Summary
Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.
Abstract
Los organoides renales generados a partir de hPSC han proporcionado una fuente ilimitada de tejido renal. Los organoides renales humanos son una herramienta invaluable para estudiar la enfermedad y las lesiones renales, desarrollar terapias basadas en células y probar nuevas terapias. Para tales aplicaciones, se necesita un gran número de organoides uniformes y ensayos altamente reproducibles. Nos hemos basado en nuestro protocolo de organoides renales publicado anteriormente para mejorar la salud general de los organoides. Este protocolo 3D simple y robusto implica la formación de cuerpos embrionarios uniformes en un medio de componente mínimo que contiene lípidos, suplemento de insulina-transferrina-selenio-etanolamina y alcohol polivinílico con inhibidor de GSK3 (CHIR99021) durante 3 días, seguido de cultivo en medio que contiene reemplazo sérico knock-out (KOSR). Además, los ensayos de agitación permiten reducir la aglomeración de los cuerpos embrionarios y mantener un tamaño uniforme, lo cual es importante para reducir la variabilidad entre los organoides. En general, el protocolo proporciona un método rápido, eficiente y rentable para generar grandes cantidades de organoides renales.
Introduction
En los últimos años, se han desarrollado una serie de protocolos para diferenciar las células madre pluripotentes humanas en organoides renales 1,2,3,4,5. Los organoides renales han proporcionado una herramienta importante para ayudar a la investigación en nuevos enfoques de medicina regenerativa, modelar enfermedades relacionadas con los riñones, realizar estudios de toxicidad y desarrollo de fármacos terapéuticos. A pesar de su amplia aplicabilidad, los organoides renales tienen limitaciones como la falta de maduración, la capacidad limitada de cultivo a largo plazo in vitro y la escasez de varios tipos de células que se encuentran en el riñón humano 6,7,8. Trabajos recientes se han centrado en mejorar el nivel de maduración organoide, alargar los periodos de cultivo y ampliar la complejidad de las poblaciones de células renalesmodificando los protocolos existentes 9,10,11,12. En esta iteración actual de nuestro protocolo establecido 5,13, hemos modificado los componentes del medio en la primera etapa del protocolo a un medio base libre de suero suplementado con insulina-transferrina-selenio-etanolamina (ITSE), lípidos, alcohol polivinílico (E5-ILP) y CHIR99021 (Figura 1). Estos cambios proporcionan un medio totalmente definido, libre de suero, bajo en proteínas, con menos componentes que nuestra composición media anterior 5,13 y sin factores de crecimiento adicionales. Como resultado, el medio de la primera etapa requiere menos mano de obra para preparar que nuestra versión publicada anteriormente, y puede reducir la variabilidad de lote a lote5. Estudios previos han demostrado que tanto la insulina como la transferrina son importantes en el cultivo sin suero14,15, sin embargo, los altos niveles de insulina pueden ser inhibitorios a la diferenciación del mesodermo16. Hemos mantenido los niveles bajos de insulina según lo dispuesto en el protocolo original, y hemos reducido aún más los niveles de KOSR (que contiene insulina) en la segunda etapa del ensayo. En línea con otros protocolos para la formación de organoides renales, los niveles más bajos de KOSR son beneficiosos para mantener un equilibrio entre la proliferación y la diferenciación del tejido renal17. Además, hemos bajado la concentración de glucosa en nuestro medio Estadio II13.
Nuestro método describe una configuración para el ensayo de suspensión de organoides renales, produciendo hasta ~ 1,000 organoides de una placa de cultivo inicial de ~ 60% confluente hPSC 100 mm como se describe en la publicación original 5,13. Este protocolo se puede escalar fácilmente hasta comenzar con múltiples placas de 100 mm o 150 mm para aumentar aún más el número de organoides.
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Protocol
Todos los experimentos con hPSC se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y se llevaron a cabo en una campana de bioseguridad de Clase II con el equipo de protección personal adecuado. Todos los reactivos son de grado de cultivo celular a menos que se indique lo contrario. Todos los cultivos se incuban a 37 °C, 5% CO2 atmósfera aireada. En todas las etapas del ensayo, se pueden recolectar cuerpos embrioides u organoides renales, y fijarlos o prepararlos para su análisis. Las líneas hPSC utilizadas para generar estos datos han sido completamente caracterizadas y publicadas18.
1. Preparación de placas de cultivo
NOTA: Aproximadamente 1 h antes de dividir las hPSC, cubra 2 placas de cultivo de tejidos de 100 mm con un extracto de matriz de membrana basal (BME) calificado para células madre. Se pueden recubrir previamente las placas, sellarlas con una película de parafina y almacenarlas a 4 °C de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar 2 placas tratadas con cultivo de tejidos de 100 mm (1 para ensayo de organoides renales, 1 para mantener la línea celular) y un tubo cónico de 15 ml en la campana de bioseguridad clase II.
- Alícuota 8 ml de medio águila modificada (DMEM) de Dulbecco frío y sin suero en un tubo cónico de 15 ml y ~ 4 ml en cada una de las placas de 100 mm, suficiente para cubrir la parte inferior de cada placa con medio.
- Sacar una alícuota de 100 μL de BME del congelador (-20 °C). Usando una pipeta serológica de 2 ml, tome ~ 1 ml de DMEM frío del tubo cónico de 15 ml. Descongele lentamente la alícuota BME canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo con el DMEM frío, evitando hacer burbujas.
NOTA: No deje que la alícuota de BME se asiente a temperatura ambiente. Úselo inmediatamente. - Transfiera el DMEM/BME descongelado de nuevo al tubo cónico de 15 ml con el DMEM restante. Con una pipeta serológica de 10 ml, mezcle suavemente el BME diluido mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo al menos 8 veces para dispersar uniformemente el BME, evitando hacer burbujas.
- Transfiera 4 ml de la BME diluida a cada placa con DMEM y gire suavemente la placa para que la BME se distribuya uniformemente. Incubar la placa recubierta durante 1 h a temperatura ambiente o 30 min a 37 °C.
NOTA: Utilice 50 μL de BME por placa de 100 mm. El uso de otros medios de cultivo y líneas celulares de hPSC puede requerir diferentes concentraciones de BME.
2. HPSC de paso
NOTA: Para el cultivo rutinario de hPSC, las líneas celulares de paso al 70-80% de confluencia.
- Aspirar el medio de cultivo de la placa hPSC a pasar. Agregue ~ 8 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a la placa hPSC y gire suavemente para lavar las células.
- Aspire DBPS y agregue 2 ml de reactivo de disociación celular suave (GCDR) a la placa de 100 mm, gota a gota en la parte superior para cubrir las células.
NOTA: También se pueden utilizar otros reactivos de disociación. Ajuste en consecuencia. - Incubar a temperatura ambiente durante ~6-8 min hasta que las colonias se rompan y las células sean refractivas bajo contraste de fase (Figura 2A).
NOTA: El tiempo puede variar entre líneas celulares. Ajuste en consecuencia. - Durante la incubación, prepare un tubo cónico de 50 ml. Añadir 16 ml de medio hPSC (8 ml por placa de 100 mm) y añadir el inhibidor de la quinasa asociado a Rho (ROCKi) a una concentración final de 5 μM.
- Aspire DMEM de las placas recubiertas de BME y agregue 8 ml de medio hPSC más ROCKi a cada placa.
- Cuando las células estén listas (como se describe en el punto 2.3, Figura 2A), aspire el GCDR e incline la placa ~ 45 ° hacia el experimentador y raspe las células con un elevador de células.
NOTA: Si las celdas se están desconchando, omita la aspiración de GCDR y continúe. - Gire la placa ~ 90 ° y raspe nuevamente para levantar las celdas restantes. Mantenga la placa ~ 45 ° y lave las células con 3 ml de medio hPSC con una pipeta serológica de 10 ml.
- Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper grupos grandes (no más de 2-3 veces) y sembra las células en la proporción adecuada para la línea celular de interés en las placas preparadas. Coloque la placa con las células en la incubadora y mueva la placa suavemente en la figura ocho movimientos para distribuir las células de manera uniforme.
NOTA: En este experimento, las líneas hPSC se dividieron en una proporción de 1: 5, esto puede variar para otras líneas celulares y condiciones. Deje el plato sin molestar durante la noche. - Después de ~ 24 h, examine las celdas para la unión. Busque pequeñas colonias individuales adjuntas. Aspire el medio gastado y reponga con 8 ml de medio hPSC fresco (sin ROCKi añadido).
- Continúe observando y alimentándose diariamente hasta que las células alcancen ~ 60% de confluencia para comenzar el ensayo de organoides renales (generalmente alcanzó de 48 a 72 h después del pasaje). Las colonias idealmente serán discretas y no se fusionarán (Figura 2B).
NOTA: Es muy importante limitar las células a no más del 80% de confluencia para mantener su estado de pluripotencia. Los cultivos confluentes, el manejo brusco o los pasajes más altos pueden conducir a una diferenciación espontánea no deseada o a una baja eficiencia de la formación de organoides renales.
3. Día 0 - Configuración del ensayo de organoides renales
- Antes de comenzar, prepare tanto el medio E5-ILP como el Stage II según las formulaciones (Tabla 1 y Tabla 2).
NOTA: El medio se puede almacenar hasta 14 días a 4 °C. - Para un ensayo organoide renal (se necesita una placa de cultivo de 100 mm para una placa de 6 pocillos), prepare un medio E5-ILP completo en un tubo cónico de 50 ml: 18 ml de E5-ILP suplementado con 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM de beta-mercaptoetanol (32,7 μL).
- Coloque 2 ml de medio E5-ILP completo en cada pozo de una placa de fijación ultra baja de 6 pocillos.
- Lave las hPSC a ~60 % de confluencia (Figura 2B) dos veces con ~ 8 ml de DPBS. Aspire DPBS luego agregue 2 ml de dispasa por placa de 100 mm, gota a gota para cubrir las células e incube durante 6 minutos a 37 ° C.
NOTA: Después de 6 min, los bordes de las colonias comenzarán a curvarse (Figura 2C, flechas rojas) mientras que el resto de la colonia permanece unida. Si esto no se obtiene después de 6 minutos, coloque las células de nuevo en la incubadora durante 30 s adicionales. Es posible que otros medios y matrices de hPSC no sean compatibles con este tiempo. El recubrimiento BME a base de laminina no es compatible con la dispasa. Si la BME a base de laminina es la matriz hPSC estándar, cubra una de las placas de la sección 1 con la BME descrita en este método que se utilizará para el ensayo organoide renal. - Lave las celdas 3x con ~10 mL de DPBS. Aspire DPBS luego incline la placa ~ 45 ° y raspe hacia abajo con un elevador de celdas.
NOTA: Dispase no está desactivado, por lo tanto, debe lavarse a fondo. No reduzca el número de lavados. - Lave las colonias desde la parte superior con 6 ml de medio E5-ILP completo utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Pipete hacia arriba y hacia abajo suavemente para romper cualquier colonia grande (2 o 3 veces suele ser suficiente).
- Distribuya los racimos de colonias de manera uniforme agregando 1 ml por pozo en la placa de 6 pocillos. Coloque la placa en un agitador orbital (ajustes: orbital = 30, recíproco = 330°, vibración = 5° - 2 s) que se coloca en la incubadora de 37 °C (Figura 2D).
NOTA: La característica de vibración es importante para la distribución adecuada de los organoides y para evitar la aglomeración.
4. Día 2 - Alimentación por medio de cambio
NOTA: Dentro de las 48 h, los grupos de colonias formarán cuerpos embrioides.
- Preparar el medio completo: Para una placa de 6 pocillos preparar 12 mL de medio E5-ILP + 8 μM CHIR99021 en un tubo cónico de 15 mL.
NOTA: No se requiere beta-mercaptoetanol ni ROCKi. - Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en la parte inferior de la placa, incline la placa ~ 45 ° y luego aspire el medio lentamente desde la parte superior, deje ~ 1 ml por pozo.
NOTA: Los cuerpos embrídicos en esta etapa se agrupan rápidamente. No los dejes conformarte con > 5 min. - Añadir 2 ml de medio completo preparado (sección 4.1) por pozo. Devuelva el plato de nuevo a la coctelera.
5. Día 3 - Transferencia de cuerpos embrionarios al medio estadio II
- Preparar un tubo cónico de 50 ml y DMEM (glucosa baja). Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo de la placa. Incline la placa ~ 45 ° y aspire el medio desde la parte superior lentamente, deje ~ 1 ml por pozo.
- Recoger todos los cuerpos embrionarios cuidadosamente de cada pozo utilizando una pipeta serológica de 10 ml y transferirlos al tubo cónico de 50 ml.
- Lave cada pocillo para recolectar cualquier cuerpo embrionario restante con ~ 1 ml de DMEM (glucosa baja) y agréguelos al mismo tubo cónico de 50 ml.
- Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo del tubo, ~ 5 min. Mientras espera, agregue 2 ml de medio de etapa II a cada pozo de la placa de 6 pocillos. Extraer cuerpos embrionarios grandes (>300 μm) utilizando un colador de células de 200 μm (Figura 2E).
- Utilice un nuevo tubo cónico de 50 ml y coloque el colador de células de 200 μm en la parte superior. Pipetear todos los cuerpos embrionarios usando una pipeta serológica de 10 ml cuidadosamente sobre el colador celular.
- Enjuague el colador celular con ~ 5 ml adicionales de DMEM (glucosa baja) para recolectar cualquier cuerpo embrioide atascado en el colador celular. Permita que los cuerpos embrioides se asienten en el fondo del tubo cónico.
- Cuando los cuerpos embrionarios estén asentados, aspire el sobrenadante y lávese con ~ 10 ml de DMEM (glucosa baja).
- Aspirar DMEM y volver a suspender los cuerpos embrioides en 6 mL de medio Estadio II.
- Transfiera los cuerpos embrionarios de nuevo a la placa de fijación ultra baja de 6 pozos, distribuyéndolos uniformemente entre los 6 pozos.
- Realice cambios a medias como se describe en los pasos 4.2 y 4.3 cada dos días.
NOTA: A partir del día 3, los cuerpos embrioides tendrán un aspecto esférico "dorado" y liso (Figura 2F). A partir del ~ día 6, la formación de túbulos en cuerpos embrionarios individuales se hará evidente, con un número creciente en los días siguientes alcanzando números óptimos y crecimiento para el día 14 (Figura 2G, H).. Para eliminar la formación ocasional de aglomeraciones, al observar visualmente los organoides renales, o cuerpos embrionarios muy pequeños sin túbulos, tamice los <200 y los organoides grandes >500 μm con un colador de células de 500 y 200 μm como se describe en los pasos 5.4.1 y 5.4.2.
6. Transferencia al matraz giratorio y alimentación
NOTA: Un matraz giratorio se puede utilizar en cualquier momento a partir del día 3 en adelante para experimentos que requieren un gran número de organoides. La transferencia rutinaria de organoides ocurre en nuestro laboratorio entre los días 6-8. Consulte la sección Discusión para conocer las alternativas si el equipo no está disponible.
- Transfiera cuerpos embrionarios a un matraz giratorio de 125 ml con 45 ml de medio en estadio II. Ajuste la velocidad del agitador magnético a 120 rpm y colóquelo en la incubadora (Figura 2I).
- Para alimentar cuerpos embrioides u organoides renales, deje que los organoides renales se asienten brevemente en el fondo del matraz giratorio. Levante la tapa de un brazo lateral del matraz y coloque la pipeta aspiradora en el interior, con la punta tocando la pared interior opuesta.
- Incline lentamente la pipeta aspiradora hacia abajo y aspire aproximadamente la mitad del medio. Reponga con 20 ml de medio fresco de Etapa II pipeteándolo a través de la misma abertura.
7. Configuración de la placa de agitación magnética de 6 pocillos (6MSP)
NOTA: El formato 6MSP se puede utilizar en lugar de matraces giratorios si es necesario probar varias condiciones. Use el 6MSP para tratamientos compuestos o nefrotoxinas. Esto ahorra la cantidad de medio utilizado en la segunda etapa mientras mantiene la disponibilidad de nutrientes a través de la difusión.
- Limpie las barras de agitación magnéticas ovaladas en un tubo cónico de 50 ml lavando en un cultivo de tejidos el detergente adecuado brevemente (si nunca se usa) o remoje durante > 1 h si se usa anteriormente.
- Lavar brevemente 3x en DPBS estéril.
- Lavar 1x durante 5 min en etanol al 70%, 1x en DPBS estéril.
- Enjuague con solución antiadherente y lave 1x en DPBS estéril y aspire.
- Con cuidado, usando fórceps estériles largos, coloque una barra de agitación magnética en cada pozo de la placa de 6 pocillos con cuerpos embrioides u organoides renales.
- Coloque la placa en el 6MSP y ajuste la velocidad a 120 rpm (Figura 2J). Mantener los organoides renales con medio cambio según las secciones 4.2 y 4.3.
NOTA: Para que las barras de agitación magnéticas encajen en su posición y comiencen a girar, es posible que primero deba poner el nivel de potencia a 100 brevemente, luego, una vez que todas estén girando, baje el nivel de potencia a 25.
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Representative Results
En esta versión más reciente de nuestro protocolo, la diferenciación organoide renal se inicia en un medio definido y bajo en proteínas. Los ensayos se realizan completamente en suspensión y se basan en la capacidad innata de la diferenciación y organización de hPSCs para el inicio de la tubulogénesis. Un solo ensayo que se origina a partir de una placa de cultivo hPSC confluente de 100 mm ~ 60% produce rutinariamente 500-1,000 organoides renales, como se muestra en nuestra publicación anterior5. Debido a un número tan alto de organoides generados, este protocolo es muy adecuado para las pruebas de compuestos. Utilizamos rutinariamente un formato de 6 pocillos para las pruebas de compuestos, sin embargo, este protocolo se puede escalar fácilmente en la segunda etapa (día 3 en adelante) a otros formatos de múltiples pocillos para pruebas compuestas de mayor rendimiento. La inmunofluorescencia de las secciones de parafina muestra la presencia de segmentos de nefrona en los organoides, es decir, túbulos renales que expresan Factor Nuclear hepatocítico-1 beta (HNF1B) y Lectina del tetragonolobus de loto (LTL) (Figura 3A - HNF1B, LTL), y grupos de podocitos que expresan V-maf Fibrosarcoma musculoaponeurótico oncogén homólogo B (MAFB) y nefrina (NPHS1) (Figura 3A - MAFB, Figura 3B - NPHS1). Además, las modificaciones en este protocolo pueden apoyar la expansión de las células endoteliales como se ve en la Figura 3B que muestra la tinción con la molécula de adhesión de plaquetas y células endoteliales 1 (PECAM1) en el día 26 de cultivo.
| Reactivo | Stock conc. | Funcionamiento conc. | Cantidad por 250 mL |
| TeSR-E5 | n/a | n/a | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Pluma-estreptococo | 100x | 1x | 2,5 ml |
| ITSE | 100x | 0,1 veces | 250 μL |
| Lípidos químicamente definidos | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocina | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabla 1: Composición del medio E5-ILP. Pipetear todos los reactivos excepto los lípidos químicamente definidos y el reactivo antimicoplasma directamente en la cámara superior de una unidad de filtración Stericup de 0,22 μm. Después de la filtración, agregue los lípidos y el reactivo antimicoplasma. Conservar a 4 °C durante un máximo de dos semanas.
| Reactivo | Stock conc. | Funcionamiento conc. | Cantidad por 500 mL |
| DMEM (glucosa baja) | n/a | n/a | 417,5 ml |
| KOSR | n/a | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Pluma-estreptococo | 100x | 1x | 5 ml |
| MEM-NEAA | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| HEPES | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocina | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabla 2: Composición del medio de la etapa II. Pipetear todos los reactivos excepto el reactivo antimicoplasma directamente en la cámara superior de una unidad de filtración Stericup de 0,22 μm. Una vez filtrado, añadir el reactivo anti-micoplasma. Conservar a 4 °C durante un máximo de dos semanas.
Figura 1: Descripción general del protocolo. Descripción general esquemática del protocolo que muestra el tiempo de las dos etapas y el uso de matraces giratorios y 6MSP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Etapas del protocolo. (A) Imagen de campo brillante de la colonia de hPSC tratada con GCDR. (B) Confluencia óptima y tamaño de colonia para comenzar un ensayo de organoides renales. (C) hPSCs tratadas con dispasa durante 6 minutos. Las flechas rojas apuntan a los bordes de las colonias que se enroscan. (D) Ensayos organoides en un agitador orbital. (E) Uso de un colador de células de 200 μm para tamizar cuerpos embrionarios grandes. (F) Cuerpos embrioides en el día 3 (D3) antes de transferirse al medio de etapa II. (G) La aparición de la formación de túbulos se puede observar en el día 8 (D8) y (H) punto de tiempo óptimo para la sustracción y el tratamiento de organoides en el día 14 (D14). (I) Matraz giratorio utilizado para el cultivo a granel en una placa magnética multiposición. (J) Ensayo en una placa de agitación magnética de múltiples pozos. Barras de escala, 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados esperados. (A) Imágenes confocales representativas de secciones de parafina marcadas inmunofluorescentemente de organoides renales del día 14 que muestran tinción positiva para epitelios de túbulos (HNF1B y LTL) y grupos de podocitos (MAFB). (B) Secciones de organoides renales del día 26 marcadas para grupos de podocitos (NPHS1) y células endoteliales (PECAM1). Barras de escala, 100 μm (A); 200 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estudios previos han demostrado que los pasos iniciales del protocolo son críticos para la diferenciación del mesodermo intermedio 5,19,20 y, por lo tanto, es esencial implementar una composición media estricta en esta etapa. La eliminación de componentes indefinidos como suero, albúmina, híbrido libre de proteínas medio II de la primera etapa del protocolo puede ayudar a mejorar la eficiencia de diferenciación consistente entre los ensayos21.
El estado metabólico de las células renales es crítico para su función, y los cambios en la glucosa pueden conducir a un estado metabólico alterado22. Estudios previos han descrito que los altos niveles de glucosa (hasta 25 mM) pueden inducir disfunción de las células endoteliales y alterar el crecimiento y la capacidad oxidante de las células renales 22,23,24. También se han descrito altos niveles de glucosa para alterar la función mitocondrial24, lo que puede ser desfavorable cuando se investiga la enfermedad renal y la nefrotoxicidad o se realiza el descubrimiento de fármacos utilizando organoides renales. Por lo tanto, hemos reducido el nivel de glucosa en nuestro protocolo para promover un estado metabólico más in vivo de las células renales organoides. Como resultado, las modificaciones en el ensayo de organoides renales proporcionan un protocolo consistente y robusto, manteniendo su simplicidad.
Los organoides renales son inmaduros, y el cultivo prolongado (>20 días) puede conducir a la incidencia de tipos de células profibróticas y no renales como se describió anteriormente 5,25, dejando a los organoides menos representativos del tejido renal humano sano. Según nuestra experiencia, la ventana de tratamiento óptima, donde los organoides renales están en su punto más saludable es entre los días 14-18. El uso de matraces giratorios y agitadores magnéticos de múltiples pocillos como se describió anteriormente mejorará la disponibilidad uniforme de nutrientes en comparación con el cultivo estático21,26. Si los equipos para el cultivo en suspensión, como el agitador o los agitadores magnéticos, no están disponibles, este protocolo aún se puede llevar a cabo completamente en las placas de fijación ultra bajas en cultivo estático. Sin embargo, puede haber una mayor incidencia de fusión de cuerpos embrioides / organoides, lo que lleva a especímenes grandes con núcleos necróticos debido a la hipoxia. Cualquier organoide mayor de 500 μm se puede eliminar utilizando los coladores celulares descritos. Para reducir la posibilidad de fusión de los organoides en esos casos, sugerimos no sembrar más de 100 organoides por 6 pocillos. Además, después de la alimentación, los organoides deben distribuirse uniformemente realizando movimientos de la figura ocho con la placa.
Se puede observar una baja eficiencia (<50%) de la formación de organoides. Esto suele ocurrir cuando los cultivos de hPSC han alcanzado una alta confluencia (>80%) durante el pasaje estándar. Es fundamental que el mantenimiento de hPSC sea consistente y que las células no se dejen sobreconfluentes. La alta confluencia y la técnica de paso inconsistente también pueden conducir a la diferenciación espontánea y al aumento de la muerte celular. Si la diferenciación está presente en el cultivo de hPSC, recomendamos eliminar las áreas diferenciadas aspirando con una punta de pipeta fina si no supera el 5% de la población celular, antes de comenzar el ensayo. Si las áreas de diferenciación superan el 5%, recomendamos que un nuevo lote de hPSC se descongele y se divida al menos una vez antes de comenzar un nuevo ensayo.
Hemos observado que algunas líneas de hPSC son más propensas a formar tipos de células no renales, como el tejido cardíaco o neural. Si esto ocurre, la filtración de tamaño utilizando los coladores celulares puede ayudar a eliminar los organoides que contienen excrecencias no renales. Alternativamente, cambiar el medio y/o la matriz de hPSC puede ayudar a reducir las excrecencias no renales. Desde nuestra experiencia, los medios alternativos de hPSC que contienen componentes mínimos, y BME como la vitronectina, proporcionan un nicho pluripotente más estricto y, por lo tanto, ayudan a generar cultivos de hPSC más homogéneos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud R01 DK069403, UC2 DK126122 y P30-DK079307 y ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
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