Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). Dieses Protokoll erzeugt Nierenorganoide innerhalb von zwei Wochen. Die resultierenden Nierenorganoide können in großflächigen Spinnerkolben oder magnetischen Multi-Well-Rührplatten für parallele Drogentestansätze kultiviert werden.
Abstract
Nierenorganoide, die aus hPS-Zellen erzeugt werden, haben eine unbegrenzte Quelle für Nierengewebe bereitgestellt. Menschliche Nierenorganoide sind ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung von Nierenerkrankungen und -verletzungen, die Entwicklung zellbasierter Therapien und die Erprobung neuer Therapeutika. Für solche Anwendungen wird eine große Anzahl von einheitlichen Organoiden und hochreproduzierbaren Assays benötigt. Wir haben auf unserem zuvor veröffentlichten Nierenorganoidprotokoll aufgebaut, um die allgemeine Gesundheit der Organoide zu verbessern. Dieses einfache, robuste 3D-Protokoll beinhaltet die Bildung einheitlicher embryoider Körper in Medium mit minimalen Komponenten, die Lipide, Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin-Ergänzung und Polyvinylalkohol mit GSK3-Inhibitor (CHIR99021) für 3 Tage enthalten, gefolgt von Kultur in Knock-out-Serumersatz (KOSR)-haltigem Medium. Darüber hinaus ermöglichen rührende Assays eine Verringerung der Verklumpung der embryonalen Körper und die Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Größe, was wichtig ist, um die Variabilität zwischen den Organoiden zu reduzieren. Insgesamt bietet das Protokoll eine schnelle, effiziente und kostengünstige Methode zur Erzeugung großer Mengen von Nierenorganoiden.
Introduction
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Protokollen zur Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Nierenorganoide entwickelt 1,2,3,4,5. Nierenorganoide haben ein wichtiges Werkzeug zur Unterstützung der Erforschung neuer Ansätze der regenerativen Medizin, zur Modellierung von Nierenerkrankungen, zur Durchführung von Toxizitätsstudien und zur Entwicklung therapeutischer Medikamente bereitgestellt. Trotz ihrer breiten Anwendbarkeit haben Nierenorganoide Einschränkungen wie mangelnde Reifung, begrenzte langfristige Kulturkapazität in vitro und einen Mangel an mehreren Zelltypen, die in der menschlichen Niere gefundenwurden 6,7,8. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf die Verbesserung des Reifegrades von Organoiden, die Verlängerung der Kulturperioden und die Erweiterung der Komplexität von Nierenzellpopulationen durch Änderung der bestehenden Protokolle 9,10,11,12. In dieser vorliegenden Iteration unseres etablierten Protokolls 5,13 haben wir die Mediumkomponenten in der ersten Stufe des Protokolls zu einem serumfreien Basismedium modifiziert, das mit Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITSE), Lipiden, Polyvinylalkohol (E5-ILP) und CHIR99021 (Abbildung 1) ergänzt ist. Diese Veränderungen liefern ein vollständig definiertes, serumfreies, proteinarmes Medium mit weniger Komponenten als unsere vorherige mittlere Zusammensetzung 5,13 und ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren. Infolgedessen ist die Vorbereitung des Mediums der ersten Stufe weniger arbeitsintensiv als unsere zuvor veröffentlichte Version und kann die Variabilität von Charge zu Charge verringern5. Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl Insulin als auch Transferrin in der serumfreien Kultur wichtig sind14,15, jedoch können hohe Insulinspiegel die Mesodermdifferenzierung hemmen 16. Wir haben die niedrigen Insulinspiegel gemäß dem ursprünglichen Protokoll beibehalten und die KOSR-Spiegel (insulinhaltig) in der zweiten Stufe des Assays weiter reduziert. In Übereinstimmung mit anderen Protokollen für die Bildung von Nierenorganoiden sind niedrigere KOSR-Spiegel vorteilhaft für die Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts zwischen Proliferation und Differenzierung des Nierengewebes17. Darüber hinaus haben wir die Glukosekonzentration in unserem Stadium II Medium13 gesenkt.
Unsere Methode beschreibt einen Aufbau für den Suspensionsassay von Nierenorganoiden, wobei bis zu ~ 1.000 Organoide aus einer anfänglichen ~ 60% konfluierenden hPSC 100 mm Kulturplatte wie in der Originalpublikation 5,13 beschrieben ergeben. Dieses Protokoll kann leicht skaliert werden, um mit mehreren 100-mm- oder 150-mm-Platten zu beginnen, um die Organoidzahlen weiter zu erhöhen.
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Protocol
Alle Experimente mit hPS-Zellen wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und in einer Biosicherheitshaube der Klasse II mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Alle Reagenzien sind Zellkulturqualität, sofern nicht anders angegeben. Alle Kulturen werden bei 37 °C, 5% CO2 Luftatmosphäre inkubiert. In allen Stadien des Assays können embryonale Körper oder Nierenorganoide gesammelt und fixiert oder für die Analyse vorbereitet werden. Die hPSC-Leitungen, die zur Generierung dieser Daten verwendet wurden, wurden vollständig charakterisiert undveröffentlicht 18.
1. Vorbereiten von Kulturplatten
HINWEIS: Beschichten Sie ca. 1 h vor dem Aufspalten von hPSCs 2 x 100 mm große Gewebekulturplatten mit einem stammzellqualifizierten Basalmembranmatrixextrakt (BME). Man darf die Platten vorbeschichten, mit einer Paraffinfolie versiegeln und nach Herstellerangaben bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 2 x 100 mm Gewebekultur-behandelte Platten (1 für Nierenorganoid-Assay, 1 zur Aufrechterhaltung der Zelllinie) und einen 15 ml konischen Schlauch in der Biosicherheitshaube der Klasse II vor.
- Aliquot 8 ml kaltes, serumfreies Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) in ein 15 mL konisches Rohr und ~ 4 ml in jede der 100 mm Platten, genug, um den Boden jeder Platte mit Medium zu bedecken.
- Nehmen Sie ein 100 μL Aliquot BME aus dem Gefrierschrank (-20 °C). Nehmen Sie mit einer serologischen 2-ml-Pipette ~ 1 ml kaltes DMEM aus der 15 ml konischen Röhre. Tauen Sie das BME-Aliquot langsam auf, indem Sie mit dem kalten DMEM sanft auf und ab pipettieren und Blasen vermeiden.
HINWEIS: Lassen Sie BME aliquot nicht bei Raumtemperatur sitzen. Sofort verwenden. - Überführen Sie das aufgetaute DMEM/BME mit dem restlichen DMEM zurück in das 15 ml konische Rohr. Mischen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette den verdünnten BME vorsichtig, indem Sie mindestens 8 Mal auf und ab pipettieren, um den BME gleichmäßig zu verteilen und Blasen zu vermeiden.
- Übertragen Sie 4 ml des verdünnten BME mit DMEM in jede Platte und schwenken Sie die Platte vorsichtig, so dass der BME gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie die beschichtete Platte für 1 h bei Raumtemperatur oder 30 min bei 37 °C.
HINWEIS: Verwenden Sie 50 μL BME pro 100 mm Platte. Die Verwendung anderer hPSC-Kulturmedien und Zelllinien kann unterschiedliche Konzentrationen von BME erfordern.
2. Weitergabe von hPSCs
HINWEIS: Für die routinemäßige hPSC-Kultur sind die Passage von Zelllinien bei 70-80% Konfluenz.
- Saugen Sie das Kulturmedium von der hPSC-Platte ab, die durchgelassen werden soll. Geben Sie ~ 8 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in die hPSC-Platte und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Zellen zu waschen.
- Aspirieren Sie DBPS und fügen Sie 2 ml sanftes Zelldissoziationsreagenz (GCDR) zu der 100-mm-Platte hinzu, tropfenweise darüber, um die Zellen abzudecken.
HINWEIS: Andere Dissoziationsreagenzien können ebenfalls verwendet werden. Passen Sie sich entsprechend an. - Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für ~ 6-8 Minuten, bis die Kolonien aufbrechen und die Zellen unter Phasenkontrast refraktiv sind (Abbildung 2A).
HINWEIS: Das Timing kann zwischen den Zelllinien variieren. Passen Sie sich entsprechend an. - Bereiten Sie während der Inkubation eine 50 ml konische Röhre vor. 16 ml hPSC-Medium (8 ml pro 100 mm Platte) zugeben und Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCKi) zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzufügen.
- Aspirieren Sie DMEM aus den BME-beschichteten Platten und fügen Sie jeder Platte 8 ml hPSC-Medium plus ROCKi hinzu.
- Wenn die Zellen bereit sind (wie in Punkt 2.3, Abbildung 2A beschrieben), saugen Sie den GCDR ab und neigen Sie die Platte um ~ 45 ° in Richtung des Experimentators und kratzen Sie die Zellen mit einem Zelllifter.
HINWEIS: Wenn die Zellen detatieren, lassen Sie die aspirierende GCDR weg und fahren Sie fort. - Drehen Sie die Platte um ~ 90 ° und kratzen Sie erneut, um die verbleibenden Zellen anzuheben. Halten Sie die Platte ~ 45 ° und waschen Sie die Zellen mit 3 ml hPSC-Medium mit einer serologischen 10 ml Pipette ab.
- Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um große Klumpen aufzubrechen (nicht mehr als 2-3 Mal) und säen Sie die Zellen im für die interessierenden Zelllinie geeigneten Verhältnis auf die vorbereiteten Platten. Legen Sie die Platte mit den Zellen in den Inkubator und bewegen Sie die Platte vorsichtig in acht Bewegungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden hPSC-Linien im Verhältnis 1:5 aufgeteilt, dies kann für andere Zelllinien und Bedingungen variieren. Lassen Sie den Teller über Nacht ungestört. - Nach ~ 24 h untersuchen Sie die Zellen auf Anhaftung. Suchen Sie nach kleinen einzelnen Kolonien, die angeschlossen sind. Das verbrauchte Medium absaugen und mit 8 ml frischem hPSC-Medium (kein ROCKi hinzugefügt) auffüllen.
- Beobachten und füttern Sie täglich, bis die Zellen ~ 60% Konfluenz erreichen, um den Nierenorganoid-Assay zu starten (normalerweise 48 bis 72 h nach dem Passieren erreicht). Die Kolonien sind idealerweise diskret und verschmelzen nicht (Abbildung 2B).
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Zellen auf nicht mehr als 80% Konfluenz zu begrenzen, um ihren Pluripotenzzustand aufrechtzuerhalten. Konfluierende Kulturen, grobe Handhabung oder höhere Passagen können zu unerwünschter spontaner Differenzierung oder geringer Effizienz der Nierenorganoidbildung führen.
3. Tag 0 - Einrichtung des Nierenorganoid-Assays
- Bevor Sie beginnen, bereiten Sie sowohl das E5-ILP- als auch das Stage II-Medium gemäß den Formulierungen vor (Tabelle 1 und Tabelle 2).
HINWEIS: Die Medien können bis zu 14 Tage bei 4 °C gelagert werden. - Für einen Nierenorganoid-Assay (eine 100-mm-Kulturplatte wird für eine 6-Well-Platte benötigt) ist ein komplettes E5-ILP-Medium in einem 50 mL konischen Röhrchen herzustellen: 18 ml E5-ILP, ergänzt mit 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol (32,7 μL).
- Legen Sie 2 ml vollständiges E5-ILP-Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte.
- Waschen Sie hPSCs bei ~ 60 % Konfluenz (Abbildung 2B) zweimal mit ~ 8 ml DPBS. Aspirieren Sie DPBs, fügen Sie dann 2 ml Dispase pro 100 mm Platte hinzu, tropfenweise um die Zellen abzudecken und inkubieren Sie für 6 Minuten bei 37 ° C.
HINWEIS: Nach 6 Minuten beginnen sich die Ränder der Kolonien zusammenzurollen (Abbildung 2C, rote Pfeile), während der Rest der Kolonie befestigt bleibt. Wenn dies nach 6 min nicht erreicht wird, legen Sie die Zellen für weitere 30 s wieder in den Inkubator. Andere hPSC-Medien und -Matrix sind möglicherweise nicht mit diesem Timing kompatibel. Die BME-Beschichtung auf Lamininbasis ist nicht mit Dispase kompatibel. Wenn lamininbasierte BME die Standard-hPSC-Matrix sind, beschichten Sie eine der Platten in Abschnitt 1 mit dem in diesem Verfahren beschriebenen BME, der für den Nierenorganoid-Assay verwendet werden soll. - Waschen Sie Zellen 3x mit ~ 10 ml DPBS. Aspirations-DPBS neigen dann die Platte um ~ 45 ° und kratzen Sie mit einem Zellenheber nach unten.
HINWEIS: Dispase ist nicht deaktiviert, daher muss es gründlich ausgewaschen werden. Reduzieren Sie nicht die Anzahl der Wäschen. - Waschen Sie die Kolonien von oben mit 6 ml vollständigem E5-ILP-Medium mit einer serologischen Pipette von 10 ml ab. Pipette sanft auf und ab, um große Kolonien aufzubrechen (2 oder 3 Mal ist normalerweise genug).
- Verteilen Sie die Koloniecluster gleichmäßig, indem Sie 1 ml pro Well in die 6-Well-Platte geben. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler (Einstellungen: Orbital = 30, Kehrwert = 330°, Vibration = 5° - 2 s), der in den 37 °C Inkubator gelegt wird (Abbildung 2D).
HINWEIS: Das Vibrationsmerkmal ist wichtig für eine ausreichende Verteilung von Organoiden und um ein Verklumpen zu verhindern.
4. Tag 2 - Fütterung durch Halb-Medium-Wechsel
HINWEIS: Innerhalb der 48 h bilden Koloniecluster embryonale Körper.
- Bereiten Sie das komplette Medium vor: Für eine 6-Well-Platte bereiten Sie 12 ml E5-ILP-Medium + 8 μM CHIR99021 in einem konischen 15-ml-Rohr vor.
HINWEIS: Beta-Mercaptoethanol und ROCKi sind nicht erforderlich. - Lassen Sie die embryonalen Körper sich an der Unterseite der Platte absetzen, neigen Sie die Platte ~ 45 ° und saugen Sie das Medium dann langsam von oben ab, lassen Sie ~ 1 ml pro Well.
HINWEIS: Embryonale Körper in diesem Stadium verklumpen schnell. Lassen Sie sie nicht für > 5 Minuten zufrieden geben. - Pro Vertiefung werden 2 ml vorbereitetes Vollmedium (Abschnitt 4.1) zugegeben. Bringen Sie die Platte zurück auf den Shaker.
5. Tag 3 - Transfer von embryonalen Körpern in Stadium II Medium
- Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Rohr und DMEM (Low Glucose) vor. Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der Platte niederlassen. Neigen Sie die Platte ~ 45 ° und saugen Sie das Medium langsam von oben ab, lassen Sie ~ 1 ml pro Well.
- Sammeln Sie alle embryonalen Körper sorgfältig aus jedem Brunnen mit einer serologischen Pipette von 10 ml und übertragen Sie sie in die 50 ml konische Röhre.
- Waschen Sie jede Welle, um alle verbleibenden embryonalen Körper mit ~ 1 ml DMEM (niedrige Glukose) zu sammeln und fügen Sie sie in die gleiche 50 ml konische Röhre hinzu.
- Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der Röhre absetzen, ~ 5 min. Fügen Sie während des Wartens 2 ml Medium der Stufe II zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Große embryonale Körper (>300 μm) mit einem 200 μm Zellsieb abtrennen (Abbildung 2E).
- Verwenden Sie ein neues konisches 50-ml-Rohr und legen Sie das 200-μm-Zellsieb darauf. Pipettieren Sie alle embryonalen Körper mit einer serologischen Pipette von 10 ml vorsichtig über das Zellsieb.
- Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen ~ 5 ml DMEM (niedrige Glukose) ab, um alle embryonalen Körper zu sammeln, die im Zellsieb stecken. Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der konischen Röhre absetzen.
- Wenn sich die embryonalen Körper abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit ~ 10 ml DMEM (Low Glucose).
- Aspirieren Sie DMEM und suspendieren Sie die embryonalen Körper in 6 ml Medium im Stadium II.
- Übertragen Sie die embryonalen Körper zurück in die 6 Well Ultra-Low-Attachment-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig auf die 6 Wells.
- Führen Sie jeden zweiten Tag einen halben Medienwechsel durch, wie in den Schritten 4.2 und 4.3 beschrieben.
HINWEIS: Ab Tag 3 haben die embryonalen Körper ein "goldenes" und glattes, kugelförmiges Aussehen (Abbildung 2F). Ab ~ Tag 6 wird sich die Tubulusbildung in einzelnen embryonalen Körpern zeigen, wobei die Anzahl der Tubuli in den folgenden Tagen bis zum 14. Tag eine optimale Anzahl und ein optimales Wachstum erreicht (Abbildung 2G, H). Um gelegentliche Verklumpungsbildungen zu vermeiden, sieben Sie bei visueller Beobachtung der Nierenorganoide oder sehr kleiner embryonaler Körper ohne Tubuli die Organoide <200 und große Organoide >500 μm mit einem Zellsieb von 500 und 200 μm aus, wie in den Schritten 5.4.1 und 5.4.2 beschrieben.
6. Überführung in den Spinnerkolben und Fütterung
HINWEIS: Ein Spinnkolben kann jederzeit ab Tag 3 für Experimente verwendet werden, die eine große Anzahl von Organoiden erfordern. Der routinemäßige Transfer von Organoiden erfolgt in unserem Labor zwischen den Tagen 6-8. Bitte lesen Sie den Diskussionsabschnitt für Alternativen, wenn keine Ausrüstung verfügbar ist.
- Transfer embryonaler Körper in einen 125 ml Spinnerkolben mit 45 ml Medium im Stadium II. Stellen Sie die magnetische Rührerdrehzahl auf 120 U/min ein und geben Sie sie in den Inkubator (Abbildung 2I).
- Um embryonale Körper oder Nierenorganoide zu füttern, lassen Sie die Nierenorganoide sich kurz am Boden des Spinnerkolbens absetzen. Heben Sie den Deckel von einem Seitenarm des Kolbens an und legen Sie die Ansaugpipette hinein, wobei die Spitze die gegenüberliegende Innenwand berührt.
- Winkeln Sie die Ansaugpipette langsam nach unten und aspirieren Sie etwa die Hälfte des Mediums. Mit 20 ml frischem Medium der Stufe II auffüllen, indem Sie es durch dieselbe Öffnung pipettieren.
7. Einrichten einer magnetischen 6-Well-Rührplatte (6MSP)
HINWEIS: Das 6MSP-Format kann anstelle von Spinnerkolben verwendet werden, wenn mehrere Bedingungen getestet werden müssen. Verwenden Sie den 6MSP für zusammengesetzte oder Nephrotoxin-Behandlungen. Dies spart die Menge an Medium, die in der zweiten Stufe verwendet wird, während die Nährstoffverfügbarkeit durch Diffusion erhalten bleibt.
- Reinigen Sie die ovalen magnetischen Rührstäbe in einem konischen 50-ml-Röhrchen, indem Sie es in einem für eine Gewebekultur geeigneten Reinigungsmittel kurz waschen (falls nie verwendet) oder bei vorherigem Gebrauch > 1 h einweichen.
- 3x in sterilem DPBS kurz waschen.
- Waschen Sie 1x für 5 min in 70% Ethanol, 1x in sterilem DPBS.
- Mit Antihaftlösung abspülen und 1x in sterilen DPBS waschen und aspirieren.
- Vorsichtig mit langen sterilen Pinzetten platzieren Sie einen magnetischen Rührstab in jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit embryoiden Körpern oder Nierenorganoiden.
- Legen Sie die Platte auf den 6MSP und stellen Sie die Drehzahl auf 120 U/min ein (Abbildung 2J). Nierenorganoide mit halbem Mediumwechsel gemäß Abschnitt 4.2 und 4.3 beibehalten.
HINWEIS: Damit die magnetischen Rührstäbe in Position schnappen und sich drehen können, müssen Sie möglicherweise zuerst das Leistungsniveau kurz auf 100 setzen, und dann, sobald sie sich alle drehen, das Leistungsniveau auf 25 senken.
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Representative Results
In dieser neuesten Version unseres Protokolls wird die Nierenorganoiddifferenzierung in einem definierten, proteinarmen Medium eingeleitet. Die Assays werden vollständig in Suspension durchgeführt und beruhen auf der angeborenen Fähigkeit der hPS-Differenzierung und -Organisation zur Einleitung der Tubulogenese. Ein einzelner Assay, der aus einer 100 mm ~60% konfluierenden hPSC-Kulturplatte stammt, liefert routinemäßig 500-1.000 Nierenorganoide, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung5 gezeigt. Aufgrund der hohen Anzahl der erzeugten Organoide eignet sich dieses Protokoll gut für die Prüfung von Verbindungen. Wir verwenden routinemäßig ein 6-Well-Format für Compound-Tests, aber dieses Protokoll kann in der zweiten Phase (ab Tag 3) leicht auf andere Multi-Well-Formate für Compound-Tests mit höherem Durchsatz skaliert werden. Die Immunfluoreszenz von Paraffinschnitten zeigt das Vorhandensein von Nephronsegmenten in den Organoiden, d. h. Nierentubuli, die Hepatozyten-Kernfaktor-1-beta (HNF1B) und Lotus-Tetragonolobus-Lektin (LTL) exprimieren (Abbildung 3A - HNF1B, LTL), und Podozytencluster, die V-maf Muskuloaponeurotisches Fibrosarkom Onkogenhomolog B (MAFB) und Nephrin (NPHS1) exprimieren (Abbildung 3A - MAFB, Abbildung 3B - NPHS1). Darüber hinaus können die Modifikationen in diesem Protokoll die Expansion von Endothelzellen unterstützen, wie in Abbildung 3B gezeigt, die die Färbung mit Thrombozyten- und Endothelzelladhäsionsmolekül 1 (PECAM1) am 26. Tag der Kultur zeigt.
| Reagenz | Lagerbestand | Arbeitsweise | Menge pro 250 mL |
| TeSR-E5 | n/a | n/a | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Stift-Streptokokken | 100x | 1x | 2,5 ml |
| ITSE | 100x | 0,1x | 250 μL |
| Chemisch definierte Lipide | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabelle 1: Mittlere Zusammensetzung von E5-ILP Pipette aller Reagenzien mit Ausnahme der chemisch definierten Lipide und des Antimykoplasmen-Reagenzes direkt in die obere Kammer einer 0,22 μm Stericup-Filtrationseinheit. Nach der Filtration fügen Sie die Lipide und das Antimykoplasmen-Reagenz hinzu. Bis zu zwei Wochen bei 4 °C lagern.
| Reagenz | Lagerbestand | Arbeitsweise | Menge pro 500 mL |
| DMEM (Low Glucose) | n/a | n/a | 417,5 ml |
| KOSR | n/a | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Stift-Streptokokken | 100x | 1x | 5 ml |
| MEM-NEAA | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| HEPES | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabelle 2: Mittlere Komposition der Stufe II Pipette alle Reagenzien außer Anti-Mykoplasmen-Reagenz direkt in die obere Kammer einer 0,22 μm Stericup-Filtrationseinheit. Nach der Filterung Anti-Mykoplasmen-Reagenz hinzufügen. Bis zu zwei Wochen bei 4 °C lagern.
Abbildung 1: Protokollübersicht Schematische Übersicht über das Protokoll, das das Timing der beiden Stufen und die Verwendung von Spinnerkolben und 6MSP zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Phasen des Protokolls . (A) Hellfeldbild der mit GCDR behandelten hPSC-Kolonie. (B) Optimale Konfluenz und Koloniegröße, um einen Nierenorganoid-Assay zu beginnen. (C) hPS-Werte, die 6 Minuten lang mit Dispase behandelt wurden. Rote Pfeile zeigen auf die Ränder der Kolonien, die sich zusammenrollen. (D) Organoid-Assays an einem Orbitalschüttler. (E) Verwendung von 200-μm-Zellsieb zum Aussieben großer embryonaler Körper. (F) Embryonalkörper am Tag 3 (D3) vor dem Transfer in das Medium im Stadium II. (G) Das Auftreten der Tubulusbildung kann am Tag 8 (D8) und (H) zum optimalen Zeitpunkt für die Organoidentnahme und -behandlung am Tag 14 (D14) beobachtet werden. (I) Spinnerkolben, der für die Bulk-Kultur auf einer mehrschichtigen Magnetplatte verwendet wird. (J) Assay auf einer magnetischen Multi-Well-Rührplatte. Maßstabsstäbe, 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Erwartete Ergebnisse . (A) Repräsentative konfokale Bilder von immunfluoreszenzmarkierten Paraffinabschnitten von Tag 14 Nierenorganoiden, die eine positive Färbung für Tubulusepithel (HNF1B und LTL) und Podozytencluster (MAFB) zeigen. (B) Tag 26 Nierenorganoidabschnitte, die für Podozytencluster (NPHS1) und Endothelzellen (PECAM1) markiert sind. Maßstabsstäbe, 100 μm (A); 200 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ersten Protokollschritte für die intermediäre Mesodermdifferenzierung 5,19,20 entscheidend sind, und daher ist es wichtig, in diesem Stadium eine stringente Mediumzusammensetzung zu implementieren. Die Entfernung undefinierter Komponenten wie Serum, Albumin, proteinfreies Hybridommedium II aus der ersten Phase des Protokolls kann dazu beitragen, die konsistente Differenzierungseffizienz zwischen Assays21 zu verbessern.
Der Stoffwechselzustand von Nierenzellen ist entscheidend für ihre Funktion, und Glukoseveränderungen können zu einem veränderten Stoffwechselzustandführen 22. Frühere Studien haben beschrieben, dass hohe Glukosespiegel (bis zu 25 mM) eine Dysfunktion der Endothelzellen induzieren und das Wachstum und die Oxidationsmittelkapazität der Nierenzellen verändernkönnen 22,23,24. Es wurde auch beschrieben, dass hohe Glukosespiegel die mitochondriale Funktionverändern 24, was bei der Untersuchung von Nierenerkrankungen und Nephrotoxizität oder der Durchführung von Arzneimittelentdeckungen mit Nierenorganoiden ungünstig sein kann. Wir haben daher den Glukosespiegel in unserem Protokoll reduziert, um einen mehr in vivo ähnlichen Stoffwechselzustand der organoiden Nierenzellen zu fördern. Infolgedessen bieten die Modifikationen am Nierenorganoid-Assay ein konsistentes, robustes Protokoll unter Beibehaltung seiner Einfachheit.
Nierenorganoide sind unreif, und eine verlängerte Kultur (>20 Tage) kann zur Inzidenz von profibrotischen und nicht-renalen Zelltypen führen, wie zuvor beschrieben 5,25, wodurch Organoide weniger repräsentativ für gesundes menschliches Nierengewebe bleiben. Basierend auf unserer Erfahrung ist das optimale Behandlungsfenster, in dem die Nierenorganoide am gesündesten sind, zwischen den Tagen 14-18. Die Verwendung von Spinnerkolben und magnetischen Multi-Well-Rührern, wie oben beschrieben, erhöht die gleichmäßige Nährstoffverfügbarkeit im Gegensatz zu statischen Kulturen21,26. Wenn die Ausrüstung für die Suspensionskultur wie der Shaker oder Magnetrührer nicht verfügbar ist, kann dieses Protokoll immer noch vollständig in den extrem niedrigen Befestigungsplatten in statischer Kultur durchgeführt werden. Es kann jedoch zu einer erhöhten Inzidenz von embryoiden Körpern / Organoid-Verschmelzungen kommen, was zu großen Proben mit nekrotischen Kernen aufgrund von Hypoxie führt. Alle Organoide, die größer als 500 μm sind, können mit den beschriebenen Zellsieben entfernt werden. Um die Wahrscheinlichkeit einer Verschmelzung der Organoide in diesen Fällen zu verringern, empfehlen wir, nicht mehr als 100 Organoide pro 6-Well zu säen. Darüber hinaus sollten die Organoide nach der Fütterung gleichmäßig verteilt werden, indem acht Bewegungen mit der Platte ausgeführt werden.
Ein geringer Wirkungsgrad (<50%) der Organoidbildung kann beobachtet werden. Dies tritt normalerweise auf, wenn die hPSC-Kulturen während des Standardpassagings eine hohe Konfluenz (>80%) erreicht haben. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die hPSC-Aufrechterhaltung konsistent ist und die Zellen nicht übermäßig konfluent werden. Hohe Konfluenz und inkonsistente Passing-Technik können auch zu spontaner Differenzierung und erhöhtem Zelltod führen. Wenn in der hPSC-Kultur eine Differenzierung vorhanden ist, empfehlen wir, die differenzierten Bereiche vor Beginn des Assays durch Absaugen mit einer feinen Pipettenspitze zu entfernen, wenn diese 5% der Zellpopulation nicht überschreitet. Wenn die Differenzierungsbereiche 5% überschreiten, empfehlen wir, dass eine neue Charge von hPSCs mindestens einmal aufgetaut und gespalten wird, bevor mit einem neuen Assay begonnen wird.
Wir haben beobachtet, dass einige hPSC-Linien anfälliger für die Bildung von nicht-renalen Zelltypen wie Herz- oder Nervengewebe sind. In diesem Fall kann die Größenfiltration mit den Zellsieben dazu beitragen, die Organoide zu entfernen, die nicht-renale Auswüchse enthalten. Alternativ kann der Wechsel des hPSC-Mediums und/oder der Matrix dazu beitragen, die nicht-renalen Auswüchse zu reduzieren. Aus unserer Erfahrung bieten alternative hPSC-Medien, die minimale Komponenten enthalten, und BME wie vitronectin, eine strengere pluripotente Nische und tragen so dazu bei, homogenere hPSC-Kulturen zu erzeugen.
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Disclosures
Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 und P30-DK079307 und ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program zu AP finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
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