NMR-basert fragmentscreening i et minimumsutvalg, men maksimal automatiseringsmodus

Summary

Fragmentbasert screening av NMR er en robust metode for raskt å identifisere små molekylbindemidler til biomakromolekyler (DNA, RNA eller proteiner). Protokoller som beskriver automatiseringsbasert prøvepreparering, NMR-eksperimenter og innsamlingsbetingelser og analysearbeidsflyter presenteres. Teknikken muliggjør optimal utnyttelse av både ¹H og ¹⁹F NMR-aktive kjerner for deteksjon.

Abstract

Fragmentbasert screening (FBS) er et godt validert og akseptert begrep innenfor legemiddeloppdagelsesprosessen både i akademia og industri. Den største fordelen med NMR-basert fragmentscreening er dens evne til ikke bare å oppdage bindemidler over 7-8 størrelsesordener av affinitet, men også å overvåke renhet og kjemisk kvalitet av fragmentene og dermed produsere treff av høy kvalitet og minimale falske positive eller falske negativer. En forutsetning innen FBS er å utføre innledende og periodisk kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket, bestemme løselighet og kjemisk integritet av fragmentene i relevante buffere, og etablere flere biblioteker for å dekke forskjellige stillaser for å imøtekomme ulike makromolekylmålklasser (proteiner / RNA / DNA). Videre kreves en omfattende NMR-basert screeningprotokolloptimalisering med hensyn til prøvemengder, oppkjøpshastighet og analyse på nivået av biologisk konstruksjon / fragment-rom, i tilstandsrom (buffer, tilsetningsstoffer, ioner, pH og temperatur) og i ligand-rom (ligandanaloger, ligandkonsentrasjon). I det minste i akademia har disse screeningarbeidene hittil blitt utført manuelt på en svært begrenset måte, noe som fører til begrenset tilgjengelighet av screeninginfrastruktur, ikke bare i legemiddelutviklingsprosessen, men også i sammenheng med utvikling av kjemiske sonder. For å møte kravene økonomisk, presenteres avanserte arbeidsflyter. De drar nytte av den nyeste avanserte maskinvaren, som væskeprøvesamlingen kan fylles på en temperaturkontrollert måte i NMR-rørene på en automatisert måte. ¹H/¹⁹F NMR ligandbaserte spektra samles deretter ved en gitt temperatur. Høykapasitetsprøveveksler (HT-prøveveksler) kan håndtere mer enn 500 prøver i temperaturkontrollerte blokker. Dette sammen med avanserte programvareverktøy fremskynder datainnsamling og analyse. Videre er anvendelse av screeningrutiner på protein- og RNA-prøver beskrevet for å gjøre oppmerksom på de etablerte protokollene for en bred brukerbase i biomakromolekylær forskning.

Introduction

Fragmentbasert screening er nå en mye brukt metode for å identifisere ganske enkle molekyler med lav molekylvekt (MW <250 Da) som viser svak binding til makromolekylære mål inkludert proteiner, DNA og RNA. Innledende treff fra primære skjermer tjener som grunnlag for å gjennomføre en sekundær skjerm av kommersielt tilgjengelige større analoger av treffene og deretter å utnytte kjemibasert fragmentvekst eller koblingsstrategier. For en vellykket fragmentbasert legemiddeloppdagelsesplattform (FBDD) er det generelt nødvendig med en robust biofysisk metode for å oppdage og karakterisere svake treff, et fragmentbibliotek, et biomolekylært mål og en strategi for oppfølgingskjemi. Fire ofte anvendte biofysiske metoder innen legemiddeloppdagelseskampanjene er termiske skiftanalyser, overflateplasmonresonans (SPR), krystallografi og kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR).

NMR-spektroskopi har vist varierte roller innenfor de ulike stadiene av FBDD. Bortsett fra å sikre kjemisk renhet og løselighet av fragmentene i et fragmentbibliotek oppløst i et optimalisert buffersystem, kan ligandobserverte NMR-eksperimenter oppdage fragmentbinding til et mål med lav affinitet, og de målobserverte NMR-eksperimentene kan avgrense bindingsepitopen til fragmentet, og dermed muliggjøre detaljerte struktur-aktivitetsforholdsstudier. Innen epitopkartlegging kan NMR-baserte kjemiske skiftendringer ikke bare identifisere de ortosteriske bindingsstedene, men også allosteriske steder som kan være kryptiske og bare tilgjengelige i såkalte eksiterte konformasjonstilstander av det biomolekylære målet. Hvis det biomolekylære målet allerede binder en endogen ligand, kan de identifiserte fragmenttreffene enkelt klassifiseres som allosteriske eller ortosteriske ved å utføre NMR-baserte konkurranseeksperimenter. Bestemmelse av dissosiasjonskonstanten (K_D) av ligand-målinteraksjonen er et viktig aspekt i FBDD-prosessen. NMR-baserte kjemiske skifttitreringer, enten ligand eller mål observert, kan lett utføres for å bestemme K_D. En stor fordel med NMR er at interaksjonsstudiene utføres i løsning og nær fysiologiske forhold. Dermed kan alle konformasjonstilstander for analyse av ligand/fragment-interaksjon med målet undersøkes. Videre er NMR-baserte tilnærminger ikke bare begrenset til screening av godt foldede oppløselige proteiner, men blir også brukt for å imøtekomme større målrom, inkludert DNA, RNA, membranbundne og iboende forstyrrede proteiner¹.

Fragmentbiblioteker er en uunnværlig del av FBDD-prosessen. Generelt fungerer fragmenter som de første forløperne som til slutt blir en del (substruktur) av den nye inhibitoren utviklet for et biologisk mål. Flere legemidler (Venetoclax², Vemurafenib³, Erdafitinib⁴, Pexidartnib⁵) har blitt rapportert å ha startet som fragmenter og er nå vellykket brukt i klinikkene. Vanligvis er fragmenter lavmolekylære (<250 Da) organiske molekyler med høy vandig løselighet og stabilitet. Et nøye utformet fragmentbibliotek som inneholder typisk noen hundre fragmenter, kan allerede love effektiv utforskning av kjemisk rom. Den generelle sammensetningen av fragmentbiblioteker har utviklet seg over tid og ble oftest avledet ved å dissekere kjente stoffer i mindre fragmenter eller designet beregningsmessig. Disse forskjellige fragmentbibliotekene inneholder hovedsakelig flate aromatiske eller heteroatomer og holder seg til Lipinski-regelen på 5 ⁶, eller til den nåværende kommersielle trendregelen på 3 ⁷, men unngår reaktive grupper. Noen fragmentbiblioteker ble også avledet eller sammensatt av høyoppløselige metabolitter, naturlige produkter og eller deres derivater⁸. En generell utfordring med de fleste fragmentbibliotekene er enkel nedstrøms kjemi.

Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) ved Goethe-Universitetet i Frankfurt er partner i iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), et konsortium for strukturell forskningsinfrastruktur for alle europeiske forskere fra alle felt innen biokjemisk og biomedisinsk forskning. Innenfor det forrige initiativet til iNEXT som ble avsluttet i 2019, ble et fragmentbibliotek bestående av 768 fragmenter laget med sikte på "minimumsfragmenter og maksimalt mangfold" som dekker et stort kjemisk rom. Videre, i motsetning til alle andre fragmentbiblioteker, ble iNEXT-fragmentbiblioteket også designet basert på konseptet "klare fragmenter" med sikte på å lette nedstrøms syntese av komplekse, høye affinitetsligander og heretter kjent som internt bibliotek (Diamond, Structural Genomic Consortium og iNEXT).

Etablering av FBDD ved NMR krever arbeidskraft, kunnskap og instrumentering. Ved BMRZ har det blitt utviklet optimaliserte arbeidsflyter for å støtte teknisk assistanse til fragmentscreening av NMR. Disse inkluderer kvalitetskontroll og løselighetsvurdering av fragmentbiblioteket ⁹, bufferoptimalisering for de valgte målene, ¹H eller ¹⁹F- observert 1D-ligandbasert screening, konkurranseeksperimenter for å skille mellom ortosterisk og allosterisk binding, 2D-baserte målobserverte NMR-eksperimenter for epitopkartlegging, og for å karakterisere interaksjonen med sekundært sett av derivater av de første fragmenttreffene. BMRZ har etablert automatiserte rutiner for analyse, som også tidligere omtalt i litteraturen ^10,11, av småmolekyl-protein-interaksjoner og har på plass all nødvendig automatisert infrastruktur for NMR-basert fragmentscreening. Det har implementert metningsoverføringsforskjell NMR (STD-NMR), vannligand observert via gradientspektroskopi (waterLOGSY) og Carr-Purcell-Meiboom-Gill-baserte (CPMG-baserte) avslapningseksperimenter for å identifisere fragmenter innenfor et bredt spekter av affinitetsregimer, samt toppmoderne automatisert NMR-instrumentering og programvare for narkotikaforskning. Mens NMR-basert fragmentscreening er godt etablert for proteiner, er denne tilnærmingen mindre vanlig brukt for å finne nye ligander som interagerer med RNA og DNA. BMRZ har etablert konseptbevis for nye protokoller som muliggjør identifisering av små molekyl-RNA / DNA-interaksjoner. I de følgende avsnittene av dette bidraget rapporteres anvendelse av screeningrutiner på protein- og RNA-prøver for å gjøre oppmerksom på de etablerte protokollene for en bred brukerbase i biomakromolekylær forskning.

Protocol

1. Fragment bibliotek

1. Internt fragmentbibliotek
   MERK: Innenfor rammen av en av de felles forskningsaktivitetene til iNEXT ble det utviklet et robust og nedstrøms kjemivennlig første generasjons fragmentbibliotek¹² og deretter ble en andre generasjon av biblioteket satt sammen i samarbeid med Enamine og er kjent som DSI (Diamond-SGC-iNEXT)-poised fragmentbibliotek (fra nå av betegnet som "In-house library"). Dette biblioteket kan gjøres tilgjengelig på BMRZ for screening formål.
   1. Vurdere fragmentbiblioteket for dets integritet og løselighet ved hjelp av en tidligere rapportert NMR-basert protokoll⁹.
      MERK: Det interne biblioteket består av 768 fragmenter med et svært høyt kjemisk mangfold (>200 Singletons). Å utføre screeningen i fragmentblandinger kan øke hastigheten på screeningkampanjen betydelig; Antall fragmenter i en blanding er imidlertid begrenset på grunn av signaloverlapping i ¹H-NMR-spektrum. Det høyere kjemiske mangfoldet som tilbys av det interne biblioteket, gjør det mulig å lage blandinger som inneholder 12 forskjellige fragmenter uten noen signifikant kjemisk skiftoverlapping i ^{de 1}H observerte NMR-spektrene.
   2. 103 fragmenter i de 768 fragmentene har et fluoratom. For 19 F screeningformål, del alle 103 fragmenter som har en fluorgruppe i 5 blandinger basert på minimum ¹⁹F kjemisk skiftoverlapping. For å minimere signaloverlapping i ¹⁹F-screening, bruk kjemisk skiftinformasjon fra enkeltforbindelsesmålinger for å designe blandinger med maksimalt antall fragmenter og minimal signaloverlapping. Hver blanding har 20-21 fragmenter med distinkte ¹⁹F kjemiske skift som muliggjør entydig tildeling av fragmenter.
2. Brukerdefinert/levert fragmentbibliotek
   1. Utføre screeningkampanjer med det brukerdefinerte eller leverte fragmentbiblioteket; Følgende trinn må imidlertid gå foran screeningkampanjen.
   2. Hvis ikke spesifisert av brukeren på forhånd, utfør NMR-basert kvalitetskontroll av fragmentene (ved BMRZ brukes avanserte programvareverktøy til dette; ⁹, kapittel 6.1.1).
   3. Kontroller løseligheten av fragmentene i buffer-of-choice for det biomolekylære målet, strukturintegritet og konsentrasjon av fragmenter før bruk.
   4. Design blandingen for å redusere både signaloverlapping i NMR-spektra og måletid.
   5. Design blandinger i henhold til trinn 4.2.
   6. Vis enkeltfragmenter eller et delsett av blandinger i stedet for hele biblioteket.

2. Forberedelse av prøve

MERK: High-throughput screening av NMR benytter en pipetteringsrobot for prøvepreparering. NMR-spektra, men også stabiliteter over flere dager med signalinnsamling av proteiner, RNA og DNA er ekstremt følsomme for temperatursvingninger, og derfor vil temperaturkontrollerte automatiserte systemer i stor grad lette stabiliteten til prøvene som pipetteres. For dette formålet kobles en ekstra tilleggsenhet, som fungerer mellom 4 og 40 °C, til pipetteringsroboten for væskehåndtering av NMR-prøvene i et temperaturkontrollert miljø.

1. Ligand blanding forberedelse
   1. Forbered screeningprøver for NMR-målinger ved hjelp av en prøveprepareringsrobot. Den fleksible konfigurasjonen av roboten muliggjør et bredt spekter av applikasjoner (f.eks. gjenvinning av prøvene fra NMR-rør tilbake i lagringsbeholdere eller generelle væskehåndteringsoppgaver). NMR-rør med forskjellig diameter (1,7, 2,0, 2,5, 3,0 og 5,0 mm) kan brukes. Prøverobotsystemet sammen med den avanserte kontrollprogramvaren leser strekkoden som er tildelt for hver containertype og utfører væskefyllingsprotokollen optimalt.
   2. For fremstilling av de interne bibliotekligandblandingene, bruk strekkodede hetteglass. De strekkodede hetteglassene garanterer det høyeste nivået av pålitelighet og optimal sporbarhet av prøvene.
   3. Fordel 768 forbindelser i 8 plater med 96-brønnformat. Stamkonsentrasjonen av hvert enkelt fragment er 50 mM i d_6-DMSO / D₂O (9: 1). Totalt tilberedes 64 blandinger som hver inneholder 12 fragmenter. Den endelige konsentrasjonen av hvert fragment i en blanding er 4,2 mM.
      MERK: Pipetteringsroboten har plass til en rekke beholdertyper med variert geometri (hetteglass med kryo- eller automatisk prøvetaker, 96-brønnsplater runde eller firkantede, strekkodede standard hetteglass, mikrosentrifugerør) og bidrar til effektiv utførelse av væskeoverføringen til en rekke NMR-rør og stativer.

Figur 1: (A) Høy gjennomstrømnings NMR-prøvepreparering og NMR-rørfyllingsrobot installert ved BMRZ. (B) Prøveveksler med høy gjennomstrømning med individuelle temperaturkontrollerte stativer installert på et 600 MHz spektrometer på BMRZ-anlegget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Screening prøvepreparering blank (referanseligandspektrum) og med mål (ligand i nærvær av mål)
   1. For fremstilling av NMR-screeningprøver, i nærvær av målbiomolekylet (protein / RNA / DNA) og ligandblandingen, bruk 3 mm NMR HT prøvevekslerrør valgt fra Bruker NMR-porteføljen av standard NMR-rør.
   2. Overfør det biomolekylære målet (f.eks. ¹H Screening: 10 μM RNA eller Protein) i en definert screeningbuffer til 3 mm NMR-røret (sluttvolum på 200 μL) manuelt eller ved hjelp av pipetteringsroboten.
   3. Overfør 10 μL (f.eks. ¹H screening) av ligandblandingen i neste trinn ved hjelp av robotsystemet inn i de strekkodede 3 mm NMR-rørene som inneholder målbiomolekylet og bland ved hjelp av den innebygde protokollen til kontrollprogramvaren.
      MERK: Strekkodenummeret til NMR-røret er praktisk og automatisk innlemmet i det anskaffede NMR-datasettet, og sikrer dermed ID-orientert arbeidsflyt uten blanding. Tilbehøret for pipetteringsrobotens temperaturkontroll gjør det mulig å holde de preparerte prøvene i NMR-rørene under konstant temperatur.
3. Egendefinerte betingelser og parametere
   1. Etablere optimale bufferbetingelser for å utføre screening av RNA og protein mot det interne fragmentbiblioteket. Følgende prøve betinget brukes til RNA ved BMRZ: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6,2. Mg²⁺ er valgfritt.
   2. Proteiner er ekstremt følsomme for løsningsbetingelser; Bruk buffere som er optimale for det valgte målet. For hver av disse bufferne, skaff ytterligere referansespektra av ligandene for å tjene som blank for analysen.
4. Brukerspesifiserte betingelser
   MERK: I tilfeller der de internt etablerte forholdene ikke er egnet for målene som skal screenes fra en potensiell bruker, bør følgende trinn implementeres.
   1. Utfør ¹H-NMR av bufferen alene for å sikre minimal interferens fra komponentene i bufferen ved utførelse og analyse av ligandobserverte screeningeksperimenter. Forstyrrende komponenter kan passende erstattes med deutererte ekvivalenter.
5. Begrensninger i prøveproduksjon (målmengder)/betingelser og tilgjengelighet
   MERK: Isolering eller rekombinant produksjon av visse biomakromolekyler kan i visse tilfeller vise seg utfordrende og resultere i begrenset tilgjengelighet av målet for å forfølge en vellykket narkotika screening kampanje. I tilfeller med begrenset eller ubegrenset tilgjengelighet av målene, kan følgende alternativer benyttes for å gjennomføre en vellykket NMR-basert fragmentscreening.
   1. Hvis begrenset, bruk ¹⁹F-NMR-basert screening. Typiske fluorerte ligander har et enkelt ¹⁹F-signal; Bruk derfor cocktailer med 25-30 fragmenter uten signaloverlapping. Det er færre signaler å analysere, ingen signalforstyrrelser fra bufferkomponenter og færre signaler å stole på for treffidentifikasjon.
   2. Hvis ubegrenset, bruk større skjermer som ¹H-NMR. Det større fragmentbiblioteket kan skjermes. Vanligvis består fragmenter av mer enn ett proton, noe som betyr flere signaler å stole på for analysen.

3. Betingelser for NMR-anskaffelsen

1. Interne generelt definerte forhold
   1. Spektrometer utstyrt med HT-prøveveksler (automatisering)
      1. For høy gjennomstrømningsscreening, bruk 96-brønnplater som kun kan måles ved hjelp av en HT-prøveveksler. HT-prøveveksleren gir også muligheten til å temperere hvert stativ individuelt.
      2. For optimal signal-til-støy, bruk et spektrometer med en kryogen sonde som enten er helium- eller nitrogenkjølt. En automatisert tunning og matchende modul (ATM) er nødvendig for automatisering.
   2. Parametersett og pulssekvenser
      MERK: Mange NMR-eksperimenter kan karakterisere bindingshendelser. Treffidentifikasjonen varierer avhengig av det eksperimentelle oppsettet. Følgende eksperimenter brukes rutinemessig i BMRZ screeningkampanjer. Likevel kan det gjøres endringer for brukerdefinerte screeningkampanjer og i henhold til brukerspesifikasjoner.
      1. Hvis du bruker TopSpin-programvare, inkluderer du parametersettet for ligandbaserte eksperimenter: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY. Parametersettet inneholder alle nødvendige parametere og pulssekvensene: STD: stddiffesgp.3; T_1ρ: t1rho_esgp2d; T₂: cpmg_esgp2d; og waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. For alle de listede eksperimentene, bruk eksitasjonsskulptur¹³ som vannundertrykkelse. For en referanse, bruk 1D-eksitasjonsskulptur (zgesgp). Antall skanninger avhenger av systemets følsomhet (magnetfeltstyrke og sondehode), prøvekonsentrasjonen og valg av eksperiment. En anbefaling er: 1D med NS=64, T_1ρ &T₂ med NS=128, STD med NS=256 og waterLOGSY med NS=384 eller 512.
      3. For ¹⁹F-screeningen, bruk både 1D- og T_{2-eksperimentene}: 1D: F19CPD (pp=zgig) for 19 F{1 H}-sondehode og F19(pp=zg) for ¹⁹F/¹H-sondehode; SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
      4. Bruk en spektralbredde på 220 ppm og en eksitasjonsfrekvens ved -140 ppm. Eksperimenttiden er mellom 1 og 5 timer (sikre den langsiktige stabiliteten til biomakromolekylet), avhengig av maskinvaren og prøvekonsentrasjonen. For T₂ bør CPMG-tiden veksle mellom 0 ms og 200 ms.
   3. Behandling
      1. Ta opp STD-,_T1ρ - og_{T2-eksperimentene} som pseudo 2D. For å behandle de to enkle 1D-spektrene bruker IconNMR au-programmet proc_std enten med eller uten mulighet til å slappe av. Det første alternativet gir referansen 1D og forskjellen mellom to spektra. Det andre alternativet gir to separate spektra med kort og lang avslapningstid. WaterLOGSY er en enkelt 1D som skal fases med et negativt for løsningsmiddelsignalet.
2. Brukerspesifikke betingelser
   1. Tilpass noen av de tidligere nevnte parametrene til brukerdefinerte forhold. For eksempel, hvis et brukergitt protein ikke er stabilt ved den generelt brukte temperaturen, kan optimaliseringseksperimenter utføres varierende temperatur, konsentrasjon, bufferforhold etc.

4. Dataanalyse

1. Fragmentbibliotek QC (d6-DMSO/spesifikk buffer) og kvantifisering
   1. CMC-q
      MERK: Kvalitetskontroll av fragmentbiblioteker er viktig før igangsetting av screeningkampanjer. Videre må det sikres langsiktig stabilitet i fragmentbiblioteket for anvendelse av flere screeningkampanjer, og derfor må det gjennomføres periodisk evaluering av kvaliteten på biblioteket. Til dette formålet brukes den integrerte programvaren CMC-q og CMC-a fra TopSpin til kvalitets- og kvantitetsvurdering. CMC-q og CMC-a er programvaremoduler i Topspin som muliggjør jevn innsamling, analyse inkludert strukturverifisering ved bruk av ¹H-NMR-spektrum hentet fra små organiske molekyler ⁹.
      1. For integritet, utarbeide vurderingsprøver med en fragmentkonsentrasjon på 1 mM i d6-DMSO. Klargjør prøver på en automatisert måte med en pipetteringsrobot ved å fylle væskeprøveoppsamling i et 3 mm NMR-rør.
      2. For løselighetsvurdering, bruk prøve bestående av 1 mM-forbindelse i 50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 90% H2 O / 10%_D2O og 1 mM 3- (trimetylsilyl)propionsyre-2,2,3,3-d4 syrenatriumsalt (TMSP-Na).
      3. Samle NMR-spektra ved 298 K eller 293 K ved hjelp av et 600 MHz NMR-spektrometer utstyrt med trippel resonans 5 mm TCI kryogen sonde og en HT-prøveveksler, som kan håndtere 579 prøver samtidig.
      4. For å sette opp CMC-q-programvare, følg instruksjonene i brukerhåndboken, som implementerer opprettelsen av en IconNMR-bruker, aktivering av FastLaneNMR og endring av HT-prøveveksleren.
      5. Kalibrer 90 ° puls og lagre den i TopSpin prosol tabellen.
      6. Plasser 96-prøvebrønnplaten i en av de 5 rackposisjonene i HT-prøveveksleren.
      7. Hvis du vil laste inn en SDF-fil (strukturdatafil) som skal inneholde den foreslåtte kjemiske strukturen, en unik identifikator og posisjonen i HT-prøveveksleren for hver prøve i en bunke, går du til Bla gjennom i CMC-q Setup-vinduet og klikker Åpne etter å ha valgt en fil som slutter på .sdf.
      8. I CMC.q Batch Automation-innstillingene angir du bekreftelsestypen som definerer eksperimentet som skal måles, IconNMR-brukeren, og definerer løsningsmidlet.
      9. Definer SDF-filer for Path for SDF-filen, molekyl-IDen og prøveposisjonen.
      10. Start anskaffelsen ved å klikke på Start. Klikk på Start anskaffelse igjen. CMC-q Setup kan også lagres ved å klikke på Lagre.
      11. For detaljert beskrivelse av CMC-q-oppsettstrinn, følg instruksjonene i brukerhåndboken fra Bruker.
   2. CMC-en
      1. For CMC-a, bruk programvaremodulen i Topspin som muliggjør analyse inkludert strukturverifisering ved bruk av 1H-NMR-spektrum hentet fra små organiske molekyler⁹.
2. Blanding design
   MERK: En riktig blandingsdesign spiller en viktig rolle for screening ved bruk av NMR som plattform. Et høyt antall fragmenter per blanding muliggjør raskere screening, men øker risikoen for falske positive og negative. Et lavere tall reduserer risikoen, men øker tiden det tar å gjennomføre screeningen. Generelt må en signaloverlapping unngås når du lager blandinger. Ved å bruke det interne biblioteket kan dette forsømmes for ¹H-screeningen, da biblioteket var spesielt designet for å være mangfoldig og vise liten signaloverlapping samtidig som det opprettholder et høyt kjemisk mangfold. Dette betyr igjen at ingen spesiell designprosedyre må gjennomgås for å lage de 64 blandingene.
   1. Siden ¹⁹F-screeningen er avhengig av fragmentene i det interne biblioteket som inneholder fluor, og biblioteket ikke ble opprettet for å redusere signaloverlappingen for disse spesifikke fragmentene, må du designe en riktig blanding.
   2. Mål enkeltforbindelsesspektra for alle fragmenter som inneholder ¹⁹F.
   3. Legg merke til den kjemiske skiftinformasjonen for hvert signal.
   4. Ifølge denne informasjonen, velg 20-21 fragmenter per blanding. Dette gir igjen 5 blandinger som hver inneholder 20-21 fragmenter uten signaloverlapping og tillater en halvautomatisert analyse av dataene.
3. Utfør treffidentifikasjon i en ligand observert biomakromolekyl-ligandinteraksjon
   MERK: Det er forskjellige definisjoner av et treff mellom ¹⁹F og ¹H screening prosedyre. Følgende treffidentifikasjoner ble satt opp av oss og følger spesifikke regler. Emnet for treffbestemmelse er en svært subjektiv måte og kan variere fra bruker til bruker. Det er likevel av største betydning at reglene for treffidentifikasjon ikke endres når det er avtalt for å opprettholde validering og troverdighet.
   1. ¹H-skjerm
      1. For å trygt bestemme treff, skaff deg 1D ¹H-spektra, waterLOGSY og T₂ avslapningseksperimenter både i nærvær og fravær av mål for å identifisere bindemidler. Alle tre eksperimentene har potensial til å vise en bindende hendelse. Hvis en CSP på større enn 6 Hz er synlig i prøvespektrene sammenlignet med de tomme spektrene, betraktes dette som en indikasjon på et treff. Det samme gjelder hvis et sterkt positivt signal i waterLOGSY samt mer enn 30% T₂ reduksjon i prøvespektrene er synlig. Bindingshendelser kan vises i alle tre eksperimentene når man sammenligner prøven som inneholder spektra med deres respektive blanke spektra. Det kan imidlertid hende at bindingshendelser ikke er synlige i alle tre eksperimentene. På grunn av dette ble det enighet om at minst to av de før beskrevne hendelsene må inntreffe for å klassifisere et fragment som et bindende treff.
      2. Bruk FBS-verktøyet i TopSpin til å definere tilstanden til fragmenter i bindende, tvetydige, ukjente, aggregater og ikke-bindende.
      3. Når du er ferdig med en blanding, godkjenner du den i FBS-verktøyet.
      4. I sammendragsfanen i FBS-prosjektet klikker du på Opprett en screeningrapport. Dette åpner et vindu som oppretter en .xlsx fil. Brukeren kan da velge mellom alle ligander, kun bindende ligand, ikke kun bindende ligand og tvetydige ligander som skal rapporteres i regnearket.
   2. ¹⁹F-skjerm
      1. Hvis du vil skille mellom ikke-bindemiddel, ukebinder og sterk bindemiddel, deler du integrasjonskvotienten mellom målmålingen på 200 ms og den tomme målingen på 200 ms med kvotienten til 0 ms-målmålingen, og den tomme 0 ms-målingen brukes:
         
         MERK: Dette gir verdier fra 0 til ~1 (treffpoengsummen), noe som gjør det mulig å tilordne terskler for hver bindingstilstand.
      2. Bruk gjennomsnittet av referansemålingen på 200 ms som en grunnlinjeterskel for å markere tilfeller der treffpoengsummen overskrider 1. Dette kan skje hvis de importerte integralene inneholder negative verdier eller referansemålet er høyere enn målet. En hit-score på ≤ 0,67 regnes som et svakt treff, < 0,33 et sterkt treff, og alt > 0,67 som no-hit. Et eksempel er vist i figur 2.

Figur 2: Treffidentifikasjon for ¹⁹F-screeningen. Seksjon av ¹⁹F CPMG NMR-spektra av en eksemplarisk forbindelse. Denne billedlige fremstillingen forklarer egenskapene til en perm. ¹⁹F-CPMG-spektra av en forbindelse oppnådd av blandingsprøver i nærvær og fravær av RNA. Verdiene representerer de normerte integralverdiene til den tilsvarende toppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Analyse av data
   1. Klargjøre data for analyse
      MERK: Det er viktig at de innhentede dataene ikke har synlige feil. Dette betyr at data der shimming var problematisk, eller vannundertrykkelse var utilstrekkelig, ikke bør vurderes for analyse. I stedet anbefales det å registrere data igjen og sørge for at alt er bra med prøven (f.eks. Ingen luftbobler), med temperaturen, skimmingen og vannundertrykkelsen. Datakorrekthet kan alltid vurderes ved sammenligning av DMSO-signaler.
   2. ¹H-screening
      1. For å analysere ^{screeningdata på 1}H, bruk FBS-verktøyet (trenger ytterligere lisens) i TopSpin 4.0.9.
      2. Følg instruksjonene i FBS-verktøyhåndboken for å starte med dataanalysen. Følgende trinn oppsummerer prosedyren som er rapportert i håndboken.
      3. Lagre BMRZ NMR-data fra screeningkampanjer slik at hver forskjellige screeningblanding har sin egen katalog der en underkatalog inneholder de forskjellige eksperimentene målt på prøven.
      4. For å bruke FBS-verktøyet, lagre referansespektrene som har alle data lagret fra prøver uten det biomolekylære målet, men med blandingene samt enkeltforbindelsen målt i forskjellige /nmr-kataloger. Dette er viktig som FBS-verktøyet vil be om katalogen banen til hver enkelt.
         FBS-verktøyet gjenkjenner en katalog som et screeningprosjekt hvis følgende datasett ble lagret i samme katalog der blandingene av en screeningprøve er lagret (csv, FragmentScreen XML-dokumenter og BAK-fil).
      5. Når du bruker TopSpin 4.0.9, oppretter du en direkte bane til katalogen som inneholder de oppkjøpte dataene, en såkalt DIR. Velg katalogen /nmr der alle blandinger skal ha en distinkt katalog.
      6. For å starte FBS-verktøyet til en skjermet prøve, dra symbolet FBS-prosjektet til midten av TopSpin-vinduet. I den valgte katalogen skal FBS-prosjektsymbolet vises hvis tidligere nevnte datasett ble kopiert til det.
      7. Vinduet Fragment Based Screening Options skal automatisk åpnes når du først laster inn et nytt FBS-prosjekt. I dette vinduet velger du en cocktailfil. Cocktailfilen er en csv-fil som inneholder tildelingen av navnet på blandingene, navnet på hvert fragment og deres oppdeling i blandingene. Definer også en referanseligandspektramappe som har alle målte spektra av enkeltfragmentene. Til slutt definerer du en referanse tom eksperimentmappe, som vanligvis er mappen som inneholder datasettene til blandingene uten det undersøkte målet.
      8. Fragment Based Screening Options har en fane kalt Spectra-typer som lar en definere de undersøkte spektrene, samt fargen for å vise spektrene. Angi spesifikasjonstypen i henhold til de forhåndsbehandlede dataene. I kategorien Skjermoppsett definerer du spektrene som skal sammenlignes med hverandre i henhold til spesifikasjonene.
      9. Trykk OK for å starte FBS-prosjektet.
      10. Mens du ser på dataene, åpnes et eget vindu som oppsummerer alle cocktailblandinger og alle ligander av hver blanding i et bord. Ved å dobbeltklikke på en celle, åpnes de respektive datasettene, og sammenligner for eksempel 1 H ^1DBlank-spektra med datasettet som inneholder målet.
      11. Før du tilordner bindemidler, må du sørge for at referansetoppene (DMSO av alle målinger så vel som enkeltforbindelsene) samsvarer med hverandre og har samme kjemiske skift. Hvis det observeres forskjeller, må du rette dem ved å bruke alternativet for seriell behandling fra TopSpin.
      12. Alternativet for seriell behandling er under kategorien Prosess under Avansert. Den bruker endringer på alle valgte spektra fra et datasett. På denne måten kan spesifikasjonstyper enkelt tilordnes eksperimentnumre, og alle spektra kan flyttes samtidig for å samsvare med referansen.
   3. ¹⁹F Screening
      1. For den første analysen av de ¹⁹F-blandingene, opprett en integrasjonsfil for hver blanding. For å definere integrasjonsregionen, klikk på Integrer-funksjonen i kategorien Analyser . Forsikre deg om at for hvert fragment i blandingen er det definert et klart integrasjonsområde for den tilsvarende ¹⁹F-singalen.
      2. Bruk knappen Lagre/eksporter integreringsområder til å eksportere integrasjonsfilen for fremtidig bruk. Lagre eventuelle brukte integrasjonsfiler i C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng, eller den tilsvarende banen til TopSpin-installasjonskatalogen.
      3. For ¹⁹F-data åpner du et datasett enten med eller uten det undersøkte målet.
      4. For å laste integrasjonsfilen inn i gjeldende spektrum, åpne Analyser-fanen igjen, gå til Integrer og bruk knappen Les/importer integrasjonsregioner , last inn den tilsvarende integrasjonsfilen. Dette vil laste alle definerte områder av den filen inn i gjeldende spektrum.
      5. Lagre og gå tilbake for å finne en liste over alle integrerte områder i kategorien Integraler . Kopier dette til et regneark eller et annet verktøy som brukes til videre analyse av dataene.
      6. Gjenta denne prosedyren for hver blanding, med og uten mål.
   4. Håndtering av data
      1. For brukervennlighet og produktivitetens skyld, ha en enhetlig arbeidsflyt satt opp for videre analyse og lagring av de innhentede dataene. For både ¹H- og ¹⁹F-screeningen, bruk et spesielt utformet regneark for hver.
         MERK: For ¹H-screeningen ble dette utelukkende brukt til datahåndtering og for å oppsummere hvert mål, mens det for ¹⁹F-screeningen ble brukt i kapittel 4.3 forklart kvotient for automatisk å merke hvert fragment som treff / ingen treff etter at integraldataene ble kopiert inn i den. Dette reduserer risikoen for menneskelige feil under analysen, forutsatt at filen ble satt opp riktig, og gjør deling av informasjon enklere, da all viktig informasjon er samlet på ett sted i en fil som kan åpnes av nesten alle uten behov for ytterligere programmer for å ta en første titt på dataene.

Representative Results

Kvalitetskontroll av fragmentbibliotek
Fragmentene fra det interne biblioteket ble levert som 50 mM lagerløsninger i 90% d6-DMSO og 10% D 2 O (10% av D₂O sikrer minimering av sammensatt nedbrytning på grunn av gjentatte fryse-tine-sykluser¹⁴). Enkeltsammensatte prøver besto av 1 mM ligand i 50 mM fosfatbuffer (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6,0 i 90% H 2 O / 9% D ₂O / 1% d6-DMSO. ¹H-NMR-eksperimenter med fragmenter fra iNEXT-biblioteket ble målt på et 500/600 MHz NMR-spektrometer. Disse dataene ble videre brukt til å identifisere enkeltforbindelsene i ¹H screeningkampanjer ved hjelp av CMC-q-programvaren som gjør det mulig for brukeren å skaffe spektra på en automatisert måte, og analysetillegget CMC-a, kvaliteten (løselighet og integritet) av fragmenter ble vurdert. Resultatene fra den automatiserte analysen fra CMC-a er vist som et grafisk resultat tilsvarende det som er representert i figur 3. Den grafiske produksjonen viser en representasjon av en plate med 96 brønner. En rødfarget sirkel betyr at dette fragmentet viser inkonsekvens i struktur eller konsentrasjon. Grønnfargede brønner indikerer at fragmentet er konsistent.

Figur 3: Kvalitetskontroll av fragmentbibliotek. Skjematisk fremstilling av CMC-en basert automatisert utgang. Fragmentegenskaper som konsentrasjon og strukturell integritet vurderes. Grønn står for konsistent, oransje står i dette tilfellet for inkonsekvent. Inkonsekvente fragmenter revideres manuelt etter arbeidsflyten som vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Omtrent 65 % og 35 % av fragmentene ble klassifisert som henholdsvis konsistente og inkonsistente i både DMSO og buffer. Videre ble 30% av de inkonsekvente klassifiserte ligandene konsistente etter en nøye manuell inspeksjon av spektrene⁹.

¹⁹F Blanding design
103 fragmenter som inneholdt en eller flere fluorgrupper fra det interne biblioteket ble delt inn i 5 blandinger (A, B, C, D, E). Hver blanding har 20 til 21 fragmenter. I dette tilfellet måtte blandingene utformes nøye for å unngå signaloverlapping. ¹⁹F tverrgående relaksasjonseksperimenter ble målt for hver blanding som bruker CPMG-pulstog. Disse eksperimentene kan modifiseres ved å variere avslapningsforsinkelsene. Den ¹⁹F kjemiske forskyvningen av blandingene A-E kan ses i figur 4.

Figur 4: ¹⁹F 1D-NMR-spektra av blandingsprøver fra det interne biblioteket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøve forberedelse
Prøveprepareringen i ¹⁹F screeningprosedyren ble enten gjort manuelt eller med automatisert pipettering ved hjelp av en pipetteringsrobot. Fragmentene i hver blanding hadde en konsentrasjon på 2, 5 mM i 90% d6-DMSO og 10% D₂O. Siste volum av en screeningprøve var 170 μL med 5 %_D2Osom låsemiddel. Hver blanding ble pipettert to ganger, en i en bufferholdig løsning (uten mål) og en i en bufferløsning som inneholdt mål. Forholdet mellom mål og fragment ble satt til 1:1, noe som resulterte i en endelig mål-/ligandkonsentrasjon på 50 μM. I tillegg er kontrollprøver målbiomolekylet i screeningbuffer uten blanding for å sikre målintegritet, samt en kontrollprøve med bare buffer og D₂O for å sikre bufferkvalitet.

NMR-screeningdata på 19 F-1D og ¹⁹F-CPMG-T₂ var målinger som beskrevet i pkt. 3.1. For eksempel, når det gjelder RNA, ble det oppnådd en hopp-retur-ekkosekvens (pp = zggpjrse,15) for enkeltmålprøven i buffer.

Dataanalyse
¹⁹F screeningprosedyren ble brukt på TPP riboswitch thiM fra E. coli og protein tyrosinkinase (PtkA) fra M. tuberculosis blant flere andre mål¹⁶. ¹⁹F screeningbiblioteket har 103 fragmenter som er delt inn i 5 blandinger merket fra Mix A til E. Klargjøring av screeningprøver kan utføres manuelt uten bruk av en prøvepipetteringsrobot. 40 μM thiM RNA-holdig oppløsning (bufferbetingelser) ble blandet med 3,2 μL fra blandingene. Ytterligere kontrollprøver ble utarbeidet bestående av buffer bare, buffer med 5% DMSO (tidligere sikre stabiliteten til biomakromolekylet i nærvær av ønsket DMSO-konsentrasjon) og buffer med RNA. Disse 13 screeningprøvene ble klargjort og overført til 3 mm NMR-rør. Strekkoder av NMR-rør skannes og hver blanding i nærvær og fravær av RNA, samt kontrollprøver ble målt i henhold til de ^{nevnte 19}F NMR-eksperimentene utført ved 298 K. Screening av thiM RNA mot det interne biblioteket ble utført ved å gjennomføre T 2-målinger med CPMGs på 0 ms og 200 ms for hver annen prøve. Riktig shimming og vannundertrykkelse ble overvåket etter at målingene var fullført ved å sammenligne alle DMSO-toppene når det gjelder linjeutvidelse og intensitetstap av ytterligere målte ¹H 1D-eksperimenter for alle prøver. Behandling av oppnådd CPMG T₂¹⁹F relaksasjonsspektra ble utført ved bruk av henholdsvis en tidligere forberedt og automatisert makro i TopSpin. Dataanalyse ble utført i henhold til instruksjonene i protokolldelen. De integrerte dataene hentet fra TopSpin (i henhold til instruksjonene i protokollen) kan evalueres raskt og enkelt ved hjelp av et forhåndslaget regneark eller lignende program, ved å stille inn de riktige forholdene og terskler. Som beskrevet tidligere er terskler nyttige for å definere bindemiddel, svakt bindemiddel eller ikke-bindemiddel. Figur 5 viser typiske resultater av CPMG-spektra av henholdsvis thiM RNA og PtkA. I noen tilfeller var det behov for ytterligere ekspertrevisjon. 

Figur 5: Kutt ut av 19 F CPMG NMR-spektra som viser intensitetsendringene oppnådd fra forskjellige forsinkelsestider for CPMG-baserte eksperimenter . (A) Representasjon av et bindemiddel (treff) og en ikke-bindemiddel i ¹⁹F fragmentbasert screening utført på TPP riboswitch thiM RNA fra E. coli. (B) Representasjon av et bindemiddel og et ikke-bindemiddel i ¹⁹F fragmentbasert screening utført på PtkA fra M. tuberculosis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

¹H Screening

Blanding design
Det brukte interne biblioteket er så mangfoldig at for ¹H screening formål ble det ikke utført noen blandingsdesign. Dette betyr at 64 blandinger ble fremstilt ved tilfeldig å velge 12 som skal blandes i en blanding.

Forberedelse av prøver
For ¹H-screening av et eksemplarisk SARS-CoV-2 RNA ble automatisert pipettering ved hjelp av en pipetteringsrobot utført for å forberede prøvene. Fragmentene i hver blanding hadde en konsentrasjon på 4,2 mM i 90% d6-DMSO og 10% D₂O. Det endelige volumet av en screeningprøve var 200 μL med 5% D₂O som låsemiddel. 64 prøver hver inneholdende en annen blanding i 25 mM KPi, 50 mM KCl ved pH 6,2 ble pipettert uten mål-RNA. Henholdsvis ble 64 prøver pipettert med mål-RNA, som hver inneholdt en annen blanding. RNA:Ligand-forholdet ble satt til 1:20, noe som resulterte i en RNA-konsentrasjon på 10 μM og en ligandkonsentrasjon på 200 μM.

Dataanalyse
For ¹H-analysen ble FBS-verktøyet i TopSpin brukt. For å avgjøre om et fragment er et treff, ble det utført 1D kjemisk skift, waterLOGSY og T₂ avslapningseksperimenter. For T2-avslapning ble en reduksjon i intensitet større enn 30% regnet som et treff, mens for det kjemiske skiftet var et skifte på større enn 6 Hz cut-off. WaterLOGSY måtte vise en signifikant signalendring (fra negativ til positiv i dette tilfellet). Hvis to av disse tre kriteriene var positive, ble et fragment regnet som et treff. To eksempler på dette fremgår av figur 6.

Figur 6: ¹H-screening utført på et eksemplarisk SARS-CoV-2 RNA som viste kriterier for treffbestemmelse. Oppkjøp av tre forskjellige eksperimenter (1 H T₂ CPMG (5/100 ms), waterLOGSY og 1D ¹H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hit-1 viser en T_2-reduksjon på ~ 50% og en CSP ≥ 6 Hz. WaterLOGSY viser ikke en signifikant nok endring i signal til også å bli regnet som positiv. Siden to av tre eksperimenter er positive, regnes dette fragmentet som et treff. For Hit-2 viser T₂ en reduksjon på ~ 80% signalintensitet og en klar signalendring kan sees for waterLOGSY. CSP er ikke nok i dette tilfellet, men ettersom de to foregående kriteriene er positive, regnes det fortsatt som et treff.

Discussion

Allsidighet av NMR-basert fragment / narkotika screening. BMRZ har vellykket implementert toppmoderne automatisert NMR-instrumentering samt STD-NMR, waterLOGSY og avslapningseksperimenter for å identifisere fragmenter innenfor et bredt spekter av affinitetsregime for narkotikaforskning. Den installerte maskinvaren inkluderer en prøveprepareringsrobot med høy gjennomstrømning og prøvelagrings-, veksler- og datainnsamlingsenhet med høy gjennomstrømning knyttet til et 600 MHz spektrometer. En nylig kjøpt kryogen sonde for 1 H, 19 F, 13 C og ¹⁵N sikrer den nødvendige følsomheten for de foreslåtte målingene og tillater 1 H (¹) frakobling under ¹⁹F-deteksjon. Denne sonden er koblet til siste generasjon NMR-konsoll som gir mulighet til å bruke de avanserte programvareverktøyene fra Bruker, inkludert CMC-q, CMC-assist, CMC-se og FBS (inkludert i TopSpin). Det fragmentbaserte screeningverktøyet (FBS) er inkludert i den nyeste versjonen av TopSpin og hjelper til med å analysere dataene med høy gjennomstrømning som består av STD, waterLOGSY, T₂ / T₁ r-avslapningseksperimenter. Den flytende 1D 1H-prøvesamlingen kan fylles inn i NMR-rørene på en automatisert måte ved hjelp av prøvefyllingsroboten. Vanligvis fylles en blokk med 96 rør (3 mm) på omtrent to timer. 96-brønnsplatestativene er direkte plassert i HT-prøveveksleren, som leser strekkoden til blokken og tilordner NMR-rørene til eksperimentene som styres av automatiseringsprogramvaren (IconNMR). Fem 96-brønnsplatestativer kan lagres og programmeres i HT-prøveveksleren samtidig. Temperaturen på hvert av de enkelte stativene kan styres og reguleres separat. I tillegg kan hver enkelt prøve forkondisjoneres (forvarming og tørking av rør for fjerning av kondensert fuktighet) til ønsket temperatur før målingen.

Egnethet for et bredt spekter av applikasjoner. En av de brede anvendelsene av denne automatiserte NMR-baserte screeningen er å identifisere og utvikle nye ligander som binder seg til et biomakromolekylært mål (DNA / RNA / proteiner). Disse ligandene kan inkludere ortosteriske og allosteriske hemmere som vanligvis binder ikke-kovalent. Videre brukes FBDD av NMR vanligvis som et første skritt for å velge lovende forbindelser, kravene som skal oppfylles er tilgjengeligheten av det biomolekylære målet i tilstrekkelige mengder. Dette målet er delt inn i to hovedoppgaver.

Oppgave én er å utvikle og karakterisere et internt fragmentbibliotek av følgende grunner: innledende og periodisk kvalitetskontroll, karakterisering og kvantifisering av mer enn 1000 fragmenter; bestemmelse av løseligheten av fragmentene i buffere optimalisert for hvert mål, spesielt for proteinmål; og etablering av flere biblioteker for å imøtekomme ulike stillaser og utvide mot andre makromolekylklasser. Oppgave to er å integrere arbeidsflyter for fragmentbasert legemiddeldesign (FBDD) ved hjelp av: automatisert 1D-ligand observert screening (¹H og ¹⁹F observert); automatiserte erstatningsanalyser (konkurranseeksperimenter med (naturlig) ligand) for å skille ortosterisk og allosterisk binding; automatiserte sekundære screeninger med flere fragmenter; automatisert 2D-proteinscreening og sekundær screening av et sett med derivater rundt et første treff ved bruk av EU-OPENSCREEN-biblioteket eller et annet bibliotek; og re-profilering screening av FDA-biblioteket mot de valgte målene.

I tillegg kan metabotyping av ulike cellelinjer (sykdomsrelevant) utføres for å avdekke reguleringsmekanismene som knytter cellesykluskontroll og metabolisme. Det er også funksjonell karakterisering av RNA / DNA / proteinreguleringselementer in vivo og in vitro for optimalisering av konstruksjon / domeneoptimalisering (stabilitetsoptimalisering for strukturelle undersøkelser (buffer, pH, temperatur og saltscreening), og en utvidelse av NMR-basert fragmentscreening til membranproteiner og iboende uordnede proteiner, som generelt er utilgjengelige for andre teknikker.

Begrensninger. Bruk av ¹⁹F og ¹H fragmentbiblioteker har sine fordeler og ulemper, hvorav få vil bli nevnt i det følgende. Den største fordelen med ¹⁹F versus ¹H-målinger er hastigheten på både den faktiske måletiden og den påfølgende analysen, da blandingene inneholder nesten dobbelt så mange fragmenter og færre eksperimenter må utføres. Oppfølgingsanalysen er også enklere for ¹⁹F-screening, da det ikke er noen forstyrrelser fra buffere og i tillegg tilbyr et bredere kjemisk skiftområde med nesten ingen signaloverlapping for en optimalt designet fragmentblanding. Spektrene selv er sterkt forenklet, vanligvis bare med ett eller to signaler per fragment, avhengig av antall fluoratomer. Analysen av disse spektrene kan derfor automatiseres, noe som igjen reduserer tiden. Dette går på bekostning av det kjemiske mangfoldet, i hvert fall for biblioteket som brukes i denne studien. Siden bare ~ 13% av biblioteket inneholder 19 F, men naturligvis alle er brukbare i ¹H-screening, vil mangfoldet av de ¹⁹F screeningfragmentene være lavere. Dette kan omgås ved hjelp av spesialdesignede ¹⁹F-biblioteker med flere fragmenter og større kjemisk mangfold. En annen ulempe for ¹⁹F screening er det lave antallet signaler per fragment. Fragmenter består vanligvis av mer enn ett hydrogenatom. Derfor kan ^observertescreeningeksperimenter med 1 H stole på forskjellige signaler for det samme fragmentet for å oppdage binding. Dette gir en høyere grad av sikkerhet ved identifisering av treff for ¹H-screeningen, mens ¹⁹F-screeningen må stole på ett eller to signaler gitt per fragment.

En detaljert redegjørelse for moderne automatisert NMR-basert fragmentscreeninginstrumentering, programvare og analysemetoder og protokoller derav har blitt presentert. Den installerte maskinvaren inkluderer en prøveprepareringsrobot med høy gjennomstrømning og en prøvelagrings-, veksler- og datainnsamlingsenhet med høy gjennomstrømning knyttet til et 600 MHz spektrometer. Et nylig installert kryogent sondehode for 1 H, 19 F, ¹³C og 15 N sikrer den nødvendige følsomheten for de foreslåtte målingene og tillater ¹H-frakobling under ¹⁹F-deteksjon. Videre tilbyr den nyeste generasjonen av NMR-konsoll muligheten til å bruke avansert analytisk programvare for å hjelpe til med anskaffelse og on-the-fly analyse. Ovennevnte diskutert teknologi, arbeidsflyter og de beskrevne protokollene bør fremme bemerkelsesverdig suksess for brukere som forfølger FBS av NMR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Avance III HD		Bruker	600 MHz NMR Spectrometer
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes	3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK	ThermoFisher Scientific	Barcoded Tubes
Matrix SepraSeal und DuraSeal&	4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	HT Sample Changer
SamplePro Tube		Bruker	Pipetting Robot