Summary
Her beskriver vi en protokoll for å generere nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller (hPSCer). Denne protokollen genererer nyreorganoider innen to uker. De resulterende nyreorganoidene kan dyrkes i store spinnerflasker eller multi-brønn magnetiske røreplater for parallelle legemiddeltestingsmetoder.
Abstract
Nyreorganoider generert fra hPSCer har gitt en ubegrenset kilde til nyrevev. Humane nyreorganoider er et uvurderlig verktøy for å studere nyresykdom og skade, utvikle cellebaserte terapier og teste nye terapeutiske behandlinger. For slike applikasjoner er det nødvendig med et stort antall ensartede organoider og svært reproduserbare analyser. Vi har bygget på vår tidligere publiserte nyreorganoidprotokoll for å forbedre organoidenes generelle helse. Denne enkle, robuste 3D-protokollen innebærer dannelse av ensartede embryoide legemer i minimum komponentmedium som inneholder lipider, insulin-transferrin-selenium-etanamintilskudd og polyvinylalkohol med GSK3-hemmer (CHIR99021) i 3 dager, etterfulgt av kultur i knock-out serumerstatning (KOSR)-inneholdende medium. I tillegg gir agitating analyser mulighet for reduksjon i klumping av embryoide legemer og opprettholde en jevn størrelse, noe som er viktig for å redusere variasjon mellom organoider. Totalt sett gir protokollen en rask, effektiv og kostnadseffektiv metode for å generere store mengder nyreorganoider.
Introduction
I de senere år har en rekke protokoller for å skille menneskelige pluripotente stamceller til nyreorganoider blitt utviklet 1,2,3,4,5. Nyreorganoider har gitt et viktig verktøy for å hjelpe forskning på nye regenerative medisintilnærminger, modell nyrerelaterte sykdommer, utføre toksisitetsstudier og terapeutisk legemiddelutvikling. Til tross for deres brede anvendbarhet har nyreorganoider begrensninger som mangel på modning, begrenset langsiktig kulturkapasitet in vitro og en paucity av flere celletyper som finnes i den menneskeligenyren 6,7,8. Nyere arbeid har fokusert på å forbedre nivået av organoid modning, utvide kulturperiodene og utvide kompleksiteten i nyrecellepopulasjoner ved å endre de eksisterende protokollene 9,10,11,12. I denne nåværende gjentakelsen av vår etablerte protokoll 5,13 har vi modifisert mediumkomponentene i første fase av protokollen til et serumfritt basismedium supplert med insulin-transferrin-selenium-etanamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) og CHIR99021 (figur 1). Disse endringene gir et fullt definert, serumfritt lavproteinmedium, med færre komponenter enn vår tidligere middels sammensetning 5,13 og uten ekstra vekstfaktorer. Som et resultat er det første fasemediet mindre arbeidskrevende å forberede enn vår tidligere publiserte versjon, og kan redusere variasjonen fra parti til parti5. Tidligere studier har vist at både insulin og transferrin er viktige i serumfri kultur14,15, men høye nivåer av insulin kan være hemmende for mesoderm differensiering16. Vi har opprettholdt de lave insulinnivåene som følger med i den opprinnelige protokollen, og ytterligere reduserte nivåer av KOSR (som inneholder insulin) i andre fase av analysen. I tråd med andre protokoller for nyreorganoiddannelse, er lavere nivåer av KOSR gunstige for å opprettholde en balanse mellom spredning og differensiering av nyrevevet17. I tillegg har vi senket glukosekonsentrasjonen i vårt trinn II medium13.
Vår metode beskriver et oppsett for suspensjonsanalyse av nyreorganoider, noe som gir opptil ~ 1000 organoider fra en innledende ~ 60% konfluent hPSC 100 mm kulturplate som beskrevet i den opprinnelige publikasjonen 5,13. Denne protokollen kan enkelt skaleres opp til å starte med flere 100 mm eller 150 mm plater for å øke organoidtallene ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som brukte hPSCer ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, og ble utført i en klasse II biosikkerhetshette med passende personlig verneutstyr. Alle reagenser er cellekulturklasse med mindre annet er oppgitt. Alle kulturer inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 luftatmosfære. I alle stadier av analysen kan embryoide kropper eller nyreorganoider samles inn, og fikses eller forberedes for analyse. HPSC-linjene som brukes til å generere disse dataene, er fullstendig karakterisert og publisert18.
1. Utarbeide kulturplater
MERK: Ca. 1 time før oppdeling av hPSCer, strøk 2 x 100 mm vevskulturplater med stamcellekvalifisert kjellermembranmatriseekstrakt (BME). Man kan forhåndsbelegge platene, forsegle dem med en parafinfilm og lagre ved 4 °C i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered 2 x 100 mm vevskulturbehandlede plater (1 for nyreorganoidanalyse, 1 for å opprettholde cellelinjen) og et 15 ml konisk rør i klasse II biosikkerhetshette.
- Aliquot 8 ml kaldt, serumfritt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) i et 15 ml konisk rør og ~4 ml i hver av de 100 mm platene, nok til å dekke bunnen av hver plate med medium.
- Ta en 100 μL aliquot BME ut av fryseren (-20 °C). Bruk en 2 ml serologisk pipette, ta ~ 1 ml kald DMEM fra det koniske røret på 15 ml. Tin BME-aliquoten langsomt ved å pipette forsiktig opp og ned med den kalde DMEM, og unngå å lage bobler.
MERK: Ikke la BME aliquot sitte ved romtemperatur. Brukes umiddelbart. - Overfør det opptinte DMEM/BME tilbake til det koniske røret på 15 ml med den gjenværende DMEM. Med en 10 ml serologisk pipette blander du forsiktig den fortynnede BME ved å pipettere opp og ned minst 8 ganger for å jevnt spre BME, og unngå å lage bobler.
- Overfør 4 ml av den fortynnede BME i hver plate med DMEM og virvle platen forsiktig slik at BME fordeles jevnt. Inkuber den belagte platen i 1 time ved romtemperatur eller 30 min ved 37 °C.
MERK: Bruk 50 μL BME per 100 mm plate. Bruk av andre hPSC-kulturmedier og cellelinjer kan kreve forskjellige konsentrasjoner av BME.
2. Passivering av hPSCer
MERK: For rutinemessig hPSC-kultur, passasjecellelinjer ved 70-80% samløp.
- Aspirer kulturmediet fra hPSC-platen som skal passeres. Tilsett ~ 8 ml dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) til hPSC-platen og virvle forsiktig for å vaske cellene.
- Aspirer DBPS og tilsett 2 ml skånsom celledissosiasjonsreagens (GCDR) til 100 mm-platen, dråpe for dråpe på toppen for å dekke cellene.
MERK: Andre dissosiasjonsreagenser kan også brukes. Juster deretter. - Inkuber ved romtemperatur i ~6-8 min til koloniene bryter opp og cellene brytes opp under fasekontrast (figur 2A).
MERK: Tidsberegningen kan variere mellom cellelinjene. Juster deretter. - Mens du inkuberer, lag et 50 ml konisk rør. Tilsett 16 ml hPSC medium (8 ml per 100 mm plate) og tilsett Rho-assosiert kinasehemmer (ROCKi) i en endelig konsentrasjon på 5 μM.
- Aspirer DMEM fra de BME-belagte platene, og tilsett 8 ml hPSC medium pluss ROCKi til hver plate.
- Når cellene er klare (som beskrevet i punkt 2.3, figur 2A), aspirerer du GCDR og vipper platen ~ 45° mot eksperimentatoren og skraper cellene med en celleløfter.
MERK: Hvis cellene løsner, utelater du aspirerende GCDR og fortsetter. - Vri platen ~90° og skrap igjen for å løfte de resterende cellene. Hold platen ~ 45 ° og vask cellene ned med 3 ml hPSC-medium ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
- Rør forsiktig opp og ned for å bryte opp store klumper (ikke mer enn 2-3 ganger) og frø cellene i riktig forhold for cellelinjen av interesse på de forberedte platene. Plasser platen med cellene i inkubatoren og flytt platen forsiktig i figur åtte bevegelser for å fordele cellene jevnt.
MERK: I dette eksperimentet ble hPSC-linjer delt med et forhold på 1:5, dette kan variere for andre cellelinjer og forhold. La platen stå uforstyrret over natten. - Etter ~ 24 timer, undersøk cellene for vedlegg. Se etter små individuelle kolonier festet. Aspirer det brukte mediet og fyll på med 8 ml ferskt hPSC-medium (ingen ROCKi lagt til).
- Fortsett å observere og mate daglig til cellene når ~ 60% samløp for å starte nyreorganoidanalysen (vanligvis nådd 48 til 72 h post passaging). Koloniene vil ideelt sett være diskrete og ikke fusjonere (figur 2B).
MERK: Det er svært viktig å begrense cellene til ikke mer enn 80% samløp for å opprettholde sin pluripotenstilstand. Konfluente kulturer, grov håndtering eller høyere passasjer kan føre til uønsket spontan differensiering eller lav effektivitet av nyreorganoiddannelse.
3. Dag 0 - Sette opp nyre organoid analyse
- Før du starter, klargjør du både E5-ILP- og Stage II-mediet i henhold til formuleringer (tabell 1 og tabell 2).
MERK: Mediet kan oppbevares i opptil 14 dager ved 4 °C. - For en nyre organoid analyse (en 100 mm kulturplate er nødvendig for en 6-brønns plate), forberede komplett E5-ILP medium i en 50 ml konisk rør: 18 ml E5-ILP supplert med 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-mercaptoetanol (32,7 μL).
- Plasser 2 ml komplett E5-ILP-medium i hver brønn på en 6 brønn ultralav festeplate.
- Vask hPSCer ved ~60 % samløp (figur 2B) to ganger med ~ 8 ml DPBS. Aspirat DPBS tilsett deretter 2 ml dispase per 100 mm plate, dråpe for dråpe for å dekke cellene og inkubere i 6 min ved 37 °C.
MERK: Etter 6 min vil kantene på koloniene begynne å krølle seg opp (figur 2C, røde piler) mens resten av kolonien forblir festet. Hvis dette ikke oppnås etter 6 min, plasser cellene tilbake i inkubatoren i ytterligere 30 s. Andre hPSC-medier og -matriser er kanskje ikke kompatible med denne tidsberegningen. Lamininbasert BME-belegg er ikke kompatibelt med dispase. Hvis lamininbasert BME er standard hPSC-matrise, belegge en av platene i avsnitt 1 med BME beskrevet i denne metoden som skal brukes til nyreorganoidanalysen. - Vask cellene 3x med ~10 ml DPBS. Aspirer DPBS vipp deretter platen ~ 45 ° og skrap ned med en celleløfter.
MERK: Dispase er ikke deaktivert, derfor må den vaskes grundig ut. Ikke reduser antall vasker. - Vask koloniene ned fra toppen med 6 ml komplett E5-ILP-medium ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Pipette opp og ned forsiktig for å bryte opp store kolonier (2 eller 3 ganger er vanligvis nok).
- Fordel koloniklyngene jevnt ved å tilsette 1 ml per brønn i 6-brønnsplaten. Plasser platen på en orbital shaker (innstillinger: orbital = 30, resiprokal = 330°, vibrasjon = 5° - 2 s) som er plassert i 37 °C inkubatoren (figur 2D).
MERK: Vibrasjonsfunksjonen er viktig for tilstrekkelig fordeling av organoider og for å forhindre klumping.
4. Dag 2 - Fôring ved halv middels endring
MERK: Innen 48 timer vil koloniklynger danne embryoide kropper.
- Forbered hele mediet: For en 6-brønns plate forberede 12 ml E5-ILP medium + 8 μM CHIR99021 i et 15 ml konisk rør.
MERK: Beta-mercaptoetanol og ROCKi er ikke nødvendig. - La de embryoide kroppene slå seg ned på bunnen av platen, vipp platen ~ 45 ° og aspirer deretter mediet sakte fra toppen, la ~ 1 ml per brønn.
MERK: Embryoide kropper på dette stadiet klumper seg raskt. Ikke la dem slå seg til ro med > 5 min. - Tilsett 2 ml preparert komplett medium (pkt. 4.1) per brønn. Sett platen tilbake på shakeren.
5. Dag 3 - Overføring av embryoide legemer til trinn II medium
- Forbered et 50 ml konisk rør og DMEM (lav glukose). La de embryoide kroppene bosette seg på bunnen av platen. Vipp platen ~ 45 ° og aspirer mediet sakte fra toppen, la ~ 1 ml per brønn.
- Samle alle embryoide legemer forsiktig fra hver brønn ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og overfør dem til det koniske røret på 50 ml.
- Vask hver brønn for å samle eventuelle gjenværende embryoide legemer med ~ 1 ml DMEM (lav glukose) og legg dem til samme 50 ml koniske rør.
- La de embryoide kroppene slå seg ned til bunnen av røret, ~ 5 min. Mens du venter, tilsett 2 ml trinn II medium til hver brønn av 6-brønnsplaten. Seive ut store embryoide legemer (>300 μm) ved hjelp av en 200 μm cellesil (figur 2E).
- Bruk et nytt konisk rør på 50 ml og plasser 200 μm cellesilen på toppen. Pipette alle embryoide legemer ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette forsiktig over cellesilen.
- Skyll cellesilen med ytterligere ~ 5 ml DMEM (lav glukose) for å samle eventuelle embryoide kropper som sitter fast i cellesilen. La de embryoide kroppene slå seg ned til bunnen av det koniske røret.
- Når de embryoide kroppene er avgjort, aspirer supernatanten og vask med ~ 10 ml DMEM (lav glukose).
- Aspirer DMEM og re-suspendere embryoide legemer i 6 ml av trinn II medium.
- Overfør de embryoide kroppene tilbake til den 6 brønn ultra-lave festeplaten, og fordel dem jevnt blant de 6 brønnene.
- Utfør halve middels endringer som beskrevet i trinn 4.2 og 4.3 annenhver dag.
MERK: Fra dag 3 og utover vil de embryoide kroppene ha et "gyldent" og glatt, sfærisk utseende (figur 2F). Fra ~ dag 6 vil tubuledannelse i individuelle embryoide legemer bli tydelig, med økende antall i løpet av de følgende dagene som når optimale tall og vekst etter dag 14 (figur 2G, H). For å eliminere sporadisk klumpforming, ved visuelt å observere nyreorganoidene, eller svært små embryoide legemer uten tubules, sikt ut <200 og store > 500 μm organoider med en 500 og 200 μm cellesiler som beskrevet i trinn 5.4.1 og 5.4.2.
6. Overfør til spinnerflaske og fôring
MERK: En spinnerflaske kan brukes når som helst fra dag 3 og utover for eksperimenter som krever et stort antall organoider. Rutinemessig overføring av organoider skjer i laboratoriet vårt mellom dag 6-8. Se diskusjonsdelen for alternativer hvis utstyr ikke er tilgjengelig.
- Overfør embryoide kropper til en 125 ml spinnerflaske med 45 ml trinn II medium. Sett magnetisk rørehastighet på 120 o/min og plasser den i inkubatoren (figur 2I).
- For å mate embryoide kropper eller nyreorganoider, la nyreorganoidene slå seg kort til bunnen av spinnerflasken. Løft lokket fra den ene sidearmen på kolben og plasser den aspirerende pipetten inni, med spissen som berører motsatt innvendig vegg.
- Vinkle den aspirerende pipetten langsomt ned og aspirer omtrent halvparten av mediet. Fyll på med 20 ml friskt Stage II-medium ved å pipette det gjennom samme åpning.
7. Sette opp 6-brønns magnetisk røreplate (6MSP)
MERK: 6MSP-formatet kan brukes i stedet for spinnerflasker hvis flere forhold må testes. Bruk 6MSP til sammensatte eller nefrotoksinbehandlinger. Dette sparer mengden medium som brukes i andre fase, samtidig som næringstilgjengeligheten opprettholdes gjennom diffusjon.
- Rengjør de ovale magnetiske rørestengene i et konisk rør på 50 ml ved å vaske i et vevskultur egnet vaskemiddel kort (hvis det aldri brukes) eller suge i > 1 time hvis det brukes tidligere.
- Vask kort 3x i steril DPBS.
- Vask 1x i 5 min i 70% etanol, 1x i steril DPBS.
- Skyll med anti-tilslutningsløsning og vask 1x i steril DPBS og aspirer.
- Forsiktig, bruk lange sterile tang plasserer en magnetisk rørestang i hver brønn av 6-brønnsplaten med embryoide kropper eller nyreorganoider.
- Plasser platen på 6MSP og sett hastigheten til 120 o/min (figur 2J). Opprettholde nyreorganoider med halv middels endring i henhold til pkt. 4.2 og 4.3.
MERK: For at de magnetiske rørestengene skal komme på plass og begynne å spinne, må du kanskje først sette effektnivået til 100 kort, så når de alle spinner, ta kraftnivået ned til 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne nyeste versjonen av vår protokoll initieres nyreorganoid differensiering i et definert lavproteinmedium. Analysene utføres helt i suspensjon og er avhengige av den medfødte evnen til hPSCs differensiering og organisasjon for initiering av tubulogenesis. En enkelt analyse som stammer fra en 100 mm ~ 60% sammenfallende hPSC kulturplate gir rutinemessig 500-1000 nyreorganoider, som vist i vår forrige publikasjon5. På grunn av så høyt antall organoider generert, er denne protokollen godt egnet for sammensatt testing. Vi bruker rutinemessig et 6-brønns format for sammensatt testing, men denne protokollen kan enkelt skaleres i andre fase (dag 3 og utover) til andre multi-brønnformater for høyere gjennomstrømningsforbindelsestesting. Immunfluorescens av parafinseksjoner viser tilstedeværelse av nefrosegmenter i organoidene, det vil si nyre tubuli som uttrykker Hepatocyte Nuclear Factor-1 beta (HNF1B) og Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL) (figur 3A - HNF1B, LTL) og podocyttklynger som uttrykker V-maf Muskculoaponeurotic Fibrosarcoma oncogene homolog B (MAFB) og nephrin (NPHS1) (Figur 3A - MAFB, figur 3B - NPHS1). Videre kan modifikasjonene i denne protokollen støtte utvidelse av endotelceller sett i figur 3B som viser farging med blodplate og endotelcelleadhesjonsmolekyl 1 (PECAM1) på dag 26 av kulturen.
| Reagent | Lager innbilsk. | Jobber med conc. | Mengde per 250 ml |
| Tesr-E5 | N/a | N/a | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Penn-strep | 100x | 1x | 2,5 ml |
| DENSE | 100x | 0,1x | 250 μL |
| Kjemisk definerte lipider | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabell 1: E5-ILP middels sammensetning. Pipette alle reagensene unntatt de kjemisk definerte lipidene og anti-mykoplasma-reagenset direkte inn i det øvre kammeret til en filtreringsenhet på 0,22 μm Stericup. Etter filtrering, legg til lipider og anti-mykoplasma reagens. Oppbevars ved 4 °C i opptil to uker.
| Reagent | Lager innbilsk. | Jobber med conc. | Mengde per 500 ml |
| DMEM (lav glukose) | N/a | N/a | 417,5 ml |
| KOSR | N/a | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Penn-strep | 100x | 1x | 5 ml |
| MEM-NEAA | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| HEPES | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabell 2: Fase II middels sammensetning. Pipette alle reagensene unntatt og anti-mykoplasma reagens direkte inn i det øvre kammeret til en 0,22 μm Stericup filtreringsenhet. Når det er filtrert, legg til anti-mykoplasma reagens. Oppbevars ved 4 °C i opptil to uker.
Figur 1: Protokolloversikt. Skjematisk oversikt over protokollen som viser tidspunkt for de to stadiene og bruk av spinnerflasker og 6MSP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stadier av protokollen. (A) Lysfeltbilde av hPSC-koloni behandlet med GCDR. (B) Optimal samløp, og kolonistørrelse for å starte en nyre organoid analyse. (C) hPSCer behandlet med dispase i 6 minutter. Røde piler peker på kantene på koloniene som krøller seg oppover. (D) Organoidanalyser på en orbital shaker. (E) Bruk av 200 μm cellesil for å sile ut store embryoide legemer. (F) Embryoide legemer på dag 3 (D3) før overføring til trinn II medium. (G) Fremveksten av tubuledannelse kan observeres på dag 8 (D8) og (H) optimalt tidspunkt for organoid høsting og behandling på dag 14 (D14). (I) Spinnerflaske som brukes til bulkkultur på en magnetisk plate med flere posisjoner. (J) Analyse på en magnetisk røreplate med flere brønner. Skalastenger, 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forventede resultater. (A) Representative konfokale bilder av immunfluorescently merket parafin deler av dag 14 nyreorganoider som viser positiv farging for tubule epithelia (HNF1B og LTL) og podocyttklynger (MAFB). (B) Dag 26 nyreorganoide seksjoner merket for podocyttklynger (NPHS1) og endotelceller (PECAM1). Skalastenger, 100 μm (A); 200 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier har vist at de første protokolltrinnene er kritiske for mellomliggende mesoderm differensiering 5,19,20 og derfor er det viktig å implementere en streng middels sammensetning på dette stadiet. Fjerning av udefinerte komponenter som serum, albumin, proteinfritt hybridom medium II fra første fase av protokollen kan bidra til å forbedre konsistent differensieringseffektivitet mellom analysene21.
Den metabolske tilstanden til nyreceller er avgjørende for deres funksjon, og glukoseendringer kan føre til endret metabolsk tilstand22. Tidligere studier har beskrevet at høye nivåer av glukose (opptil 25 mM) kan indusere endotelcelledysfunksjon og endre vekst og oksidant kapasitet i nyreceller 22,23,24. Høye nivåer av glukose har også blitt beskrevet for å endre mitokondriefunksjon24, noe som kan være ugunstig når man undersøker nyresykdom og nefrotoksisitet eller utfører legemiddeloppdagelse ved hjelp av nyreorganoider. Vi har derfor redusert nivået av glukose i vår protokoll for å fremme en mer in vivo-lignende metabolsk tilstand av organoid nyreceller. Som et resultat gir modifikasjonene til nyreorganoidanalysen en konsistent, robust protokoll, samtidig som den opprettholder sin enkelhet.
Nyreorganoider er umodne, og utvidet kultur (>20 dager) kan føre til forekomst av pro-fibrotiske og ikke-nyrecelletyper som tidligere beskrevet 5,25, slik at organoider blir mindre representative for sunt humant nyrevev. Basert på vår erfaring er det optimale behandlingsvinduet, hvor nyreorganoidene er på sitt sunneste mellom dag 14-18. Bruk av spinnerflasker og magnetiske omrørere med flere brønner som beskrevet ovenfor, vil forbedre jevn næringstilgjengelighet i motsetning til statisk kultur21,26. Hvis utstyret til fjæringskultur som shaker eller magnetiske omrørere ikke er tilgjengelig, kan denne protokollen fortsatt utføres helt i de ultra-lave festeplatene i statisk kultur. Det kan imidlertid være økt forekomst av embryoide legemer/organoidsammenslåing, noe som fører til store prøver med nekrotiske kjerner på grunn av hypoksi. Alle organoider større enn 500 μm kan fjernes ved hjelp av de beskrevne cellesilene. For å redusere sjansen for sammenslåing av organoidene i disse tilfellene, foreslår vi at du ikke sår mer enn 100 organoider per 6-brønn. I tillegg, etter fôring, bør organoidene fordeles jevnt ved å utføre figur åtte bevegelser med platen.
Lav effektivitet (<50%) av organoiddannelse kan observeres. Dette skjer vanligvis når hPSC-kulturene har nådd høy samløp (>80%) under standard passivisering. Det er viktig at hPSC-vedlikehold er konsistent og at cellene ikke blir overkonfluente. Høy samløp og inkonsekvent passivitetsteknikk kan også føre til spontan differensiering og økt celledød. Hvis differensiering er til stede i hPSC-kulturen, anbefaler vi å fjerne de differensierte områdene ved å aspirere med en fin pipettespiss hvis den ikke overstiger 5% av cellepopulasjonen, før du starter analysen. Hvis differensieringsområdene overstiger 5%, anbefaler vi at en ny gruppe hPSCer tines og deles minst en gang før du starter en ny analyse.
Vi har observert at noen hPSC-linjer er mer utsatt for å danne ikke-nyrecelletyper, for eksempel hjerte- eller nevralt vev. Hvis dette skjer, kan størrelsesfiltrering ved hjelp av cellesilene bidra til å fjerne de organoidene som inneholder ikke-nyre utvekster. Alternativt kan endring av hPSC medium og / eller matrise bidra til å redusere ikke-nyre utvekster. Fra vår erfaring gir alternative hPSC-medier som inneholder minimumskomponenter, og BME som vitronectin, en strengere pluripotent nisje og bidrar dermed til å generere mer homogene hPSC-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 og P30-DK079307 og ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program til AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).
