本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。
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本文内容
摘要
摘要
由人多能干细胞（hPSCs）生成的肾类器官为肾脏组织提供了无限来源。人类肾类器官是研究肾脏疾病与损伤、开发细胞治疗手段以及测试新疗法的宝贵工具。对于这些应用，需要大量均一的类器官以及高度可重复的检测方法。我们在先前发表的肾类器官培养方案基础上进行了优化，以提高类器官的整体健康状态。该方法是一种简单且稳健的三维培养方案，首先在含有脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和聚乙烯醇，并添加GSK3抑制剂（CHIR99021）的最低成分培养基中培养3天，形成均一的拟胚体；随后转入含敲除血清替代物（KOSR）的培养基中继续培养。此外，通过振荡培养可减少拟胚体的聚集，并维持其大小均一，这对于降低类器官之间的变异性至关重要。总体而言，该方案提供了一种快速、高效且经济的方法，可用于大规模生成肾类器官。
引言
近年来，已开发出多种将人类多能干细胞分化为肾类器官的实验方案1,2,3,4,5肾脏类器官已成为研究再生医学新方法、模拟肾脏相关疾病、开展毒性研究及药物开发的重要工具。尽管其应用广泛，但肾脏类器官仍存在局限性，例如成熟度不足、长期培养能力有限等问题 体外以及人类肾脏中多种细胞类型的缺乏6,7,8近期研究工作集中在通过改进现有方案，提高类器官的成熟度、延长培养周期以及扩展肾脏细胞群体的复杂性。9,10,11,12在本方案的当前版本中5,13，....
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方案
所有使用人多能干细胞（hPSCs）的实验均遵循机构指导原则，并在II级生物安全柜中佩戴适当的个人防护装备进行。所有试剂均为细胞培养级别，除非另有说明。所有培养物均在37 °C、5% CO2的空气环境中孵育。在实验的任何阶段，均可收集类胚体或肾类器官，并进行固定或后续分析处理。用于生成本数据的hPSC细胞系均已得到充分表征并已发表18。
1. 准备培养皿
注意：在传代人多能干细胞（hPSCs）前约1小时，用经干细胞验证的基底膜基质提取物（BME）包被2个100 mm的组织培养皿。可根据生产商说明书预先包被培养皿，用石蜡膜密封后于4 °C保存。
- 在II级生物安全柜中准备2个100 mm组织培养处理过的培养皿（1个用于肾类器官实验，1个用于维持细胞系）以及1个15 mL锥形管。
- 将8 mL冷的无血清杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）分装至15 mL锥形管中，并将约4 mL分别加入每个100 mm培养皿中，使培养基足以覆盖每个培养皿底部。
- 从冷冻保存条件（-20 °C）中取出100 µL基底膜提取物（BME）。使用2 mL移液管从15 mL锥形管中吸取约1 mL冷DMEM，通过缓慢反复吹打使BME分装液在冷DMEM中逐渐解冻，注意避免产生气泡。
注意：切勿将BME分装液置于室温下静置，....
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结果
在本方案的最新版本中，肾类器官的分化起始于一种成分明确且低蛋白的培养基中。所有实验步骤均在悬浮培养条件下完成，依赖于人多能干细胞（hPSCs）自身分化和组织构建的能力来启动肾小管形成。由一个直径100 mm、融合度约60%的hPSC培养皿起始，通常可获得500至1,000个肾类器官，如我们先前发表的研究5所示。由于能够生成大量类器官，本方案非常适用于化合物筛选。我们常规采用6孔板格式进行化合物测试，但该方案在第二阶段（第3天起）可轻松扩展至其他多孔板格式，以实现更高通量的化合物筛选。对石蜡切片进行免疫荧光染色显示，类器官中存在肾单位的不同节段，即表达肝细胞核因子-1β（HNF1B）和刀豆四棱豆凝集素（LTL）的肾小管（图3A - HNF1B, LTL），以及表达V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（MAFB）和足蛋白（nephrin, NPHS1）的足细胞簇（图3A - MAFB，图3B - NPHS1）。此外.......
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讨论
先前的研究表明，初始实验方案步骤对于中胚层分化至关重要5,19,20，因此在此阶段实施严格控制的培养基成分十分必要。在实验方案的第一阶段去除未定义成分，如血清、白蛋白和无蛋白杂交瘤培养基II，可能有助于提高不同检测之间分化效率的一致性21。
肾脏细胞的代谢状态对其功能至关重要，葡萄糖水平的变化可导致代谢状态的改变22。既往研究指出，高浓度葡萄糖（高达 25 mM）可诱导内皮细胞功能障碍，并改变肾脏细胞的生长能力及氧化能力22,23,24。高浓度葡萄糖还被报道可改变线粒体功能24
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院R01 DK069403、UC2 DK126122、P30-DK079307以及美国肾脏病学会肾脏研究基金会Ben J. Lipps研究奖学金项目资助，资助对象为AP。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| 防黏附冲洗液 | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 以DMSO配制为10 mM储备液 |
| Corning 一次性旋转瓶 | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning 超低吸附6孔板 | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning 低速搅拌器 | Fisher Scientific | 11-495-03 | 用于旋转瓶培养的多板磁力搅拌器 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | 分装后冷冻保存 |
| DMEM，低糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，不含酚红 | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x，不含钙，不含镁 | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| 卵形/椭圆形搅拌子 | 2mag | PI20106 | |
| Excelta 通用镊子 | Fisher Scientific | 17-456-103 | 在细胞培养超净台中保持无菌 |
| EZBio 一次性培养基瓶，250 mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | 用于配制10% PVA溶液 |
| Falcon 标准组织培养皿（100 mm） | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand 无菌吸管，2 mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand 细胞刮刀 | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand 多功能3D旋转仪 | Fisher Scientific | 88-861-047 | 轨道摇床 |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor 基底膜基质 | Thermo Fisher | A1413302 | BME。在冰上分装并冷冻保存。其他合适的基质替代品包括Matrigel或Cultrex。 |
| 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX 补充剂 | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-谷氨酰胺补充剂。 |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺 | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut 血清替代物 - 多物种 | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR。分装后冷冻保存 |
| 脂质混合物1，化学成分明确 | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，500 mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，250 mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP 控制单元 | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP 微孔板搅拌驱动器 | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X 清洁液 | Fisher Scientific | MP0976670A4 | 适用于组织培养的洗涤剂。 用水配制成5%溶液 |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | 人多能干细胞培养基。TeSR-E8、NutriStem XF 和 mTeSR Plus 培养基也经过测试，是合适的替代品。 |
| Nunc 50 mL 锥形无菌离心管 | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15 mL 锥形无菌离心管 | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15-140-122 | 分装后冷冻保存 |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | 抗支原体试剂。 分装后冷冻保存 |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | 细胞筛 |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | 细胞筛 |
| 聚乙烯醇 87-90% 水解 (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 在DPBS中配制成10%溶液，98°C搅拌至完全溶解，使用138-3211-FLS瓶配制 |
| ROCK抑制剂 Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 以DPBS配制为10 mM储备液 |
| 无菌一次性移液管 - 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 无菌一次性移液管 - 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| 无菌一次性移液管 - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | 无血清、低蛋白基础培养基，用于E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 分配器 | 2mag | VMF 90512 | 若使用多个MIXdrive时使用 |
参考文献
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....
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