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Developmental Biology

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포생성은 심혈관 질환에 대한 정밀 의학에 엄청난 관심을 끌고 있습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 심장 분화는 배아 심장 발달에 필수적인 정의된 신호 경로에 의해 변조됩니다. 2D 및 3D 플랫폼에 대한 수많은 심장 분화 방법은 다양한 효율성과 심근세포 수율로 개발되었습니다. 이러한 방법의 다양성은 따라하기 어려울 수 있기 때문에 이것은 필드 외부 의아해 수사관이있다. 여기서 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 환자 특정 심근 세포의 견고한 생성 및 확장을 정교하게 하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 먼저 비통합 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 고효율 iPSC 재프로그래밍 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 대부분의 인간 iPSC 라인에서 박동하는 심근세포를 강력하게 생성할 수 있는 작은 분자 매개 단층 분화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 확장 가능한 심근세포 팽창 프로토콜은 산업 및 임상 등급 응용을 위해 환자 유래 심근세포를 빠르게 확장할 수 있는 작은 분자(CHIR99021)를 사용하여 도입된다. 결국, 이러한 iPSC-CM의 분자 식별 및 전기 생리학적 특성화를 위한 상세한 프로토콜이 묘사된다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 발달과 줄기 세포 생물학에 대한 제한된 지식을 가진 초보자를 위한 실용적일 것으로 기대합니다.

Introduction

인간 유도 만능 줄기 세포의 발견은 현대 심장 혈관 의학1,2에혁명을 일으켰습니다. 인간 iPSCs는 심근세포, 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 심장 섬유아세포를 포함하여 심장에 있는 모든 세포 모형을 자기 갱신하고 생성할 수 있습니다. 환자 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)는 유전적으로 상속가능한 심혈관 질환(CVDs)을 모델링하고 신약에 대한 심장 안전성 검사를 위한 무기한 자원역할을 할 수있다. 특히, 환자 iPSC-CM은 긴 QT 증후군4 및 확장된 심근병증(DCM)5와같은 심근세포의 결함에서 파생된 CVD의 유전적 및 분자 병각을 잘 조사할 태세입니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집과 결합된 환자 iPSC-CM은 선천성 심장 결함(CHDs)6,7,8을포함한 CVD의 복잡한 유전적 기초를 이해하는 전례 없는 길을 열었습니다. 인간 iPSC-CM은 또한 심장 마비 도중 손상된 심근을 보충하기 위한 자가 세포 근원역할을 하는 잠재력을 전시했습니다9. 최근에는 심장 재생 및 약물 검사를 위한 정의된 하위 형(심방, 심실 및 노달)을 가진 고품질 인간 iPSC-CM을 생성하는 것이 가장중요해졌습니다.

인간 iPSC에서 심장 분화는 지난 10 년 동안 크게 진보되었습니다. 분화 방법은 배아 체(EB)기반의 자발적 분화에서 화학적으로 정의되고 지시된 심장분화(11)로갔다. Wnt, BMP, Nodal 및 FGF와 같은 배아 심장 발달에 필수적인 주요 신호 분자는 인간 iPSC10,12로부터심근구 분화를 향상시키기 위해 조작된다. 중요한 진보는 인간 iPSCs13,14에서심근세포의 견고한 생성을 위한 Wnt 신호 (억제 에 선행된 활성화)의 순차적변조를포함한다. 화학적으로 정의된 심장 분화 레시피는 산업 및 임상 수준의 생산으로 업그레이드될 가능성이 있는 심근세포15,16을치는 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 탐구되었습니다. 더욱이, 초기 인간 iPSC-CM의 강력한 확장은 작은 화학물질(CHIR99021)17을이용하여 구성적인 Wnt 활성화에 노출함으로써 달성된다. 가장 최근에는, 아류형 특이적 심근세포는 인간 iPSC18,19,20,21,22의심근세포 계보 약정 동안 특정 분화 창에서 망막산(RA) 및 Wnt 신호 경로의 조작을 통해 생성된다.

이 프로토콜에서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 유래하는 인간 적인 CM의 견고한 생성 그리고 증식을 위한 작동 절차를 상세히 설명합니다. 우리는 1) 인간 PBMC를 iPSC로 재프로그래밍하는 프로토콜, 2) 인간 iPSC에서 심근세포를 치고, 3) 초기 iPSC-CM의 급속한 확장, 4) 인간 iPSC-CM의 분자 특성화, 및 5) 단일 세포 수준에서 인간 iPSC-CM의 전기 생리학적 측정을 패치 에 의해 제시한다. 이 프로토콜은 환자 혈액 세포를 심장 구균세포를 구타로 변환하는 방법에 대한 상세한 실험 절차를 다룹니다.

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Protocol

인간 과목에 대한 실험 프로토콜 및 정보에 입각한 동의는 전국 아동 병원의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.

1. 세포 배양 매체, 솔루션 및 시약 의 준비

  1. PBMC 미디어 준비
    1. 기초 PBMC 문화 매체 (1 x)와 0.52 mL의 기초 PBMC 문화 매체의 20 mL을 혼합하십시오. 각각 20μL의 SCF및 FLT3(스톡 농도: 100 μg/mL), IL3, IL6 및 EPO4 μL(재고 농도: 100 μg/mL) 및 L-글루타민 대안(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 멸균 후드를 필터링합니다. 이 이름을 완전한 혈액 미디어로 지정합니다.
    2. 기초 PBMC 문화 매체(1x)와 0.52mL의 기초 PBMC 배양 매체(1x)와 0.52mL의 보충제를 혼합합니다. L-글루타민 대체(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 필터링합니다. 이 이름을 혈액 보조 자료로 지정합니다.
  2. 완전한 E8 미디어 준비
    1. E8 기저형 미디어 500mL와 10mL의 E8 보충제(4°C에서 하룻밤 동안 해동)를 혼합하여 완전한 E8 미디어를 만듭니다. 사용하기 전에 실온 (RT)에 평형.
  3. iPSC 패시징 미디어 준비
    1. Y-27632 록 억제제(1:5,000 희석, 재고 농도: 10mMM)의 40μL을 완전한 E8 미디어의 200mL에 추가합니다. 그것을 완전히 섞습니다. 사용하기 전에 RT에 평형.
  4. 심근세포 분화 미디어 준비
    1. 미디어 I: 혼합 500 RPMI1640와 함께 10 mL 의 B27 마이너스 인슐린 보충 (50 x).
    2. 미디어 II: 미디어 I(CHIR99021 최종 농도 6μM)에 CHIR99021(GSK3 억제제) 스톡의 적절한 부피를 추가합니다. 완전히 섞으세요.
    3. 미디어 III: 미디어 I(IWR-1 최종 농도 5μM)에 적절한 양의 IWR-1(Wnt 억제제) 스톡을 추가합니다. 완전히 섞으세요.
    4. 미디어 IV: 500mL의 RPMI1640을 B27 보충제(50x)와 혼합합니다. 완전히 섞으세요.
    5. 미디어 V: 500mL의 RPMI1640(포도당 없음)과 B27 보충제(50x)의 10mL를 혼합합니다. 완전히 섞으세요.
    6. 미디어 VI: 미디어 IV(CHIR99021 최종 농도 2 μM)에 CHIR99021 스톡의 적절한 부피를 추가합니다. 완전히 섞으세요.
  5. iPSC-CM 패세이징 미디어 준비
    1. 90mL의 미디어 IV(KSR 최종 농도: 10%)에 녹아웃 세럼 교체(KSR)를 10mL추가합니다. 잘 섞으세요.
  6. iPSC-CM 동결 미디어 준비
    1. KSR9mL에 1mL의 DMSO를 추가하고(최종 농도: 10% DMSO/90% KSR)를 넣고 잘 섞는다.
  7. 지하 멤브레인 매트릭스 중간 코팅 플레이트 준비
    1. 지하 멤브레인 매트릭스 배지를 하룻밤 사이에 4°C, 알리쿼트에서 1.5mL 튜브로 해동한다. DMEM/F12 미디어(1:250 희석)의 250mL에 이 매체의 1mL을 추가하고 이를 철저히 혼합합니다. 6웰 플레이트에 잘 당 2mL의 희석용액을 적용하고 사용하기 전에 30분 동안 37°C에서 5%CO2로 배양한다.

2. PBMC의 iPSC 리프로그래밍

  1. 혈액 샘플에서 PBMC를 분리합니다.
    1. 환자 혈액 샘플 (~5mL)을 수집하고 혈액 세포 분리 튜브로 전달합니다(재료 표참조). 10x반전으로 섞는다.
    2. 원심분리기는 실온에서 30분 동안 1,500 x g의 원심분리기.
    3. 튜브를 조심스럽게 꺼내 70% 에탄올로 스프레이하세요. 생물 안전 후드 에서 단핵 세포 (버피 층)를 방해하지 않고 캡을 제거하십시오. PBMC는 플라즈마 층 바로 아래에 희끄럼파 층에있을 것입니다(도 1A). 1000 μL 파이펫을 사용하여 전체 버피 층을 수집하고 15mL 원문 튜브로 옮김합니다.
    4. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 계산합니다. RT에서 25분 동안 300 x g로 튜브를 회전시하십시오.
    5. 상부체를 폐기합니다. DPBS 10mL (Ca2 +/ Mg2 + 무료)로 세척하십시오.
    6. RT에서 15 분 동안 300 x g에서 튜브를 회전합니다.
    7. 상부체를 제거합니다. 동결 매체의 1mL에서 세포 펠릿을 재중단(KSR + 10% DMSO). 유리병 당 1 x 106 세포를 만들기 위해 세포 밀도를 조정합니다.
    8. PBMC 극저온을 세포 동결 용기에 넣고 하룻밤 동안 -80°C로 보관하십시오. 액체 질소 탱크로 이송하여 다음 날 장시간 보관합니다.
  2. iPSC 리프로그래밍.
    1. 15mL 원물 튜브에 3mL의 혈액 보조 혈액 미디어를 추가합니다. 37°C 수조에서 PBMC를 해동하고 원물 튜브로 옮기다. RT에서 7 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
    2. 상부체를 폐기합니다. 완전한 혈액 매체로 PBMC를 재중단합니다. 24 개의 잘 조직 배양 플레이트 (지하 막 매트릭스 없음)의 두 개의 우물로 시드하십시오.
    3. 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오. 다음 날 부드럽게 이전 미디어의 절반을 제거 (0.5 ml) 신선한 완전 혈액 미디어의 0.5 mL을 추가합니다.
    4. 오래된 미디어의 절반을 새로 고침하여 격일로 미디어를 변경합니다.
    5. 일주일 후, 적극적으로 보충 혈액 미디어의 1 mL와 함께 잘 씻어 15 mL 원심 분리 튜브로 세포를 전송.
    6. 셀 번호를 계산합니다. 2 x 105 셀과 원심 분리기를 300 x g에서 7 분 동안 복용하십시오.
    7. 상부체를 폐기합니다. 완전한 혈액 매체의 300 μL로 세포를 재중단합니다. 제조업체의 지침에 따라 센다이 바이러스 재프로그래밍 벡터의 적절한 볼륨을 추가하여 트랜스페션을 수행합니다. 24웰 플레이트(지하 멤브레인 매트릭스 없음)의 한 우물로 옮기. 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
    8. 다음날 은 300 x g에서 7 분 동안 회전합니다. 상체를 제거하고 완전한 혈액 미디어의 2 mL에서 다시 중단하십시오. 지하 멤브레인 매트릭스로 미리 코팅 된 6 웰 플레이트의 우물로 옮김하십시오. 이것은 1 일 (D1)입니다.
    9. 다음날 접시를 만지지 마십시오.
    10. D3에서 이전 미디어의 1mL를 제거합니다. 보충 혈액 미디어의 1 mL을 추가합니다.
    11. D5에서 2.2.10 단계를 반복합니다.
    12. D7에서 이전 미디어의 1mL을 제거합니다. 완전한 E8 미디어의 1mL를 추가합니다.
    13. D8에서 반복 단계 2.2.12.
    14. D9에서 이전 미디어를 제거합니다. 완전한 E8 미디어의 2mL를 추가합니다. 완전히 다시 프로그래밍 된 세포는 식민지형성을 연결하고 시작할 것으로 예상됩니다.
    15. 매일 2mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고칩니다.
    16. 센다이 바이러스 트랜스퍼션 후 약 2주 후, 대형 iPSC 식민지가 나타나고 따기 위한 준비가 되어 있습니다.
    17. 후드의 스테레오현미경으로 iPSC 콜로니를 자르고 개별 식민지를 0.5mL의 iPSC 패시징 미디어로 미리 장전된 지하 막 매트릭스 코팅 24웰 플레이트로 이송합니다.
    18. iPSC 콜로니가 새로운 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트로 통과할 만큼 충분히 커질 때까지 매일 0.5mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고침하십시오.

3. 인간 iPSC 유지 보수 및 패시징

  1. 인간 iPSC가 90% 이상의 인플루엔자에 도달하면 오래된 미디어를 제거합니다. DPBS의 3mL한 번 헹구기.
  2. DPBS 솔루션에 0.5mM EDTA의 1mL를 추가합니다. 5-8 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  3. 포부로 EDTA를 제거합니다. iPSC 패싱 미디어 1mL을 추가합니다. 수동으로 iPSC를 빼내기.
  4. 단일 셀 서스펜션의 600-900 μL을 가지고 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트에 다시 판화 (희석 : 1:6 받는 사람은 1:10). 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  5. 매일 2mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고칩니다. iPSC 문화권은 일반적으로 3-4일 후에 합류에 도달합니다.

4. 화학적으로 정의된 심근세포 분화

  1. 문화 인간 iPSC는 완전한 E8 미디어에서 95 %의 컨실수 (3-4 일)까지.
  2. 이전 미디어를 제거합니다. CM 분화 미디어 II(RPMI1640의 6 μM CHIR+ B27 마이너스 인슐린 보충제)를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이것은 D0입니다. D1에 만지지 마십시오.
  3. D2에서 CM 분화 미디어 I (RPMI1640 + B27 마이너스 인슐린 보충제)의 2 mL로 대체하십시오.
  4. D3에서 CM 분화 미디어 III의 2mL로 교체하십시오 (RPMI1640에서 5 μM IWR-1 및 B27 마이너스 인슐린 보충제)로 바꿉니다. D4에 만지지 마십시오.
  5. D5에서 CM 분화 미디어 I의 2mL로 교체하십시오.
  6. D7에서 CM 차별화 미디어 IV(RPMI1640 + B27 보충제)의 2mL로 교체하십시오. 그 후, 매일 미디어를 새로 고칩니다.
  7. D11에서 수축 세포가 관찰될 때, CM 분화 미디어 V의 2mL로 대체하십시오(포도당 없음).
  8. D13에서 CM 차별화 미디어 V의 2mL로 교체하십시오.
  9. D15에서 CM 분화 미디어 IV의 2mL로 교체하십시오.
  10. D17-D21에서는 매일 CM 분화 미디어 IV2mL로 교체하십시오.

5. 통로 인간 ipPsC-CM

  1. 오래된 미디어를 제거하고 DPBS의 3mL로 세포를 헹구는 경우 한 번.
  2. CM 해리 솔루션 1mL(재료 표참조)를 6웰 플레이트의 각 웰에 적용합니다. 5-8 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  3. iPSC-CM을 격렬한 파이펫팅으로 기계적으로 단일 셀로 분리합니다.
  4. 세포를 15mL 원문 튜브로 옮킨다. CM 페이징 미디어 2mL(RMPI1640의 KSR 10% 플러스 B27 보충제)를 추가하여 CM 해리 솔루션을 중화합니다.
  5. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
  6. 상부체를 폐기합니다. CM 패세이징 미디어의 원하는 부피로 셀을 다시 중단합니다. 지하실 막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 그들을 씨앗. 인간 iPSC-CM은 통과 후 1-3 일 구타 재개.

6. 인간 ipC-CM 의 확장

  1. 린세 D10-12는 1회 6웰 플레이트의 각 웰에 대해 DPBS 3mL로 iPSC-CM을 1회 치고 있습니다. CM 해리 솔루션 1mL(5.2단계)를 추가합니다. 7-10 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 인큐베이션하십시오.
  2. iPSC-CM을 격렬한 파이펫팅으로 기계적으로 단일 셀로 분리합니다.
  3. 세포를 15mL 원문 튜브로 옮킨다. CM 페이징 미디어를 2mL에 추가하여 CM 해리 솔루션을 중화합니다.
  4. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
  5. 상부체를 폐기합니다. CM 패세이징 미디어의 적절한 부피로 세포를 다시 중단합니다. 파이펫을 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 100만 개의 iPSC-CM을 지하 막 매트릭스 코팅 10cm 접시에 넣습니다.
  6. 다음 날 오래된 미디어를 제거합니다. 심근세포 증식 매체 10mL를 추가합니다(미디어 VI: 2 μM CHIR99021). 매일 미디어를 변경합니다.
  7. iPSC-CM이 7-9일 간의 문화 이후 혼잡해지면 iPSC-CM의 추가 확장을 위한 통과 단계를 반복합니다.

7. 면역형광

  1. 면역 형광 염색 하기 전에, 씨앗 iPSC-CM 에 지하 막 매트릭스 코팅 커버립 24 웰 플레이트에 배치 되는 (파 종 밀도: 0.5-1 x 106 세포/mL). 적어도 4 일 동안 문화권에서 iPSC-CM을 유지관리합니다.
  2. DPBS 1mL을 사용하여 셀을 한 번 세척합니다.
  3. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 0.5mL를 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
  4. DPBS 의 1 mL를 사용하여 셀을 세척합니다. 한 번 반복합니다.
  5. 0.5mL00% 트리톤 X-100을 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
  6. DPBS 1mL로 두 번 세척합니다.
  7. DPBS(차단 솔루션)에 0.2% BSA의 0.5mL를 추가합니다. 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션.
  8. 차단 용액으로 희석된 1차 항체의 200 μL을 추가합니다(희석: 1:400-1:1000). 하룻밤 동안 4 °C에서 배양하십시오.
  9. 흔들림으로 3 분 동안 블로킹 용액의 0.5 mL을 사용하여 셀을 씻으시다. 두 번 반복합니다.
  10. 차단 용액에 희석된 이차 항체의 200 μL을 추가합니다. 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션.
  11. DPBS의 0.5 mL로 세 번 헹구고, 각각 3 분 동안 흔들어.
  12. DAPI를 가진 카운터스테인 핵 (1:2000 희석) RT에서 5 분 동안 배양.
  13. DPBS의 0.5 mL로 세 번 헹구는 세포.
  14. 커버스 에 셀을 마운트하여 5 μl의 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착합니다. 4 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.

8. 유동 세포측정 샘플 준비

  1. 한 번 DPBS의 3 mL로 인간의 iPSC-CM을 세척합니다.
  2. CM 해리 용액 1mL을 넣고 7-10분 동안 37°C에서 5% CO2로 배양합니다.
  3. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 세포를 빼내게 합니다. 스트레이너 캡을 통해 셀 서스펜션을 둥근 FACS 튜브로 전송합니다. FACS 튜브는 효소 활성을 중화시키기 위해 iPSC-CM 패세징 미디어(10% KSR)의 1mL로 미리 채워집니다.
  4. 300 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
  5. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하십시오. 고정/침투화 솔루션 250μL을 추가합니다(재료 표 참조). 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
  6. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300 x g에서 4분 동안 회전합니다.
  7. 상부체를 폐기합니다. 1x 파마/워시 버퍼에 희석된 1차 항체(1:200-1:500)를 100 μL을 추가합니다. 소용돌이는 4 °C에서 하룻밤 동안 잠깐 배양하고 배양합니다.
  8. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가하여 셀을 세척합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300 x g에서 4분 동안 회전합니다.
  9. 상부체를 폐기합니다. 희석된 이차 항체의 100 μL을 추가합니다(1:500-1:1,000). 소용돌이는 RT에서 1시간 동안 잠깐 배양하고 배양합니다. 이차 항체가 빛에 민감한 형광으로 결합되는 경우 빛으로부터 보호하십시오.
  10. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가하여 셀을 세척합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300g에서 4분 동안 회전합니다.
  11. 상부체를 폐기합니다. FACS 염색 버퍼(PBS/4% FBS)의 400 μL로 셀을 다시 중단합니다. FACS 기기에 적재될 때까지 4°C에 보관하십시오.

9. 실시간 qPCR

  1. 인간 iPSC-CM 문화에서 오래된 미디어를 제거합니다. 용해 버퍼500-700 μL을 추가하여 셀을 용해합니다. RT. Scape 셀 용해에서 3 분 동안 배양하고 1.5ml RNase가없는 튜브로 옮김하십시오. 총 RNA 추출을 즉시 진행하거나 -80 °C에 저장하십시오.
  2. 제조 자의 지시에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.
  3. RNA 농도를 측정하고 분광계에 의한 총 RNA의 품질을 평가합니다.
  4. cDNA 합성 키트를 사용하여 역전사 반응을 수행한다. RT 반응의 총 부피는 반응 혼합 4μL(5x), 역실 제1μL, 총 RNA 및 RNase 없는 물의 1μg을 포함하여 20 μL이다.
  5. 다음 프로토콜을 사용하여 열 사이클러에서 전체 RT 반응 믹스를 배양합니다: 5분 동안 25°C; 20 분 동안 46 °C; 95 °C 1 분; 4 °C에서 유지합니다.
  6. 핵이 없는 물을 사용하여 cDNA를 1:10까지 희석시. cDNA 템플릿 1μL, 프라이머/프로브 1μL, qPCR 마스터 믹스 10μL, 뉴클레아제 없는 물의 8μL을 혼합하여 실시간 qPCR 반응을 설정합니다.
  7. 실시간 PCR 시스템에서 실행됩니다. 사이클링 프로토콜은 50°C 2분(홀드), 95°C 10분(홀드), 95°C 15초, 60°C 1분, 40사이클반복이다.
  8. 각 샘플의 각 유전자에 대한 CT 값을 수집합니다. 상대적인 mRNA 풍부는 가사 유전자의 CT 값으로부터 표적 유전자의 CT 값을 빼서 계산된다. 상대적 유전자 발현은2-ΔΔCT 방법에 의해 분석된다.

10. 전셀 패치 클램프 레코딩

  1. iPSC-CM을 이전에 설명한 바와 같이 CM 해리 솔루션을 사용하여 단일 세포로 해리.
  2. 지하 막 매트릭스 코팅 커버립에 낮은 밀도에서 종자 세포. 미디어 IV에서 3-4 일 동안 문화하십시오.
  3. 수평 미세 전기 전체 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세 혈관에서 파이펫 (저항 0.9-1.5 MΩ)을 당깁니다.
  4. 티로드의 용액(pH=7.35)에서 세포를 배양합니다.
  5. 다음 화학물질로 구성된 전극 용액(pH=7.3)으로 파이펫 채우기: 120mM 아파르트산, 20mM KCl, 2m MM MgCl2,5m HEPES, 10mM NaCl, 5m EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14m 인포크레아틴, 4m K-ATP 및 2mM 크레아틴 인포키나아제.
  6. 1.5-2 확장기 임계값 5 ms 전류 펄스를 사용하여 현재 클램프 모드에 셀을 배치합니다.
  7. 마이크로 전극 증폭기와 소프트웨어 기반 인수 보드를 사용하여 실행 잠재력(AP)을 기록합니다.

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Representative Results

PBMC에서 인간 iPSC 리프로그래밍
7일 동안 완전한 혈액 매체를 통해 사전 배양 후, PBMC는 눈에 보이는 핵과 세포질(도1B)으로커져 바이러스 이식에 대한 준비가 되었음을 나타냅니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 인자와 의전 후, PBMC는 또 다른 주 동안 후생 유전학 재프로그래밍 과정을 받게됩니다. 전형적으로, 우리는 1 x 105 PBMC의 트랜스퍼션에서 30-50 iPSC 식민지를 얻고 재프로그래밍 효율은 0.03%-0.05%입니다. 완전히 다시 프로그래밍된 세포는 완전한 E8미디어(그림 1C)에도입될 때 콜로니 형성을 부착하고 시작합니다. 이 초기 iPSC 식민지는 또 다른 7 일 동안 확장 된 다음 기계적으로 잘라 개별적으로 포착됩니다. 각 iPSC 식민지는 개별 iPSC 라인을 확립하기 위해 6 웰 플레이트의 하나의 우물로 전송됩니다. 4-5구절 이후에, iPSC 식민지는 거의 분화된 세포로 순수해질것이다(도 1D). 이 단계에서, iPSC 식민지에 있는 세포의 대부분은 OCT4와 NANOG 양성(그림 1E)그들의 pluripotency를 보여주는. 안정적인 iPSC 라인은 다섯 번째 통로에 의해 확립된다.

심장 분화
심장 분화 프로토콜은 도 1F에묘사된다. 심장 분화는 iPSC가 적어도 10개의 통로를 위해 유지될 때 시작됩니다. CHIR99021이 적용될 때 iPSC 인플루엔티지의 정도가 중요합니다. 세포 밀도는 90% 이상 수렴하지만 컨서적에는 적용되지 않습니다. iPSC 식민지가 너무 혼잡해지면, 그들은 지시된 심근세포 분화 효율에 부정적인 영향을 미칠 자발적인 분화를 시작할 것입니다. 박동 심근세포는 일반적으로 차분(비디오1)의12일 후에 관찰된다. 구타의 발병이 발생하는 날짜는 다양하며 사용 중인 iPSC 라인에 따라 다릅니다. 포도당 기아 및 투석 후, iPSC-CM은 자발적인구타(비디오 2)및 상호 작용된 심장 트로포닌 T(TNNT2) 및 α-액티닌(도1G-H)과정렬된 사코메레 구조를 보여준다. 또한, iPSC-CM의 순도가 높고, 세포의 93% 이상이 FACS분석(도 1I)에도시된 바와 같이 TNNT2+이다.

iPSC-CM은 성인 심근세포에 비해 상대적으로 미숙하지만, 전신 패치 클램프(그림2A,B)로측정된 심실 및 심방과 같은 작용 잠재력을 보여줍니다. 전형적인 심장 분화에서, 일 30 iPSC-CM은 상기 분화 프로토콜(도1F)을사용하여 심실, 심방-및 노달과 같은 아류형의 혼합물이다. 상이한 분화 프로토콜은 세포 혈통결정(10)동안 뚜렷한 신호 경로 활성화로 인해 심근구 세포 아형의 다양한 백분율을 산출한다. 심실 CM은 MYL2(MLC2v, 도 2D)로표시되는 반면 심방 iPSC-CM은 NR2F2(COUP-TFII, 그림 2E)로표시됩니다. 이러한 마커는 초기 단계보다 더 성숙한 iPSC-CM(>D30)으로 높게 표현됩니다.

Wnt 활성화를 통해 iPSC-CM 확장
포유류에서 성인 심근세포는 자기 재생을 위해 적극적으로 분열하지 않습니다. 이 현상은 또한 인간 iPSC-CM를 위해 일어납니다. 일단 D30 을 넘어 성숙, iPSC-CM의 세포 분열은 드문 이벤트, 따라서 임상 및 산업 수준의 대량 생산에 대 한 그들의 능력을 제한. 배아 심근세포 증식 시 발달 환경을 모방하기 위해 CHIR99021에 의한 Wnt 통로를 활성화하여 초기 iPSC-CM의 곱셈을 자극합니다. D12-14 iPSC-CM(포도당 박탈에 의한 정제 후)은 2μM CHIR99021의 존재시 저밀도로 시드된다. Wnt 활성화는 iPSC-CM의 세포 분열을 자극하고 G1 단계를 통해 전진하기 위하여 세포 주기를 밀어낼 수 있는 Cyclin D1(도 3A)와같은 세포 주기 조절자의 발현을 촉진합니다. 흥미롭게도, CHIR99021은 컨트롤(도 3B)에비해 2 개의 구절에 대한 초기 iPSC-CM의 강력한 확산을 가능하게합니다. 그러나, iPSC-CM의 증식 능력은 배아 심장 발달 도중 제한적이고 잘 통제된 심장 증식과 일치하는 광범위한통로(도 3B)로감소합니다. 또한, CHIR99021은 30일 이상 분화하고 안정적인 사코머 구조를 개발할 때 보다 성숙한 iPSC-CM의 확장을 자극할 수 있는 것으로 보이지 않는다.

Figure 1
그림 1: 인간 iPSC 재프로그래밍 및 심근세포 분화. (A)환자 혈액 샘플의 분리 후 PBMC 층을 보여주는 회로도. (B)확대 된 PBMC는 형질 전환에 대한 준비가되어 있습니다. (C)초기 인간 iPSC 식민지. (D)5번 통로에서 확립된 iPSC 라인. (E)인간 iPSC는 10월4일(녹색) 및 NANOG(빨간색)에 대해 양성이다. 핵은 DAPI(파란색)에 의해 반성된다. (F)심근세포 분화 프로토콜의 개요. (G-H) iPSC-CM의 Sarcomere 구조는 TNNT2 (녹색) 및 α 액틴 (빨간색)에 대한 항체를 사용하여 염색하는 면역 형광에 의해 드러난다. 핵은 DAPI(파란색)에 의해 반성된다. (I)TNNT2에 대한 항체를 이용한 iPSC-CM의 FACS 분석. 스케일 바: 200 μm(B-D),50 μm(E 및 G)및 20 μm(H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 인간 iPSC-CM의 심근세포 아류형(A-B) 심실과 같은(A)및 심방과 같은(B)iPSC-CM에 대한 대표적인 작용 전위 기간. (C)인간 iPSC-CM에서 심실, 심방 및 무달과 같은 특수형의 대표적인 백분율. (D-E) D30 iPSC-CM은 심실 심근 세포 마커 MYL2(D)및 심방 마커 NR2F2(E)에대한 항체로 염색된다. 세포는 동시에 TNNT2 항체로 염색된다. 핵은 DAPI(파란색)에 의해 반성된다. 스케일 바: 50 μm(D-E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: Wnt 활성화에 의한 인간 iPSC-CM의 확장. (A)CYclin D1 양성 iPSC-CM의 백분율은 CHIR99021의 존재에서 증가한다. 세포는 TNNT2(빨간색) 및 사이클린 D1(녹색)에 대한 항체로 이중 염색된다. 핵은 DAPI(파란색)에 의해 반성된다. (B)처음 3개 구절에서 CHIR99021의 유무에 관계없이 인간 iPSC-CM의 팽창 시 세포 수가 변화한다. Y축은 셀 수 접기 변화를 나타낸다. CHIR99021은 초기 iPSC-CM의 강력한 확산을 자극합니다. 스케일 바: 50 μm(A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1. 18일째에 인간 iPSC-CM을 이겼습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2. 신진 대사 정화 후 25 일째에 인간 iPSC-CM을 때리기. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

iPSC 재프로그래밍 하는 동안, 그들은 명확한 핵과 세포질로 확대 될 때까지 1 주일 동안 PBMC를 배양하는 것이 중요합니다. PBMC가 증식하지 않기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션에 적합한 세포 수는 성공적인 iPSC 재프로그래밍에 중요합니다. PBMC의 세포 수, 감염의 복합성 (MOI) 및 바이러스의 titer는 최적의 트랜스유도 결과에 도달하기 위하여 고려되고 조정되어야 합니다. 심장 분화의 경우 초기 시드 밀도는 CHIR99021이 투여되는 날에 iPSC가 90% 이상 수렴하는 데 매우 중요합니다. 한편으로는, iPSC가 심장 분화시에 덜 수렴되는 경우에, CHIR99021는 유독하고 실질적인 세포 죽음으로 이끌어 낼 것입니다. 한편, iPSC가 컨서우리(confluent)인 경우, 즉방향 심장 분화의 효율성을 저해하는 자발적인 분화를 받게 됩니다. 초기 iPSC-CM의 확장을 위해 타이밍과 심근세포 품질을 고려해야 합니다. 초기 iPSC-CM은 심근세포의 순도가 충분히 높을 때만 견고하게 증식할 수 있습니다. 배양에 있는 기존 비 심근세포는 또한 초기 iPSC-CM의 증식에 부정적인 영향을 미칠 CHIR99021 처리에 응하여 증식할 수 있습니다. 또한, 20일까지 심근세포 확장을 자극하는 것이 중요합니다. iPSC-CM이 30일을 지나면 강력한 분할을 재개하기가 어려울 것입니다.

인간 iPSC는 처음에 레트로바이러스 매개 형질1,2를통해 진피 및 폐 섬유아세포로부터 유래되었다. 환자 iPSC의 임상 번역의 진행을 방지하는 이러한 재프로그래밍 방법에는 두 가지 주요 문제가 있습니다: 1) 레트로바이러스는 호스트 게놈에 통합되므로 잠재적인 유전 돌연변이를 도입한다; 2) 환자 유래 섬유아세포는 많은 환자가 감소할 수 있는 피부 생검을 요구합니다. 이 프로토콜에서는 상용 비통합 센다이바이러스(23)와 PBMC를 사용하여 환자 iPSC를 강력하게 도출하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 iPSC는 외인성 리프로그래밍 벡터가 없으며 자체 갱신 및 흉부로 무기한으로 유지할 수 있습니다. 또한, 환자 혈액 샘플은 임상 실험실에서 쉽게 수집됩니다. 우리의 프로토콜은 다재다능하며 대규모 리포지토리 및 임상 번역(24)에대한 환자 및 질병 별 iPSC의 대량 생산에 사용할 수 있습니다.

강력한 심근세포 분화는 인간 iPSC로부터 심장 분화 시 특정 신호 경로의 순차적 변조에 의해 달성됩니다. 심장 사양 및 증식에 관여하는 주요 경로는 Wnt, BMP, 액티빈, NOTCH, VEGF 및 망막산(RA) 10,12를포함한다. 여기서 우리는 작은 화학 물질에 의한 Wnt 신호의 순차적 변조에 의해 효율적인 심장 분화 프로토콜을 제시합니다 : CHIR99021에 의한 첫 번째 활성화 및 IWR-113,14에의한 억제. 소형 화학 물질은 안정적이며 성장 인자를 사용하는 화학 물질에 비해 일관된 차별화 결과를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 생성된 대부분의 iPSC-CM은 심실 같이 심근같이 심근세포입니다, 심방 같이 심방 같이 세포와 혼합합니다. 아유형 특이적 심근세포의 정밀생성은 나중에 분화단계10,12를미세 조정하여 달성된다. 예를 들어, IWR-1 치료 직후 RA를 첨가하면 심방과 같은 심근세포의 비율이 높은 반면 RA 억제는 심실과 같은 iPSC-CMs18,22의생성을 촉진한다. 분화의 후반 단계에서 Wnt 신호 활성화는 환자 특정 생물학적 심박동기 세포의 생성을 위해 유망한 nodal 과 같은 심근세포19,21에심장 선조 세포의 유도를 촉진합니다.

인간 iPSC-CM은 미숙하고 증식능력(25)이제한되어 있다. 배아 심장 발달 도중, 증식은 감소하는 동안 성숙이 진행됩니다. iPSC-CM이 배아 심근세포 확장을 반영하는 견고한 증식을 위해 자극될 수 있을 때 좁은 창이 있습니다. 여기서 우리는 Wnt 활성제 CHIR99021을 사용하여 제한된 기간 동안 초기 iPSC-CM의 확산을 촉진하며, 이는 최근 보고서17과일치합니다. Wnt 신호 전달 경로는 NOTCH 및 하마26,27과같은 여러 업스트림 경로를 가진 크로스토크를 통해 심근구 증식에 영향을 미친다는 추측이다. NOTCH 신호는 심근세포 증식을 촉진하는 반면 하마 통로는 심장 성장과 심장 크기28,29,30을제한한다. NOTCH와 Hippo 사이의 상호 작용이 다운스트림 Wnt 활동을 결정하고 적절한 정도의 심장 증식을 미세 조정하는 방법은 아직 알려지지 않았습니다. 우리의 프로토콜은 저부가소성 좌심심장증후군(HLHS) 및 폐 동맥 중격(PA-IVS)과 같은 심실 심근세포의 저형성증에 기인하는 선천성 심장 결함의 질병 메커니즘을 연구하기 위하여 심근세포 증식을 위한 흥미로운 모형을 제공했습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 미국 심장 협회 (AHA) 경력 개발 상 18CDA34110293 (M-T.Z.), 추가 벤처 AVIF 및 SVRF 상 (M-T.Z.), 국립 보건원 (NIH /NHLBI) 보조금 1R01HL1HL13225 (1R01HL132520)에 의해 지원되었다. 밍타오 자오 박사는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 스타트업 기금으로도 지원받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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