6 kuyulu bir plakanın her kuyusu için 3 mL DPBS ile iPSC-CM'leri bir kez yenerek durulayın. 1 mL CM ayrışma çözümü ekleyin (Adım 5.2). 7-10 dakika boyunca 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yaslanın.
  2. Güçlü pipetleme ile iPSC-CM'leri mekanik olarak tek hücrelere ayırır.
  3. Hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. CM ayrışma çözümünü nötralize etmek için 2 mL CM geçiş ortamı ekleyin.
  4. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
  5. Üstnatant atın. Hücreleri uygun bir CM geçiriş ortamı hacmiyle yeniden biriktirin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre süspansiyon yapmak için. Bir milyon iPSC-CM'i bodrum membran matrisi kaplı 10 cm'lik bir çanağa tohumlayın.
  6. Ertesi gün eski medyayı kaldırın. 10 mL kardiyomiyosit çoğalma ortamı ekleyin (Ortam VI: 2 μM CHIR99021). Medyayı iki günde bir değiştirin.
  7. iPSC-CM'ler 7-9 günlük kültürden sonra birleştiğinde, iPSC-CM'lerin daha da genişletilmesi için geçiş adımını tekrarlayın.

7. İmmünoresans

  1. İmmünofluoresans boyamadan önce, 24 kuyu plakasına yerleştirilen bodrum membran matrisi kaplı kapaklara tohum iPSC-CM'ler (tohumlama yoğunluğu: 0,5-1 x 106 hücre/mL). iPSC-CD'leri kültürde en az 4 gün boyunca koruyun.
  2. Hücreleri bir kez 1 mL DPBS kullanarak yıkayın.
  3. %4 paraformaldehit (PFA) 0,5 mL ekleyin ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Hücreleri 1 mL DPBS kullanarak yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
  5. %0,1 Triton X-100'ün 0,5 mL'sini ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. İki kez 1 mL DPBS ile yıkayın.
  7. DPBS'ye %0,2 BSA'nın 0,5 mL'sini ekleyin (engelleme çözümü). RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  8. Blokaj çözeltisi ile seyreltilmiş 200 μL birincil antikor ekleyin (seyreltme: 1:400-1:1000). Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  9. Hücreleri 0,5 mL blokaj çözeltisi kullanarak 3 dakika boyunca sallama ile yıkayın. İki kez tekrarlayın.
  10. Blokaj çözeltisinde seyreltilmiş 200 μL ikincil antikor ekleyin. RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  11. Hücreleri 0,5 mL DPBS ile üç kez durulayın, her biri sallama ile 3 dakika boyunca.
  12. DAPI (1:2000 seyreltme) ile karşıt çekirdek ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
  13. Hücreleri 0,5 mL DPBS ile üç kez durulayın.
  14. Kapaklardaki hücreleri 5 μl montaj ortamı kullanarak bir mikroskop kaydırağı üzerine monte edin. 4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.

8. Akış sitometrisi numune hazırlama

  1. İnsan iPSC-CM'lerini bir kez 3 mL DPBS ile yıkayın.
  2. 1 mL CM ayrışma çözeltisi ekleyin ve 7-10 dakika boyunca 37 °C'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
  3. 1.000-μL pipet kullanarak hücreleri yerinden sökün. Hücre süspansiyonunu bir süzgeç kapağından yuvarlak bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüpü, enzim aktivitesini nötralize etmek için 1 mL iPSC-CM geçen ortam (%10 KSR) ile önceden doldurulur.
  4. 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  5. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. 250 μL Fiksasyon/Permeabilizasyon çözümü ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatır.
  6. 1 mL Perm/Wash tamponu ekleyin. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  7. Üstnatant atın. 1x Perm/Wash tampona 100 μL seyreltilmiş primer antikor (1:200-1:500) ekleyin. Girdap kısa bir süre ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
  8. 1 mL Perm/Wash tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  9. Üstnatant atın. 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin (1:500-1:1.000). Vortex kısa bir süre ve RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın. sekonder antikorlar ışığa duyarlı floresan ile eşlenirse ışıktan koruyun.
  10. 1 mL Perm/yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Vortex kısa bir süre ve 4 dakika boyunca 300g döndürün.
  11. Üstnatant atın. Hücreleri 400 μL FACS boyama tamponu (PBS/%4 FBS) ile yeniden biriktirin. Bir FACS cihazına yüklenene kadar 4 °C'de saklayın.

9. Gerçek zamanlı qPCR

  1. İnsan iPSC-CM kültüründeki eski medyayı kaldırın. Lizat hücrelerine 500-700 μL lizis tamponu ekleyin. RT. Scape hücresinde 3 dakika kuluçkaya yaslanın ve 1,5 ml RNase içermeyen bir tüpe aktarın. Hemen toplam RNA ekstraksiyona geçin veya -80 °C'de saklayın.
  2. Üreticinin talimatını takiben bir RNA çıkarma kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
  3. RNA konsantrasyonunu ölçün ve toplam RNA'nın kalitesini bir spektrofotometre ile değerlendirin.
  4. CDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin. Toplam RT reaksiyon hacmi, 4 μL reaksiyon karışımı (5x), 1 μL ters transkriptaz, 1 μg toplam RNA ve RNaz içermeyen su dahil olmak üzere 20 μL'dir.
  5. Aşağıdaki protokolü kullanarak bir termal çevrimde tam RT reaksiyon karışımını kuluçkaya yaslayın: 5 dakika boyunca 25 °C; 20 dakika için 46 °C; 1 dakika için 95 °C; 4 °C'de tutun.
  6. Nükleaz içermeyen su kullanarak cDNA'yı 1:10'a kadar seyreltin. 1 μL cDNA şablonu, 1 μL primer / prob, 10 μL qPCR ana karışımı ve 8 μL çekirdeksiz suyu karıştırarak gerçek zamanlı qPCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın.
  7. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde çalıştırın. Bisiklet protokolü 50 °C 2 dk (tutma), 95 °C 10 dk (tutma), 95 °C 15 sn, 60 °C 1 dk, 40 döngü boyunca tekrarlayın.
  8. Her örnekteki her gen için CT değerlerini toplayın. Bağıl mRNA bolluğu, hedef genin CT değerinin bir temizlik geninin CT değerinden çıkarılmasıyla hesaplanır. Bağıl gen ekspresy ekspresy 2-ΔΔCT yöntemi ile analiz edilir.

10. Tüm hücreli yama kelepçe kaydı

  1. Daha önce açıklandığı gibi CM ayrıştırma çözümünü kullanarak iPSC-CM'leri tek hücrelere ayır.
  2. Bodrum membran matrisi kaplı kapaklarda düşük yoğunlukta tohum hücreleri. Media IV'te 3-4 gün boyunca kültür edin.
  3. Yatay bir mikroelektoz çekeceği kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan pipetleri (direnç 0,9-1,5 MΩ) çekin.
  4. Tyrode çözeltisinde hücreleri kuluçkaya yatır (pH=7.35).
  5. Pipetleri aşağıdaki kimyasallardan oluşan elektrot çözeltisi (pH=7.3) ile doldurun: 120 mM aspartik asit, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14 mM fosfokreatin, 4 mM K-ATP ve 2mm kreatin fosfokinaz.
  6. Hücreleri 1 Hz'de 1,5-2 diyastolik eşik 5 ms akım darbesi kullanarak mevcut kelepçe moduna yerleştirin.
  7. Bir mikroelektrod amplifikatörü ve yazılım odaklı bir alım kartı kullanarak eylem potansiyellerini (APs) kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PBMC'lerden insan iPSC yeniden programlanması
7 gün boyunca Complete Blood Media ile ön kültürden sonra, PBMC'ler görünür çekirdek ve sitoplazma ile büyük hale gelir (Şekil 1B), virüs transfeksiyona hazır olduklarını gösterir. Sendai virüsünün yeniden programlanması faktörleri ile transfeksiyondan sonra, PBMC'ler bir hafta daha epigenetik yeniden programlama işleminden geçecektir. Tipik olarak, 1 x 10 5 PBMC'nin transfeksiyonundan30-50 iPSC kolonisi elde ederiz ve yeniden programlama verimliliği% 0.03-% 0.05'tir. Tamamen yeniden programlanmış hücreler, tam E8 ortamına tanıtıldıklarında koloniler ekleyecek ve oluşturmaya başlayacaktır (Şekil 1C). Bu erken iPSC kolonileri 7 gün daha genişletilir ve daha sonra mekanik olarak tek tek kesilir ve alınır. Her iPSC kolonisi, bireysel iPSC hatları oluşturmak için 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna aktarılır. 4-5 pasajdan sonra, iPSC kolonileri etrafında çok az farklılaştırılmış hücre ile saflaşacaktır (Şekil 1D). Bu aşamada, iPSC kolonilerindeki hücrelerin çoğu OCT4 ve NANOG pozitiftir (Şekil 1E), pluripotency'lerini gösterir. Kararlı iPSC hatları beşinci pasaj tarafından kurulur.

Kardiyak farklılaşma
Kardiyak farklılaşma protokolü Şekil 1F'detasvir edilir. Kardiyak farklılaşma, iPSC'ler en az 10 pasaj boyunca korunduğlarında başlatılır. CHIR99021 uygulandığında iPSC konfluens derecesi kritik öneme sahiptir. Hücre yoğunluğu % 90'dan fazla birikmedir, ancak aşırı bir araya değildir. İPSC kolonileri çok kalabalıklaşırsa, yönlendirilmiş kardiyomiyosit farklılaşma verimliliğini olumsuz yönde etkileyecek spontan farklılaşmaya başlayacaktır. Dayak kardiyomiyositler genellikle farklılaşmanın 12. Dayak başlangıcının gerçekleştiği tarih değişir ve kullanılan iPSC hatlarına bağlıdır. Glikoz açlığı ve sıçramadan sonra, iPSC-CM'ler kendiliğinden dayak gösterir (Video 2) ve birbirine ölçeklenmiş kardiyak troponin T (TNNT2) ve α-actinin (Şekil 1G-H)ile hizalanmış sarkomere yapısı. Ek olarak, iPSC-CM'lerin saflığı yüksektir, hücrelerin% 93'ünden fazlası TNNT2+ FACS analizinde gösterildiği gibi (Şekil 1I).

iPSC-CM'ler yetişkin kardiyomiyositlere kıyasla nispeten olgunlaşmamış olsa da, tam hücreli yama kelepçesi ile ölçülen ventrikül ve atriyal benzeri eylem potansiyelleri gösterirler (Şekil 2A,B). Tipik bir kardiyak farklılaşmada, 30. Farklı farklılaşma protokolleri, hücre soyu belirleme sırasında farklı sinyal yolları aktivasyonu nedeniyle kardiyomiyosit alt tiplerinin değişen yüzdelerini verir10. Ventrikül CD'leri MYL2 (MLC2v, Şekil 2D)ile etiketlenmiştir, atriyal iPSC-CM'ler ise NR2F2 (COUP-TFII, Şekil 2E)ile işaretlenmiştir. Bu belirteçler, erken aşamadakiler yerine daha olgun iPSC-CD'lerde (>D30) yüksek oranda ifade edilir.

wnt aktivasyonu ile iPSC-CM'lerin genişletilmesi
Memelilerde, yetişkin kardiyomiyositler kendini yenilemek için aktif olarak bölünmez. Bu fenomen aynı zamanda insan iPSC-CM'leri için de gerçekleşir. D30'un ötesinde olgunlaştıktan sonra, iPSC-CM'lerin hücre bölünmesi nadir bir olaydır, bu nedenle klinik ve endüstriyel düzeyde seri üretim yeteneklerini sınırlar. Embriyonik kardiyomiyosit çoğalması sırasında gelişim ortamını taklit etmek için, erken iPSC-CM'lerin çoğalmasını teşvik etmek için Wnt yolunu CHIR99021 ile aktive ediyoruz. D12-14 iPSC-CM'ler (glikoz yoksunluğu ile saflaştırmadan sonra) 2 μM CHIR99021 varlığında düşük yoğunlukta tohumlanır. Wnt aktivasyonu iPSC-CM'lerin hücre bölünmesini uyarır ve hücre döngüsünü G1 fazında ilerlemeye itebilen Cyclin D1 (Şekil 3A) gibi hücre döngüsü düzenleyicilerinin ekspresyonunu teşvik eder. İlginçtir ki, CHIR99021, kontrollere kıyasla 2 pasaj için erken iPSC-CM'lerin sağlam bir şekilde çoğalmasını sağlar (Şekil 3B). Bununla birlikte, iPSC-CM'lerin çoğalma yeteneği, embriyonik kalp gelişimi sırasında sınırlı ve iyi kontrol edilen kardiyak çoğalma ile tutarlı olan geniş pasajla azalır (Şekil 3B). Ek olarak, CHIR99021'in 30 günden fazla farklılaşmaya ulaştıklarında ve kararlı sarkom yapıları geliştirdiklerinde daha olgun iPSC-CM'lerin genişlemesini teşvik edebildiği görünmemektedir.

Figure 1
Şekil 1: İnsan iPSC yeniden programlama ve kardiyomiyosit farklılaşması. (A) Hasta kan örneklerinin ayrılmasından sonra PBMC tabakasını gösteren şematik bir diyagram. (B) Büyütülen PBMC'ler transfeksiyon için hazırdır. (C) Erken insan iPSC kolonileri. (D) 5. (E) İnsan iPSC'leri PLURIPOTENCY belirteçleri OCT4 (yeşil) ve NANOG (kırmızı) için pozitiftir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıttır. (F) Kardiyomiyosit farklılaşma protokolüne genel bakış. (G-H) iPSC-CM'lerin sarkom yapısı, TNNT2 (yeşil) ve α-aktiinin (kırmızı) karşı antikorlar kullanılarak immünofluoresans lekeleme ile ortaya çıkarılır. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıttır. (I) TNNT2'ye karşı antikor kullanılarak iPSC-CM'lerin FACS analizi. Ölçek çubukları: 200 μm (B-D), 50 μm (E ve G) ve 20 μm (H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İnsan iPSC-CM'lerinde kardiyomiyosit alt tipleri. (A-B) Ventrikül benzeri (A) ve atriyal benzeri (B) iPSC-CM'ler için temsili eylem potansiyel süreleri. (C) İnsan iPSC-CM'lerinde ventrikül, atriyal ve nodal benzeri alt tiplerin temsili yüzdeleri. (D-E) D30 iPSC-CM'ler ventriküler kardiyomiyosit belirteci MYL2 (D) ve atriyal belirteç NR2F2 (E)karşı antikorlarla boyanır. Hücreler aynı anda bir TNNT2 antikor ile lekelenir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıttır. Ölçek çubukları: 50 μm(D-E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Wnt aktivasyonu ile insan iPSC-CM'lerinin genişlemesi. (A) CHIR99021 varlığında Cyclin D1 pozitif iPSC-CM'lerin yüzdesi arttırılmıştır. Hücreler TNNT2 (kırmızı) ve Cyclin D1 (yeşil) karşı antikorlarla çift lekelenir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıttır. (B) İlk 3 pasajda CHIR99021 olan veya olmayan insan iPSC-CD'lerinin genişlemesi sırasında hücre sayısı katlanır. Y ekseni hücre numarası katlama değişikliklerini gösterir. CHIR99021, erken iPSC-CM'lerin sağlam çoğalmasını uyarır. Ölçek çubukları: 50 μm(A). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1. Farklılaşmanın 18. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2. Metabolik arınma sonrası 25. günde insan iPSC-CD'lerini yenmek. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

iPSC yeniden programlanması sırasında, PBMC'leri net çekirdek ve sitoplazma ile genişleyene kadar 1 hafta boyunca kültürlendirmek önemlidir. PBMC'ler çoğalmadığından, viral transdüksiyon için uygun bir hücre numarası başarılı iPSC yeniden programlanması için önemlidir. PBMC'lerin hücre sayısı, enfeksiyonun çokluğu (MOI) ve virüs titresi göz önünde bulundurulmalı ve en uygun transdüksiyon sonuçlarına ulaşacak şekilde ayarlanmalıdır. Kardiyak farklılaşma için, ilk tohumlama yoğunluğu, CHIR99021'in uygulandığı gün iPSC'lerin% 90'ın üzerinde birleştiğine ulaşması için kritik öneme sahiptir. Bir yandan, iPSC'ler kardiyak farklılaşma sırasında daha az birleştiğinde, CHIR99021 toksik olacak ve önemli hücre ölümüne yol açacaktır. Öte yandan, iPSC'ler aşırı birleştiğinde, yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmanın verimliliğini tehlikeye atacak spontan farklılaşmaya uğrarlar. Erken iPSC-CM'lerin genişlemesi için zamanlama ve kardiyomiyosit kalitesi dikkate alınmalıdır. Erken iPSC-CM'ler sadece kardiyomiyositlerin saflığı yeterince yüksek olduğunda sağlam bir şekilde çoğalabilir. Kültürdeki mevcut kardiyomiyositler de CHIR99021 tedavisine yanıt olarak çoğalabilir ve bu da erken iPSC-CM'lerin çoğalmasını olumsuz yönde etkileyecektir. Ek olarak, kardiyomiyosit genişlemesini 20 günlük farklılaşma ile uyarmak çok önemlidir. iPSC-CM'ler 30.

İnsan iPSC'leri başlangıçta retrovirüs aracılı transfeksiyon1,2yoluyla dermal ve akciğer fibroblastlarından türetilmiştir. Hasta iPSC'lerinin klinik çevirisinde ilerlemeyi engelleyen bu yeniden programlama yöntemleriyle ilgili iki önemli sorun vardır: 1) retrovirüs konak genomuna entegre olur ve böylece potansiyel genetik mutasyonları teşvik eder; 2) hasta kaynaklı fibroblastlar, birçok hastanın reddedebileceği cilt biyopsileri gerektirir. Bu protokolde, hasta iPSC'lerini sağlam bir şekilde türetmek için ticari entegrasyonsuz Sendai virüs23 ve PBMC'leri kullanan bir protokol açıklıyoruz. Bu iPSC'ler eksojen yeniden programlama vektörlerinden arındırılmıştır ve süresiz olarak kendini yenileme ve pluripotency ile korunabilir. Ayrıca hasta kan örnekleri klinik laboratuvarlarda kolayca toplanır. Protokolümüz çok yönlüdür ve büyük ölçekli depo ve klinik çeviriler için hasta ve hastalığa özgü iPSC'lerin seri üretimi için kullanılabilir24.

Sağlam kardiyomiyosit farklılaşması, kardiyak iPSC'lerden ayırt etme sırasında belirli sinyal yollarının sıralı modülasyonu ile elde edilir. Kardiyak spesifikasyon ve çoğalmada rol oynayan temel yollar arasında Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF ve retinoik asit (RA) 10,12bulunur. Burada Wnt sinyalinin küçük kimyasallarla sıralı modülasyonu ile verimli bir kardiyak farklılaşma protokolü sunuyoruz: önce CHIR99021 tarafından aktivasyon ve ardından IWR-113,14. Küçük kimyasallar kararlıdır ve büyüme faktörleri kullananlara kıyasla tutarlı farklılaşma sonuçları verir. Bu protokol tarafından oluşturulan çoğu iPSC-CM, atriyal ve nodal benzeri hücrelerle karıştırılmış ventriküler benzeri kardiyomiyositlerdir. Alt tipe özgü kardiyomiyositlerin hassas üretimi, daha sonraki farklılaşma adımları10,12'deince ayar yaparak elde edilir. Örneğin, IWR-1 tedavisinden hemen sonra RA eklenmesi, atriyal benzeri kardiyomiyositlerin yüksek bir yüzdesini sağlarken, RA inhibisyonu ventrikül benzeri iPSC-CM'lerin neslini teşvik eder18,22. Farklılaşmanın daha sonraki bir aşamasında Wnt sinyal aktivasyonu, kardiyak progenitör hücrelerin nodal benzeri kardiyomiyositlere indüksiyonunu teşvik eder19,21, bu da hastaya özgü biyolojik kalp pili hücrelerinin üretimi için umut vericidir.

İnsan iPSC-CM'leri olgunlaşmamış ve sınırlı çoğalma yeteneğine sahiptir25. Embriyonik kardiyak gelişim sırasında, çoğalma azalırken olgunlaşma devam eder. Embriyonik kardiyomiyosit genişlemesini yansıtan sağlam çoğalma için iPSC-CM'lerin uyarılabildiği dar bir pencere vardır. Burada, erken iPSC-CM'lerin sınırlı bir süre için çoğalmasını teşvik etmek için bir Wnt aktivatör chir99021 kullanıyoruz, bu da yakın tarihli bir raporla tutarlı17. Wnt sinyal yolunun, NOTCH ve Su Aygırı26,27gibi birden fazla yukarı akış yolu ile muhtemelen çapraz konuşma yoluyla kardiyomiyosit çoğalmasını etkilediği tahmin ediliyor. NOTCH sinyalizasyon kardiyomiyosit çoğalmasını teşvik ederken, Hippo yolu kardiyak büyümeyi ve kalp boyutunu kısıtlar28,29,30. NOTCH ve Hippo arasındaki etkileşimin aşağı akış Wnt aktivitesini nasıl belirlediği ve uygun derecede kardiyak çoğalma için ince ayar yaptığı hala bilinmemektedir. Protokolümüz, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) ve sağlam ventriküler septum (PA-IVS) ile pulmoner atrezi gibi ventrikül kardiyomiyositlerinin hipoplazmasından kaynaklanan konjenital kalp kusurlarının hastalık mekanizmalarını incelemek için kardiyomiyosit çoğalması için ilginç bir model sağlamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA) Kariyer Geliştirme Ödülü 18CDA34110293 (M-T.Z.), Ek Girişimler AVIF ve SVRF ödülleri (M-T.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NHLBI) tarafından desteklendi. 1R01HL132520 ve R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü'nden başlangıç fonlarıyla da desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 168 periferik kan mononükleer hücreler PBMC'ler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler iPSC'ler kardiyak farklılaşma iPSC yeniden programlama kardiyomiyosit genişlemesi.
Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter