Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att generera njurorganoider från humana pluripotenta stamceller (hPSC). Detta protokoll genererar njurorganoider inom två veckor. De resulterande njurorganoiderna kan odlas i storskaliga spinnkolvar eller magnetiska omrörningsplattor med flera brunnar för parallella läkemedelstestmetoder.
Abstract
Njurorganoider genererade från hPSC har gett en obegränsad källa till njurvävnad. Mänskliga njurorganoider är ett ovärderligt verktyg för att studera njursjukdom och skada, utveckla cellbaserade terapier och testa nya terapier. För sådana tillämpningar behövs ett stort antal enhetliga organoider och mycket reproducerbara analyser. Vi har byggt vidare på vårt tidigare publicerade njurorganoidprotokoll för att förbättra organoidernas allmänna hälsa. Detta enkla, robusta 3D-protokoll involverar bildandet av enhetliga embryoidkroppar i minsta komponentmedium innehållande lipider, insulin-transferrin-selen-etanolamintillskott och polyvinylalkohol med GSK3-hämmare (CHIR99021) i 3 dagar, följt av odling i utslagssersättning av serumersättning (KOSR) -innehållande medium. Dessutom möjliggör agiterande analyser minskning av klumpning av embryoidkropparna och upprätthållande av en enhetlig storlek, vilket är viktigt för att minska variationen mellan organoider. Sammantaget ger protokollet en snabb, effektiv och kostnadseffektiv metod för att generera stora mängder njurorganoider.
Introduction
Under de senaste åren har ett antal protokoll för att differentiera humana pluripotenta stamceller till njurorganoider utvecklats 1,2,3,4,5. Njurorganoider har tillhandahållit ett viktigt verktyg för att hjälpa forskning om nya regenerativa medicinska metoder, modellera njurrelaterade sjukdomar, utföra toxicitetsstudier och terapeutisk läkemedelsutveckling. Trots deras breda tillämplighet har njurorganoider begränsningar som brist på mognad, begränsad långsiktig odlingskapacitet in vitro och en brist på flera celltyper som finns i den mänskliga njuren 6,7,8. Det senaste arbetet har fokuserat på att förbättra nivån av organoidmognad, förlänga odlingsperioderna och utöka komplexiteten hos njurcellpopulationer genom att ändra de befintliga protokollen 9,10,11,12. I denna nuvarande iteration av vårt etablerade protokoll 5,13 har vi modifierat mediekomponenterna i det första steget i protokollet till ett serumfritt basmedium kompletterat med insulin-transferrin-selen-etanolamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) och CHIR99021 (Figur 1). Dessa förändringar ger ett fullständigt definierat, serumfritt, proteinfattigt medium, med mindre komponenter än vår tidigare mediumsammansättning 5,13 och utan ytterligare tillväxtfaktorer. Som ett resultat är det första stegets medium mindre arbetsintensivt att förbereda än vår tidigare publicerade version och kan minska batch-till-batch-variabiliteten5. Tidigare studier har visat att både insulin och transferrin är viktiga i serumfri odling14,15, men höga nivåer av insulin kan hämma mesodermdifferentiering16. Vi har bibehållit de låga insulinnivåerna som anges i det ursprungliga protokollet och ytterligare minskat nivåerna av KOSR (innehållande insulin) i andra etappen av analysen. I linje med andra protokoll för njurorganoidbildning är lägre nivåer av KOSR fördelaktiga för att upprätthålla en balans mellan proliferation och differentiering av njurvävnaden17. Dessutom har vi sänkt glukoskoncentrationen i vårt steg II-medium13.
Vår metod beskriver en inställning för suspensionsanalys av njurorganoider, vilket ger upp till ~ 1000 organoider från en initial ~ 60% sammanflytande hPSC 100 mm odlingsplatta som beskrivs i den ursprungliga publikationen 5,13. Detta protokoll kan enkelt skalas upp till att börja med flera 100 mm eller 150 mm plattor för att ytterligare öka organoidantalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med hPSC utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och utfördes i en klass II biosäkerhetskåpa med lämplig personlig skyddsutrustning. Alla reagenser är av cellodlingskvalitet om inget annat anges. Alla kulturer inkuberas vid 37 ° C, 5% CO2 luftatmosfär. I alla stadier av analysen kan embryoidkroppar eller njurorganoider samlas in och fixeras eller förberedas för analys. De hPSC-linjer som används för att generera dessa data har karakteriserats fullständigt och publicerats18.
1. Förbereda odlingsplattor
OBS: Cirka 1 timme före delning av hPSC, täck 2 x 100 mm vävnadsodlingsplattor med ett stamcellskvalificerat basalmembranmatrisextrakt (BME). Man kan förbelägga plattorna, försegla dem med en paraffinfilm och förvara dem vid 4 °C enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered 2 x 100 mm vävnadsodlingsbehandlade plattor (1 för njurorganoidanalys, 1 för att upprätthålla cellinjen) och ett 15 ml koniskt rör i biosäkerhetshuven i klass II.
- Aliquot 8 ml kallt, serumfritt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) i ett 15 ml koniskt rör och ~ 4 ml i var och en av de 100 mm plattorna, tillräckligt för att täcka botten av varje platta med medium.
- Ta ut en 100 μL alikvot BME ur frysen (-20 °C). Använd en 2 ml serologisk pipett, ta ~ 1 ml kall DMEM från det 15 ml koniska röret. Tina långsamt BME-alikvoten genom att försiktigt pipettera upp och ner med den kalla DMEM och undvika att göra bubblor.
OBS: Låt inte BME-alikvot sitta vid rumstemperatur. Använd omedelbart. - Överför det tinade DMEM/BME tillbaka till det 15 ml koniska röret med återstående DMEM. Blanda försiktigt den utspädda BME med en 10 ml serologisk pipett genom att pipettera upp och ner minst 8 gånger för att jämnt sprida BME, för att undvika att göra bubblor.
- Överför 4 ml av den utspädda BME till varje platta med DMEM och virvla försiktigt plattan så att BME fördelas jämnt. Inkubera den belagda plattan i 1 timme vid rumstemperatur eller 30 min vid 37 °C.
OBS: Använd 50 μL BME per 100 mm platta. Användning av andra hPSC-odlingsmedier och cellinjer kan kräva olika koncentrationer av BME.
2. Passerande hPSC
OBS: För rutinmässig hPSC-odling, passagecellinjer vid 70-80% sammanflöde.
- Aspirera odlingsmediet från hPSC-plattan som ska passeras. Tillsätt ~ 8 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) till hPSC-plattan och virvla försiktigt för att tvätta cellerna.
- Aspirera DBPS och tillsätt 2 ml mjukt celldissociationsreagens (GCDR) till 100 mm-plattan, droppe för droppe ovanpå för att täcka cellerna.
OBS: Andra dissociationsreagens kan också användas. Justera därefter. - Inkubera vid rumstemperatur i ~ 6-8 minuter tills kolonierna bryts upp och cellerna bryts under faskontrast (Figur 2A).
OBS: Tidpunkten kan variera mellan cellinjer. Justera därefter. - Förbered ett koniskt rör på 50 ml medan du inkuberar. Tillsätt 16 ml hPSC-medium (8 ml per 100 mm platta) och tillsätt Rho-associerad kinashämmare (ROCKi) till en slutlig koncentration av 5 μM.
- Aspirera DMEM från de BME-belagda plattorna och tillsätt 8 ml hPSC-medium plus ROCKi till varje platta.
- När cellerna är klara (som beskrivs i punkt 2.3, figur 2A), aspirera GCDR och luta plattan ~ 45 ° mot experimenten och skrapa cellerna med en celllyftare.
OBS: Om celler lossnar, utelämna aspirerande GCDR och fortsätt. - Vrid plattan ~ 90 ° och skrapa igen för att lyfta de återstående cellerna. Håll plattan ~ 45 ° och tvätta cellerna med 3 ml hPSC-medium med en 10 ml serologisk pipett.
- Pipettera försiktigt upp och ner för att bryta upp stora klumpar (högst 2-3 gånger) och frö cellerna i lämpligt förhållande för cellinjen av intresse på de beredda plattorna. Placera plattan med cellerna i inkubatorn och flytta plattan försiktigt i figur åtta rörelser för att fördela cellerna jämnt.
OBS: I detta experiment delades hPSC-linjer i ett förhållande av 1: 5, detta kan variera för andra cellinjer och förhållanden. Lämna tallriken ostörd över natten. - Efter ~ 24 timmar, undersök cellerna för fastsättning. Leta efter små enskilda kolonier bifogade. Aspirera det förbrukade mediet och fyll på med 8 ml färskt hPSC-medium (ingen ROCKi tillsatt).
- Fortsätt observera och mata dagligen tills cellerna når ~ 60% sammanflöde för att starta njurorganoidanalysen (vanligtvis nått 48 till 72 timmar efter passaging). Kolonierna kommer helst att vara diskreta och inte sammanfoga (figur 2B).
OBS: Det är mycket viktigt att begränsa cellerna till högst 80% sammanflöde för att bibehålla deras pluripotenstillstånd. Konfluenta kulturer, grov hantering eller högre passager kan leda till oönskad spontan differentiering eller låg effektivitet av njurorganoidbildning.
3. Dag 0 - Ställa in njurorganoidanalysen
- Innan du börjar, förbered både E5-ILP- och steg II-mediet enligt formuleringar (tabell 1 och tabell 2).
OBS: Mediet kan lagras i upp till 14 dagar vid 4 °C. - För en njurorganoidanalys (en 100 mm odlingsplatta behövs för en 6-brunnsplatta), förbered komplett E5-ILP-medium i ett 50 ml koniskt rör: 18 ml E5-ILP kompletterat med 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-merkaptoetanol (32,7 μL).
- Placera 2 ml komplett E5-ILP-medium i varje brunn på en 6 brunn ultralåg fästplatta.
- Tvätta hPSC vid ~ 60 % sammanflöde (figur 2B) två gånger med ~ 8 ml DPBS. Aspirera DPBS tillsätt sedan 2 ml dispas per 100 mm platta, droppe för droppe för att täcka cellerna och inkubera i 6 minuter vid 37 ° C.
OBS: Efter 6 minuter börjar koloniernas kanter krulla upp (figur 2C, röda pilar) medan resten av kolonin förblir fäst. Om detta inte erhålls efter 6 minuter, placera cellerna tillbaka i inkubatorn i ytterligare 30 s. Andra hPSC-medier och matriser kanske inte är kompatibla med den här tidpunkten. Lamininbaserad BME-beläggning är inte kompatibel med dispas. Om lamininbaserad BME är standard hPSC-matrisen, täck en av plattorna i avsnitt 1 med den BME som beskrivs i denna metod för att användas för njurorganoidanalysen. - Tvätta celler 3x med ~ 10 ml DPBS. Aspirera DPBS luta sedan plattan ~ 45 ° och skrapa ner med en celllyftare.
OBS: Dispase är inte avaktiverat, därför måste det tvättas ut noggrant. Minska inte antalet tvättar. - Tvätta kolonierna ner från toppen med 6 ml komplett E5-ILP-medium med en 10 ml serologisk pipett. Pipettera försiktigt upp och ner för att bryta upp stora kolonier (2 eller 3 gånger räcker vanligtvis).
- Fördela koloniklusterna jämnt genom att tillsätta 1 ml per brunn i 6-brunnsplattan. Placera plattan på en orbital shaker (inställningar: orbital = 30, reciprocal = 330 °, vibration = 5 ° - 2 s) som placeras i 37 ° C inkubatorn (Figur 2D).
OBS: Vibrationsfunktionen är viktig för adekvat fördelning av organoider och för att förhindra klumpning.
4. Dag 2 - Matning genom halvmediumförändring
OBS: Inom 48 timmar kommer kolonikluster att bilda embryoidkroppar.
- Förbered hela mediet: För en 6-brunnsplatta förbered 12 ml E5-ILP-medium + 8 μM CHIR99021 i ett 15 ml koniskt rör.
OBS: Beta-merkaptoetanol och ROCKi krävs inte. - Låt embryoidkropparna sätta sig längst ner på plattan, luta plattan ~ 45 ° och aspirera sedan mediet långsamt från toppen, lämna ~ 1 ml per brunn.
OBS: Embryoidkroppar i detta skede klumpar sig snabbt. Låt dem inte nöja sig med > 5 minuter. - Tillsätt 2 ml beredd komplett medium (avsnitt 4.1) per brunn. Sätt tillbaka plattan på skakaren.
5. Dag 3 - Överföring av embryoidkroppar till steg II-medium
- Förbered ett 50 ml koniskt rör och DMEM (låg glukos). Låt embryoidkropparna sätta sig längst ner på plattan. Luta plattan ~ 45 ° och aspirera mediet från toppen långsamt, lämna ~ 1 ml per brunn.
- Samla alla embryoidkroppar noggrant från varje brunn med en 10 ml serologisk pipett och överför dem till 50 ml koniskt rör.
- Tvätta varje brunn för att samla eventuella kvarvarande embryoidkroppar med ~ 1 ml DMEM (låg glukos) och tillsätt dem till samma 50 ml koniska rör.
- Låt embryoidkropparna sätta sig till botten av röret, ~ 5 min. Medan du väntar, tillsätt 2 ml steg II-medium till varje brunn på 6-brunnsplattan. Seive ut stora embryoida kroppar (>300 μm) med hjälp av en 200 μm cellsil (Figur 2E).
- Använd ett nytt 50 ml koniskt rör och placera 200 μm cellsilen ovanpå. Pipettera alla embryoidkroppar med hjälp av en 10 ml serologisk pipett försiktigt över cellsilen.
- Skölj cellsilen med ytterligare ~ 5 ml DMEM (låg glukos) för att samla eventuella embryoidkroppar som sitter fast i cellsilen. Låt embryoidkropparna sätta sig i botten av det koniska röret.
- När embryoidkropparna är sedimenterade, aspirera supernatanten och tvätta med ~ 10 ml DMEM (låg glukos).
- Aspirera DMEM och suspendera embryoidkropparna i 6 ml steg II-medium.
- Överför embryoidkropparna tillbaka till den 6 brunnen ultralåga fästplattan och fördela dem jämnt mellan de 6 brunnarna.
- Utför halva mediumförändringar enligt beskrivningen i steg 4.2 och 4.3 varannan dag.
OBS: Från dag 3 och framåt kommer embryoidkropparna att ha ett "gyllene" och slätt, sfäriskt utseende (figur 2F). Från ~ dag 6 kommer tubulbildning i enskilda embryoidkroppar att bli uppenbar, med ökande antal under de följande dagarna som når optimalt antal och tillväxt vid dag 14 (Figur 2G, H). För att eliminera tillfällig klumpningsformning, efter att visuellt ha observerat njurorganoiderna, eller mycket små embryoidkroppar utan tubuler, sikta ut de <200 och stora > 500 μm organoiderna med en 500 och 200 μm cellsilar enligt beskrivningen i steg 5.4.1 och 5.4.2.
6. Överför till spinnkolv och matning
OBS: En spinnerkolv kan användas när som helst från dag 3 och framåt för experiment som kräver ett stort antal organoider. Rutinmässig överföring av organoider sker i vårt laboratorium mellan dag 6-8. Se avsnittet Diskussion för alternativ om utrustning inte är tillgänglig.
- Överför embryoidkroppar till en 125 ml spinnerkolv med 45 ml steg II-medium. Ställ in magnetisk omrörarhastighet till 120 rpm och placera i inkubatorn (Figur 2I).
- För att mata embryoida kroppar eller njurorganoider, låt njurorganoiderna sätta sig kort till botten av spinnerkolven. Lyft locket från kolvens ena sidoarm och placera den aspirerande pipetten inuti, med spetsen vidrör motsatt innervägg.
- Vinkla långsamt den aspirerande pipetten nedåt och aspirera ungefär hälften av mediet. Fyll på med 20 ml färskt steg II-medium genom att pipettera det genom samma öppning.
7. Ställa in 6-brunns magnetisk omrörningsplatta (6MSP)
OBS: Formatet 6MSP får användas i stället för spinnkolvar om flera förhållanden behöver provas. Använd 6MSP för sammansatta eller nefrotoxinbehandlingar. Detta sparar mängden medium som används i det andra steget samtidigt som näringstillgängligheten bibehålls genom diffusion.
- Rengör de ovala magnetiska omrörningsstängerna i ett 50 ml koniskt rör genom att tvätta i en vävnadskultur lämpligt tvättmedel kort (om det aldrig används) eller blötlägg i > 1 timme om det tidigare använts.
- Tvätta kort 3x i steril DPBS.
- Tvätta 1x i 5 min i 70% etanol, 1x i steril DPBS.
- Skölj med anti-vidhäftningslösning och tvätta 1x i steril DPBS och aspirera.
- Försiktigt, med hjälp av långa sterila pincett placera en magnetisk omrörningsstång i varje brunn på 6-brunnsplattan med embryoidkroppar eller njurorganoider.
- Placera plattan på 6MSP och ställ in hastigheten på 120 rpm (Figur 2J). Behåll njurorganoider med halv medium förändring enligt avsnitt 4.2 och 4.3.
OBS: För att de magnetiska omrörningsstängerna ska snäppas på plats och börja snurra kan du först behöva sätta effektnivån till 100 kort, sedan när de alla snurrar, ta ner effektnivån till 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den senaste versionen av vårt protokoll initieras njurorganoiddifferentiering i ett definierat, lågt proteinmedium. Analyserna utförs helt i suspension och förlitar sig på den medfödda förmågan hos hPSC:s differentiering och organisation för initiering av tubulogenes. En enda analys som härrör från en 100 mm ~ 60% sammanflytande hPSC-odlingsplatta ger rutinmässigt 500-1000 njurorganoider, vilket visas i vår tidigare publikation5. På grund av så stort antal organoider som genereras är detta protokoll väl lämpat för sammansatt testning. Vi använder rutinmässigt ett 6-brunnsformat för sammansatt testning, men detta protokoll kan enkelt skalas i det andra steget (dag 3 och framåt) till andra multibrunnsformat för sammansatt testning med högre genomströmning. Immunofluorescens av paraffinsektioner visar förekomst av nefronsegment i organoiderna, dvs. njurtubuler som uttrycker hepatocytkärnfaktor-1 beta (HNF1B) och Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL) (figur 3A - HNF1B, LTL) och podocytkluster som uttrycker V-maf Musculoaponeurotic Fibrosarcoma oncogene homolog B (MAFB) och nephrin (NPHS1) (Figur 3A - MAFB, figur 3B - NPHS1). Dessutom kan modifieringarna i detta protokoll stödja expansion av endotelceller som ses i figur 3B som visar färgning med trombocyt- och endotelcellsvidhäftningsmolekyl 1 (PECAM1) vid dag 26 av odlingen.
| Reagens | Lager conc. | Arbetande konc. | Mängd per 250 ml |
| TeSR-E5 | n/a | n/a | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Penna-Strep | 100x | 1x | 2,5 ml |
| ITSE | 100x | 0,1x | 250 μL |
| Kemiskt definierade lipider | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabell 1: E5-ILP-medelkomposition. Pipettera alla reagenser utom de kemiskt definierade lipiderna och anti-mykoplasmareagenset direkt i den övre kammaren i en 0,22 μm Stericup-filtreringsenhet. Efter filtrering tillsätt lipiderna och anti-mykoplasmareagenset. Förvaras vid 4 °C i upp till två veckor.
| Reagens | Lager conc. | Arbetande konc. | Mängd per 500 ml |
| DMEM (låg glukos) | n/a | n/a | 417,5 ml |
| KOSR | n/a | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Penna-Strep | 100x | 1x | 5 ml |
| MEM-NEAA | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| HEPES | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabell 2: Steg II medium sammansättning. Pipettera alla reagenser utom och anti-mykoplasmareagens direkt i den övre kammaren i en 0,22 μm Stericup-filtreringsenhet. När det har filtrerats, tillsätt anti-mykoplasmareagens. Förvaras vid 4 °C i upp till två veckor.
Bild 1: Protokollöversikt. Schematisk översikt över protokollet som visar tidpunkten för de två stegen och användningen av spinnerkolvar och 6MSP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Stadier av protokollet. (A) Ljusfältsbild av hPSC-koloni behandlad med GCDR. (B) Optimal sammanflöde och kolonistorlek för att påbörja en njurorganoidanalys. C) hPSC som behandlats med dispas i 6 minuter. Röda pilar pekar på kanterna på kolonierna som krullar upp. (D) Organoidanalyser på en orbital shaker. (E) Användning av 200 μm cellsil för att sila ut stora embryoidkroppar. F) Embryoida kroppar vid dag 3 (D3) före överföring till medium i steg II. (G) Uppkomsten av tubulbildning kan observeras vid dag 8 (D8) och (H) optimal tidpunkt för organoidskörd och behandling vid dag 14 (D14). (I) Spinnerkolv som används för bulkodling på en magnetisk platta med flera positioner. J) Analys på en magnetisk omrörningsplatta med flera brunnar. Skalstänger, 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förväntade resultat. (A) Representativa konfokala bilder av immunofluorescent märkta paraffinsektioner av dag 14 njurorganoider som visar positiv färgning för tubuleepitel (HNF1B och LTL) och podocytkluster (MAFB). (B) Dag 26 njurorganoidsektioner märkta för podocytkluster (NPHS1) och endotelceller (PECAM1). Skalstänger, 100 μm (A); 200 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier har visat att de inledande protokollstegen är kritiska för mellanliggande mesodermdifferentiering 5,19,20 och därför är det viktigt att implementera en strikt medelkomposition i detta skede. Avlägsnande av odefinierade komponenter som serum, albumin, proteinfritt hybridommedium II från det första steget i protokollet kan bidra till att förbättra konsekvent differentieringseffektivitet mellan analyserna21.
Njurcellernas metaboliska tillstånd är avgörande för deras funktion, och glukosförändringar kan leda till förändrat metaboliskt tillstånd22. Tidigare studier har beskrivit att höga nivåer av glukos (upp till 25 mM) kan inducera endotelcellsdysfunktion och förändra njurcellernas tillväxt och oxidantkapacitet 22,23,24. Höga nivåer av glukos har också beskrivits för att förändra mitokondriell funktion24, vilket kan vara ogynnsamt när man undersöker njursjukdom och nefrotoxicitet eller utför läkemedelsupptäckt med hjälp av njurorganoider. Vi har därför minskat glukosnivån i vårt protokoll för att främja ett mer in vivo-liknande metaboliskt tillstånd hos de organoida njurcellerna. Som ett resultat ger modifieringarna av njurorganoidanalysen ett konsekvent, robust protokoll, samtidigt som dess enkelhet bibehålls.
Njurorganoider är omogna, och förlängd odling (>20 dagar) kan leda till förekomst av profibrotiska och icke-renala celltyper som tidigare beskrivits 5,25, vilket lämnar organoider mindre representativa för frisk mänsklig njurvävnad. Baserat på vår erfarenhet är det optimala behandlingsfönstret, där njurorganoiderna är som friskast mellan dag 14-18. Användning av spinnerkolvar och magnetiska omrörare med flera brunnar enligt beskrivningen ovan kommer att förbättra enhetlig näringstillgänglighet i motsats till statisk odling21,26. Om utrustningen för suspensionskultur som shaker eller magnetiska omrörare inte är tillgänglig kan detta protokoll fortfarande utföras helt i de ultralåga fästplattorna i statisk kultur. Det kan dock finnas ökad förekomst av embryoidkroppar / organoidsammanslagning, vilket leder till stora prover med nekrotiska kärnor på grund av hypoxi. Alla organoider större än 500 μm kan avlägsnas med hjälp av de beskrivna cellsilarna. För att minska risken för sammanslagning av organoiderna i dessa fall föreslår vi att man inte såddar mer än 100 organoider per 6-brunn. Dessutom, efter utfodring, bör organoiderna fördelas jämnt genom att utföra figur åtta rörelser med plattan.
Låg effektivitet (<50%) av organoidbildning kan observeras. Detta inträffar vanligtvis när hPSC-kulturerna har nått hög sammanflöde (>80%) under standardpassage. Det är viktigt att hPSC-underhållet är konsekvent och att celler inte lämnas för att bli överkonfluenta. Hög sammanflöde och inkonsekvent passaging teknik kan också leda till spontan differentiering och ökad celldöd. Om differentiering är närvarande i hPSC-kulturen rekommenderar vi att du tar bort de differentierade områdena genom att aspirera med en fin pipettspets om den inte överstiger 5% av cellpopulationen innan analysen påbörjas. Om differentieringsområdena överstiger 5 % rekommenderar vi att en ny sats hPSC tinas upp och delas minst en gång innan en ny analys påbörjas.
Vi har observerat att vissa hPSC-linjer är mer benägna att bilda icke-renala celltyper, såsom hjärt- eller neural vävnad. Om detta inträffar kan storleksfiltrering med hjälp av cellsilarna hjälpa till att ta bort de organoider som innehåller icke-renala utväxter. Alternativt kan ändring av hPSC-mediet och/eller matrisen bidra till att minska de icke-renala utväxten. Enligt vår erfarenhet ger alternativa hPSC-medier som innehåller minimikomponenter och BME som vitronektin en strängare pluripotent nisch och bidrar därmed till att generera mer homogena hPSC-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 och P30-DK079307 och ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program till AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).
