Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.
Abstract
A geração de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue tem atraído enorme interesse em medicina de precisão em doenças cardiovasculares. A diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) é modulada por vias de sinalização definidas que são essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário. Inúmeros métodos de diferenciação cardíaca em plataformas 2D e 3D foram desenvolvidos com várias eficiências e rendimento de cardiomiócitos. Isso tem intrigado investigadores fora do campo, pois a variedade desses métodos pode ser difícil de seguir. Aqui apresentamos um protocolo abrangente que elabora geração robusta e expansão de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs). Primeiro descrevemos um protocolo de reprogramação iPSC de alta eficiência a partir da amostra de sangue de um paciente usando vetores de vírus Sendai não integração. Em seguida, detalhamos um pequeno método de diferenciação de monocamadas mediada por moléculas que pode produzir robustamente cardiomiócitos de batida da maioria das linhas iPSC humanas. Além disso, um protocolo escalável de expansão do cardiomiócito é introduzido usando uma pequena molécula (CHIR99021) que poderia expandir rapidamente cardiomiócitos derivados do paciente para aplicações de grau industrial e clínico. No final, são retratados protocolos detalhados para identificação molecular e caracterização eletrofisiológica desses iPSC-CMs. Esperamos que este protocolo seja pragmático para iniciantes com conhecimento limitado sobre desenvolvimento cardiovascular e biologia de células-tronco.
Introduction
A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem revolucionou a medicina cardiovascular moderna1,2. IPSCs humanos são capazes de se auto-renovar e gerar todos os tipos de células no coração, incluindo cardiomiócitos, células endividadas, células musculares lisas e fibroblastos cardíacos. Cardiomiócitos derivados do paciente iPSC (iPSC-CMs) podem servir como recursos indefinidos para modelagem de doenças cardiovasculares geneticamente hereditárias (DCV) e testes de segurança cardíaca para novos medicamentos3. Em particular, os pacientes iPSC-CMs estão bem preparados para investigar etiologias genéticas e moleculares de DCV que são derivadas de defeitos em cardiomiócitos, como síndrome de QT longa4 e cardiomiopatia dilatada (DCM)5. Combinados com a edição de genoma mediada pelo CRISPR/Cas9, os pacientes iPSC-CMs abriram uma avenida sem precedentes para entender a complexa base genética de DCV, incluindo defeitos cardíacos congênitos (CHDs)6,7,8. Os iPSC-CMs humanos também apresentaram potenciais para servir como fontes de células autólogas para repor o miocárdio danificado durante um ataque cardíaco9. Nos últimos anos, tornou-se primordial gerar iPSC-CMs humanos de alta qualidade com subtipos definidos (atrial, ventricular e nodal) para regeneração cardíaca e teste de drogas10.
A diferenciação cardíaca dos iPSCs humanos tem sido muito avançada na última década. Os métodos de diferenciação passaram da diferenciação espontânea baseada no corpo embrionário (EB) para a diferenciação cardíaca quimicamente definida e direcionada11. As principais moléculas de sinalização essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário, como Wnt, BMP, Nodal e FGF são manipuladas para melhorar a diferenciação de cardiomiócitos dos iPSCs humanos10,12. Avanços significativos incluem modulação sequencial de sinalização Wnt (ativação seguida de inibição) para geração robusta de cardiomiócitos a partir de iPSCs humanos13,14. Receitas de diferenciação cardíaca quimicamente definidas têm sido exploradas para facilitar a produção em larga escala de cardiomiócitosbatendo 15,16, que têm potencial para serem atualizados para a produção de nível industrial e clínico. Além disso, a expansão robusta dos IPSC-CMs humanos precoces é alcançada pela exposição à ativação constitutiva do Wnt utilizando um pequeno produto químico (CHIR99021)17. Mais recentemente, cardiomiócitos específicos do subtipo são gerados através da manipulação de vias de sinalização de ácido retinóico (RA) e Wnt em janelas específicas de diferenciação durante o compromisso de linhagem cardiomiocócica dos iPSCs humanos18,19,20,21,22.
Neste protocolo, detalhamos um procedimento de trabalho para geração robusta e proliferação de CMs humanos originários de células mononucleares sanguíneos periféricos do paciente. Apresentamos protocolos para 1) reprogramação de PBMCs humanos para iPSCs, 2) geração robusta de cardiomiócitos pulsantes de iPSCs humanos, 3) expansão rápida de IPSC-CMs precoces, 4) caracterização molecular de iPSC-CMs humanos e 5) medição eletrofisiológica de iPSC-CMs humanos no nível unicelular por remendo. Este protocolo abrange os procedimentos experimentais detalhados na conversão de células sanguíneas do paciente em cardiomiócitos.
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Protocol
Os protocolos experimentais e o consentimento informado para os seres humanos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Nacional da Criança.
1. Preparação de meios de cultura celular, soluções e reagentes
- Prepare a mídia PBMC
- Misture 20 mL de mídia cultural basal PBMC (1x) e 0,52 mL de suplemento. Adicione 20 μL de SCF e FLT3 cada (concentração de estoque: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 e EPO cada (concentração de estoque: 100 μg/mL) e 200 μL de alternativa L-glutamina (100x). Misture-os bem. Filtrar em uma coifa estéril usando uma unidade de filtro de 0,22 μm. Nomeie isso como Mídia de Sangue Completo.
- Misture 20 mL de mídia de cultura basal PBMC (1x) e 0,52 mL do Suplemento. Adicione 200 μL de alternativa L-glutamina (100x). Misture-os bem. Filtrar usando uma unidade de filtro de 0,22-μm. Nomeie isso como Supplement Blood Media.
- Prepare a mídia E8 completa
- Misture 500 mL de mídia basal E8 e 10 mL de suplemento E8 (descongelado durante a noite a 4 °C) para fazer mídia E8 completa. Equilibre-se à temperatura ambiente (RT) antes de usar.
- Prepare a mídia de passagem iPSC
- Adicione 40 μL de inibidor de rocha Y-27632 (diluição de 1:5.000, concentração de estoque: 10 mM) a 200 mL de mídia E8 completa. Misture bem. Equilibre-se ao RT antes de usar.
- Prepare mídia de diferenciação de cardiomiocócito
- Mídia I: Misture 500 mL de RPMI1640 com 10 mL de B27 menos suplemento de insulina (50x).
- Mídia II: Adicione um volume apropriado de estoque CHIR99021 (inibidor GSK3) ao Media I (quir99021 concentração final de 6 μM). Homogeneizar.
- Mídia III: Adicione um volume apropriado de estoque IWR-1 (inibidor Wnt) à Media I (Concentração final IWR-1 de 5 μM). Homogeneizar.
- Mídia IV: Mix 500 mL de RPMI1640 com 10 mL de suplemento B27 (50x). Homogeneizar.
- Mídia V: Misture 500 mL de RPMI1640 (sem glicose) com 10 mL de suplemento B27 (50x). Homogeneizar.
- Mídia VI: Adicione um volume apropriado de estoque CHIR99021 à Media IV (quir99021 concentração final de 2 μM). Homogeneizar.
- Prepare a mídia de passagem iPSC-CM
- Adicionar 10 mL de Substituição de Soro De Nocaute (KSR) a 90 mL de Media IV (concentração final de KSR: 10%). Misture bem.
- Prepare a mídia de congelamento iPSC-CM
- Adicione 1 mL de DMSO a 9 mL de KSR (concentrações finais: 10% DMSO/90% KSR) e misture bem.
- Prepare matrículas de matriz de membrana de porão de médio porte
- Descongele a matriz da membrana do porão a 4 °C durante a noite e aliquot em tubos de 1,5 mL. Adicione 1 mL deste meio a 250 mL de mídia DMEM/F12 (diluição de 1:250) e misture-os completamente. Aplique 2 mL da solução diluída por poço em uma placa de 6 poços e incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 30 minutos antes de usar.
2. reprogramação iPSC de PBMCs
- Separe os PBMCs das amostras de sangue.
- Coletar amostras de sangue do paciente (~5 mL) e transferir-se para tubos de separação de células sanguíneas (ver Tabela de Materiais). Misture invertendo 10x.
- Centrifugar a 1.500 x g por 30 min a temperatura ambiente.
- Retire os tubos com cuidado e pulverize com 70% de etanol. Sob um capuz biossegurança, remova as tampas sem perturbar as células mononucleares (camada buffy). Os PBMCs estarão em uma camada esbranquiçada logo abaixo da camada de plasma(Figura 1A). Colete toda a camada buffy usando uma pipeta de 1000 μL e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
- Conte o número do celular usando um contador automático de células. Gire o tubo a 300 x g por 25 min no RT.
- Descarte o supernatante. Lave com 10 mL de DPBS (Ca2+/Mg2+ grátis).
- Gire o tubo a 300 x g por 15 min no RT.
- Remova o supernatante. Pelotas de célula resuspend em 1 mL da mídia de congelamento (KSR mais 10% DMSO). Ajuste a densidade celular para fazer 1 x 106 células por frasco.
- Coloque os criovias PBMC em um recipiente de congelamento celular e mantenha -80 °C durante a noite. Transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longa data no dia seguinte.
- reprogramação do iPSC.
- Adicione 3 mL de mídia de sangue suplemento em um tubo cônico de 15 mL. Descongele os PBMCs em banho-maria de 37 °C e transfira-os para um tubo cônico. Gire a 300 x g por 7 min no RT.
- Descarte o supernatante. Resuspend PBMCs com mídia de sangue completa. Semeou-os em dois poços de 24 placas de cultura de tecido bem (sem matriz de membrana do porão).
- Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, remova suavemente metade da mídia antiga (0,5 ml) e adicione 0,5 mL de mídia de sangue completa fresca.
- Mude a mídia a cada dois dias, refrescando metade da velha mídia.
- Depois de uma semana, lave agressivamente o poço com 1 mL de Supplement Blood Media e transfira células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Conte o número do celular. Pegue 2 x 105 células e centrífuga a 300 x g por 7 min.
- Descarte o supernatante. Células resuspend com 300 μL de Mídia sanguínea completa. Realize a transfecção adicionando volume apropriado de vetores de reprogramação do vírus Sendai de acordo com as instruções do fabricante. Transfira-os para um poço de uma placa de 24 poços (sem matriz de membrana do porão). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte gire a 300 x g por 7 min. Remova o supernatante e resuspende em 2 mL de Mídia sanguínea completa. Transfira para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestida com matriz de membrana do porão. Este é o dia 1 (D1).
- Não toque no prato no dia seguinte.
- Na D3, remova 1 mL da mídia antiga. Adicione 1 mL de mídia sanguínea suplementar.
- Repita o passo 2.2.10 em D5.
- Na D7, remova 1 mL da mídia antiga. Adicione 1 mL de mídia E8 completa.
- Em D8, repita a etapa 2.2.12.
- Na D9, remova a mídia antiga. Adicione 2 mL de mídia E8 completa. Espera-se que células completamente reprogramadas se conectem e comecem a formar colônias.
- Atualize com 2 mL de mídia E8 completa todos os dias.
- Cerca de 2 semanas após a transdução do vírus Sendai, grandes colônias iPSC aparecerão e estarão prontas para serem colhia.
- Corte colônias iPSC sob um estereótipo no capô e transfira colônias individuais para uma placa de 24 poços revestida de matriz de porão pré-carregada com 0,5 mL de mídia de passagem iPSC.
- Atualize com 0,5 mL de mídia E8 completa todos os dias até que as colônias iPSC cresçam o suficiente para passar para uma nova placa de 6 poços revestidos de matriz de membrana de porão.
3. Manutenção e passagem do iPSC humano
- Quando os iPSCs humanos atingem mais de 90% de confluência, remova a mídia antiga. Enxágüe com 3 mL de DPBS uma vez.
- Adicione 1 mL de 0,5 mM EDTA na solução DPBS. Incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 5-8 min.
- Remova o EDTA por aspiração. Adicione 1 mL de mídia de passagem iPSC. Desalojar manualmente iPSCs.
- Pegue 600-900 μL de suspensão de célula única e reemplaque-os em uma placa de 6 poços revestida de matriz de porão (diluição: 1:6 a 1:10). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite.
- Atualize com 2 mL de mídia E8 completa todos os dias. As culturas iPSC geralmente atingem confluência após 3-4 dias.
4. Diferenciação de cardiomiócitos quimicamente definida
- Cultura iPSCs humanos em mídia E8 completa até 95% confluente (3-4 dias).
- Remova a mídia antiga. Adicione 2 mL de diferenciação CM Media II (6 μM CHIR em RPMI1640 mais suplemento de insulina B27 menos) a cada poço de uma placa de 6 poços. Este é o D0. Não toque na D1.
- Em D2, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media I (RPMI1640 mais B27 menos suplemento de insulina).
- Em D3, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media III (5 μM IWR-1 em RPMI1640 mais suplemento de insulina B27 menos). Não toque na D4.
- Em D5, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media I.
- Em D7, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV (RPMI1640 mais suplemento B27). Depois disso, refresque a mídia dia não.
- Em D11 quando as células de contração são observadas, substitua por 2 mL de diferenciação cm Media V (sem glicose).
- Na D13, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media V.
- Em D15, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV.
- Em D17-D21, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV a cada dois dias.
5. Passagem de iPSC-CMs humanos
- Remova a mídia antiga e enxágue células com 3 mL de DPBS uma vez.
- Aplique 1 mL de solução de dissociação cm (ver Tabela de Materiais) em cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 5-8 min.
- Dissociar mecanicamente iPSC-CMs em células únicas por tubulação vigorosa.
- Transfira células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 2 mL de mídia de passagem cm (10% KSR em RMPI1640 mais suplemento B27) para neutralizar a solução de dissociação cm.
- Gire a 300 x g por 5 min no RT.
- Descarte o supernatante. Células resuspend com um volume desejado de mídia de passagem cm. Semeou-os em uma membrana de porão placa/prato revestido de matriz. IPSC-CMs humanos retomam a batida de 1-3 dias após a passagem.
6. Expansão de iPSC-CMs humanos
- Enxágüe D10-12 batendo iPSC-CMs com 3 mL de DPBS para cada poço de uma placa de 6 poços uma vez. Adicione 1 mL de solução de dissociação cm (Passo 5.2). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C por 7-10 min.
- Dissociar mecanicamente iPSC-CMs em células únicas por tubulação vigorosa.
- Transfira células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 2 mL de mídia de passagem cm para neutralizar a solução de dissociação cm.
- Gire a 300 x g por 5 min no RT.
- Descarte o supernatante. Células resuspend com um volume apropriado de mídia de passagem cm. Pipeta para cima e para baixo para fazer suspensão de célula única. Semente um milhão de iPSC-CMs em um prato de 10 cm revestido de matriz de membrana de porão.
- No dia seguinte, remova a velha mídia. Adicionar 10 mL de mídia de proliferação de cardiomiócitos (Mídia VI: 2 μM CHIR99021). Mude a mídia dia não.
- Quando os iPSC-CMs se tornarem confluentes após 7-9 dias de cultura, repita o passo de aprovação para uma maior expansão dos iPSC-CMs.
7. Imunofluorescência
- Antes da coloração da imunofluorescência, as sementes iPSC-CMs em tampas revestidas de matriz de membrana do porão que são colocadas em uma placa de 24 poços (densidade de semeadura: 0,5-1 x 106 células/mL). Manter iPSC-CMs na cultura por pelo menos 4 dias.
- Lave células usando 1 mL de DPBS uma vez.
- Adicione 0,5 mL de paraformaldeído de 4% (PFA) e incubar por 15 min na RT.
- Lave as células usando 1 mL de DPBS. Repita uma vez.
- Adicione 0,5 mL de 0,1% Triton X-100 e incubar por 20 min na RT.
- Lave com 1 mL de DPBS duas vezes.
- Adicionar 0,5 mL de 0,2% BSA em DPBS (solução de bloqueio). Incubar na RT por 1 h.
- Adicionar 200 μL de anticorpo primário diluído com solução de bloqueio (diluição: 1:400-1:1000). Incubar a 4 °C durante a noite.
- Lave as células usando 0,5 mL de solução de bloqueio por 3 minutos com agitação. Repita duas vezes.
- Adicione 200 μL de anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio. Incubar na RT por 1 h.
- Enxágüe células três vezes com 0,5 mL de DPBS, cada uma por 3 minutos com agitação.
- Núcleos de contra-retenção com DAPI (diluição de 1:2000) e incubam por 5 min na RT.
- Enxágüe células três vezes com 0,5 mL de DPBS.
- Monte células nas tampas em um slide de microscópio usando 5 μl de mídia de montagem. Armazene a 4 °C e proteja contra a luz.
8. Preparação da amostra de citometria de fluxo
- Lave iPSC-CMs humanos com 3 mL de DPBS uma vez.
- Adicione 1 mL de solução de dissociação cm e incuba em 5% de CO2 a 37 °C por 7-10 min.
- Desalojar células usando uma pipeta de 1.000-μL. Transfira a suspensão celular para um tubo FACS redondo através de uma tampa de filtro. O tubo FACS é pré-preenchido com 1 mL de mídia de passagem iPSC-CM (10% KSR) para neutralizar a atividade enzimática.
- Gire a 300 x g por 5 min.
- Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular. Adicione 250 μL de solução de fixação/permeabilização (ver Tabela de Materiais). Incubar por 20 min a 4 °C.
- Adicione 1 mL de perm/tampão de lavagem. Vórtice brevemente e gire a 300 x g por 4 min.
- Descarte o supernatante. Adicione 100 μL de anticorpos primários diluídos (1:200-1:500) em 1x Perm/Wash buffer. Vórtice brevemente e incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave as células adicionando 1 mL de tampão Perm/Wash. Vórtice brevemente e gire a 300 x g por 4 min.
- Descarte o supernatante. Adicione 100 μL de anticorpos secundários diluídos (1:500-1:1.000). Vórtice brevemente e incubar na RT por 1 h. Proteja-se da luz se os anticorpos secundários forem conjugados com fluorescência sensível à luz.
- Lave as células adicionando 1 mL de perm/tampão de lavagem. Vórtice brevemente e girar em 300g por 4 min.
- Descarte o supernatante. Células resuspend com 400 μL de tampão de coloração FACS (PBS/4% FBS). Armazene a 4 °C até carregar em um instrumento FACS.
9. QPCR em tempo real
- Remova a mídia antiga na cultura iPSC-CM humana. Adicione 500-700 μL de tampão de lise às células de lise. Incubar por 3 min no RT. Scape celular lysate e transferir para um tubo de 1,5 ml RNase-free. Proceda à extração total de RNA imediatamente ou armazene a -80 °C.
- Isole o RNA total usando um kit de extração de RNA seguindo as instruções do fabricante.
- Meça a concentração de RNA e avalie a qualidade do RNA total por um espectotômetro.
- Realize a reação de transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA. O volume total de reação de RT é de 20 μL incluindo 4 μL de mix de reação (5x), 1 μL de transcriptase reversa,1 μg de RNA total e água sem RNase.
- Incubar a mistura completa de reação RT em um cicloviário térmico usando o seguinte protocolo: 25 °C por 5 min; 46 °C por 20 min; 95 °C por 1 min; mantenha a 4 °C.
- Diluir o CDNA por 1:10 usando água sem nuclease. Configure a reação qPCR em tempo real misturando 1 μL de modelo cDNA, 1 μL de primers/sonda, 10 μL de mix mestre qPCR e 8 μL de água sem nuclease.
- Execute em um sistema PCR em tempo real. O protocolo de ciclismo é de 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 seg, 60 °C 1 min, repita para 40 ciclos.
- Coletar valores CT para cada gene em cada amostra. A abundância relativa de mRNA é calculada subtraindo o valor CT do gene-alvo do valor CT de um gene de limpeza. A expressão genética relativa é analisada pelo método 2-ΔΔCT.
10. Gravação de grampo de remendo de célula inteira
- Dissociar iPSC-CMs em células únicas usando a solução de dissociação cm como descrito anteriormente.
- Células de sementes em baixa densidade em deslizamentos revestidos de matriz de membrana porão. Cultuá-los por 3-4 dias na Mídia IV.
- Puxe pipetas (resistência 0,9-1,5 MΩ) de capilares de vidro borossilicato usando um puxador de microeletrídro horizontal.
- Incubar células na solução de Tyrode (pH=7,35).
- Enchir pipetas com solução de eletrodo (pH=7.3) compostas dos seguintes produtos químicos: ácido aspático de 120 mM, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatina, 4 mM K-ATP e 2mM creatine phosphokinase.
- Coloque as células no modo de fixação atual usando um pulso de corrente de 1,5-2 diastólico de 5 ms a 1 Hz.
- Registrar potenciais de ação (APs) usando um amplificador de microeletrodo e uma placa de aquisição orientada por software.
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Representative Results
Reprogramação do iPSC humano dos PBMCs
Após a pré-cultura com mídia sanguínea completa por 7 dias, os PBMCs tornam-se grandes com núcleos visíveis e citoplasma (Figura 1B),indicando que estão prontos para a transfecção do vírus. Após a transfecção com os fatores de reprogramação do vírus Sendai, os PBMCs passarão por um processo de reprogramação epigenética por mais uma semana. Normalmente, temos 30-50 colônias iPSC da transfecção de 1 x 105 PBMCs e a eficiência de reprogramação é de 0,03%-0,05%. Células completamente reprogramadas anexarão e começarão a formar colônias quando forem introduzidas na mídia E8 completa(Figura 1C). Estas primeiras colônias iPSC são expandidas por mais 7 dias e, em seguida, mecanicamente cortadas e captadas individualmente. Cada colônia iPSC é transferida para um poço de uma placa de 6 poços para estabelecer linhas iPSC individuais. Após 4-5 passagens, as colônias iPSC se tornarão puras com pouquíssimas células diferenciadas ao redor(Figura 1D). Nesta fase, a maioria das células nas colônias iPSC são OCT4 e NANOG positivo(Figura 1E),demonstrando sua pluripotência. As linhas estáveis do IPSC são estabelecidas pela quinta passagem.
Diferenciação cardíaca
O protocolo de diferenciação cardíaca é retratado na Figura 1F. A diferenciação cardíaca é iniciada quando os iPSCs são mantidos por pelo menos 10 passagens. O grau de confluência iPSC é crítico quando o CHIR99021 é aplicado. A densidade celular é mais de 90% confluente, mas não superofluente. Se as colônias iPSC ficarem muito lotadas, elas começarão a diferenciação espontânea que afetará negativamente a eficiência de diferenciação de cardiomiócitos direcionados. Cardiomiócitos de batida são geralmente observados após o dia 12 de diferenciação (Vídeo 1). A data em que o início da batida ocorre varia e depende das linhas iPSC em uso. Após a fome de glicose e replaca, os iPSC-CMs apresentam batidas espontâneas(Vídeo 2) e estrutura de sarcomere alinhada com troponina cardíaca intercalada T (TNNT2) e α-actinina(Figura 1G-H). Além disso, a pureza dos iPSC-CMs é alta, com mais de 93% das células sendo TNNT2+ como mostra a análise FACS (Figura 1I).
Embora os iPSC-CMs sejam relativamente imaturos em comparação com os cardiomiócitos adultos, eles apresentam potenciais de ação ventricular e atrial medidos por grampo de remendo de células inteiras(Figura 2A,B). Em uma diferenciação cardíaca típica, os 30 iPSC-CMs do dia são uma mistura de subtipos ventriculares, atrial e nodal, com CMs ventriculares representando a maioria (60%, Figura 2C) utilizando o referido protocolo de diferenciação(Figura 1F). Diferentes protocolos de diferenciação produzem percentuais variados de subtipos de cardiomiócitos devido à ativação de vias de sinalização distintas durante a determinação da linhagemcelular 10. Os CMs ventriculares são rotulados com MYL2 (MLC2v, Figura 2D), enquanto os iPSC-CMs atrial são marcados por NR2F2 (COUP-TFII, Figura 2E). Esses marcadores são altamente expressos em iPSC-CMs mais maduros (>D30) em vez daqueles em estágio inicial.
Expansão de iPSC-CMs por ativação wnt
Em mamíferos, cardiomiócitos adultos não se dividem ativamente para auto-renovação. Esse fenômeno também ocorre para iPSC-CMs humanos. Uma vez madura além da D30, a divisão celular de iPSC-CMs é um evento raro, limitando assim sua capacidade de produção em massa clínica e industrial. Para imitar o ambiente de desenvolvimento durante a proliferação de cardiomiócitos embrionários, ativamos a via Wnt por CHIR99021 para estimular a multiplicação de iPSC-CMs precoces. D12-14 iPSC-CMs (após purificação por privação de glicose) são semeados a baixa densidade na presença de 2 μM CHIR99021. A ativação do WNT estimula a divisão celular dos iPSC-CMs e promove a expressão de reguladores de ciclo celular, como o Cyclin D1 (Figura 3A),que pode empurrar o ciclo celular para avançar através da fase G1. Curiosamente, o CHIR99021 permite uma proliferação robusta de iPSC-CMs precoces para 2 passagens em comparação com os controles(Figura 3B). No entanto, a capacidade de proliferação dos iPSC-CMs diminui com uma passagem extensiva(Figura 3B),consistente com a proliferação cardíaca limitada e bem controlada durante o desenvolvimento do coração embrionário. Além disso, não parece que o CHIR99021 seja capaz de estimular a expansão de iPSC-CMs mais maduros quando atingem mais de 30 dias de diferenciação e desenvolvem estruturas estáveis de sarcomere.
Figura 1: Reprogramação do iPSC humano e diferenciação de cardiomiócitos. (A) Um diagrama esquemático mostrando a camada PBMC após a separação das amostras de sangue do paciente. (B) Os PBMCs ampliados estão prontos para a transfecção. (C) Colônias iPSC humanas precoces. (D) Uma linha iPSC estabelecida na passagem 5. (E) Os iPSCs humanos são positivos para os marcadores de pluripotência OCT4 (verde) e NANOG (vermelho). Os núcleos são contra-identificados pelo DAPI (azul). (F) Visão geral de um protocolo de diferenciação de cardiomiócitos. (G-H) A estrutura sarcomere de iPSC-CMs é revelada pela coloração da imunofluorescência usando anticorpos contra TNNT2 (verde) e α-actinin (vermelho). Os núcleos são contra-identificados pelo DAPI (azul). (I) Análise FACS de iPSC-CMs utilizando um anticorpo contra TNNT2. Barras de escala: 200 μm(B-D),50 μm(E e G) e 20 μm(H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Subtipos de cardiomiócitos em iPSC-CMs humanos. (A-B) Duraçãos potenciais de ação representativas para iPSC-CMs semelhantes a ventriculares(A) e atrial-like(B). (C) Percentuais representativos de subtipos ventriculares, atrial e nodal em iPSC-CMs humanos. (D-E) Os IPSC-CMs D30 estão manchados com anticorpos contra o marcador cardiomiócito ventricular MYL2 (D)e o marcador atrial NR2F2(E). As células são simultaneamente manchadas com um anticorpo TNNT2. Os núcleos são contra-identificados pelo DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm(D-E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ampliação dos iPSC-CMs humanos por ativação Wnt. (A) Percentual de cyclin D1 positivo iPSC-CMs é aumentado na presença de CHIR99021. As células são duplamente manchadas com anticorpos contra TNNT2 (vermelho) e Cyclin D1 (verde). Os núcleos são contra-identificados pelo DAPI (azul). (B) O número de células muda durante a expansão de iPSC-CMs humanos com ou sem CHIR99021 nas primeiras 3 passagens. O eixo Y mostra as alterações do número de células. Chir99021 estimula a proliferação robusta de iPSC-CMs precoces. Barras de escala: 50 μm(A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1. Batendo iPSC-CMs humanos no dia 18 de diferenciação. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2. Batendo iPSC-CMs humanos no dia 25 após a purificação metabólica. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Durante a reprogramação do IPSC, é fundamental cultivar PBMCs por 1 semana até que sejam ampliados com núcleos claros e citoplasma. Como os PBMCs não proliferam, um número celular apropriado para transdução viral é importante para a reprogramação bem sucedida do iPSC. O número celular de PBMCs, a multiplicidade de infecção (MOI) e o título do vírus devem ser considerados e ajustados para alcançar os resultados ideais de transdução. Para a diferenciação cardíaca, a densidade inicial de semeadura é fundamental para que os iPSC atinjam mais de 90% de confluentes no dia em que o CHIR99021 é administrado. Por um lado, se os iPSCs forem menos confluentes no momento da diferenciação cardíaca, chir99021 será tóxico e levará a morte celular substancial. Por outro lado, se os iPSC forem mais confluentes, sofrerão diferenciação espontânea que comprometerá a eficiência da diferenciação cardíaca direcionada. Para a expansão dos IPSC-CMs precoces, deve-se ter em conta o tempo e a qualidade do cardiomiócito. IPSC-CMs precoces só podem se multiplicar robustamente quando a pureza dos cardiomiócitos é alta o suficiente. Os não cardiomiócitos existentes na cultura também podem proliferar em resposta ao tratamento CHIR99021, o que afetará negativamente a proliferação de iPSC-CMs precoces. Além disso, é fundamental estimular a expansão do cardiomiócito até o dia 20 de diferenciação. Uma vez que os iPSC-CMs passem ao longo do dia 30, será difícil para eles retomarem a divisão robusta.
Os iPSCs humanos foram inicialmente derivados de fibroblastos dérmicos e pulmonares através de transfecção mediada por retrovírus1,2. Existem dois grandes problemas com esses métodos de reprogramação que impedem o progresso na tradução clínica de iPSCs do paciente: 1) o retrovírus se integra ao genoma hospedeiro, introduzindo mutações genéticas potenciais; 2) os fibroblastos derivados do paciente requerem biópsias de pele que muitos pacientes podem recusar. Neste protocolo, descrevemos um protocolo que utiliza o vírus Sendai23 e PBMCs de não integração comercial para derivar robustamente iPSCs de pacientes. Esses iPSCs estão livres de vetores exogênicos de reprogramação e podem ser mantidos com autoconexão e pluripotência indefinidamente. Além disso, amostras de sangue de pacientes são facilmente coletadas em laboratórios clínicos. Nosso protocolo é versátil e pode ser usado para produção em massa de iPSCs específicos para pacientes e doenças para repositórios em larga escala e traduções clínicas24.
A diferenciação robusta do cardiomiócito é alcançada pela modulação sequencial de vias específicas de sinalização durante a diferenciação cardíaca dos iPSCs humanos. As principais vias envolvidas na especificação e proliferação cardíaca incluem Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF e ácido retinóico (RA) 10,12. Aqui apresentamos um protocolo de diferenciação cardíaca eficiente por modulação sequencial de sinalização Wnt por pequenos produtos químicos: primeira ativação por CHIR99021 e depois inibição pelo IWR-113,14. Os pequenos produtos químicos são estáveis e dão resultados de diferenciação consistentes em comparação com aqueles que utilizam fatores de crescimento. A maioria dos iPSC-CMs gerados por este protocolo são cardiomiócitos ventriculares, misturados com células atrial e nodal. A geração de precisão de cardiomiócitos específicos do subtipo é alcançada através de ajustes finos posteriores passos10,12. Por exemplo, a adição de RA imediatamente após o tratamento IWR-1 produz uma alta porcentagem de cardiomiócitos atrial, enquanto a inibição de RA promove a geração de iPSC-CMs ventriculares18,22. A ativação da sinalização WNT em um estágio posterior de diferenciação promove a indução de células progenitoras cardíacas para cardiomiócitos nodais19,21, o que é promissor para a geração de células-passo biológicas específicas do paciente.
Os iPSC-CMs humanos são imaturos e têm capacidade limitada de proliferação25. Durante o desenvolvimento cardíaco embrionário, a maturação prossegue enquanto a proliferação diminui. Há uma janela estreita quando os iPSC-CMs podem ser estimulados para uma proliferação robusta, que reflete a expansão do cardiomiócito embrionário. Aqui usamos um ativador Wnt CHIR99021 para promover a proliferação de iPSC-CMs precoces por um período limitado, o que é consistente com um relatório recente17. Especula-se que a via de sinalização Wnt afeta a proliferação de cardiomiócitos possivelmente através do crosstalk com múltiplas vias a montante, como NOTCH e Hippo26,27. A sinalização notch promove a proliferação de cardiomiócitos, enquanto a via hipopótamo restringe o crescimento cardíaco e o tamanho do coração28,29,30. Ainda não se sabe como a interação entre NOTCH e Hipopótamo determina a atividade wnt a jusante e afina um grau apropriado de proliferação cardíaca. Nosso protocolo forneceu um modelo interessante para a proliferação de cardiomiócitos para estudar mecanismos de doenças de defeitos cardíacos congênitos causados pela hipoplasia de cardiomiócitos ventriculares, como síndrome do coração esquerdo hipoplásico (HLHS) e atresia pulmonar com septo ventricular intacto (PA-IVS).
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Adicional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) concede 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao também foi apoiado por fundos de startup do Instituto de Pesquisa Abigail Wexner no Nationalwide Children's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
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