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Developmental Biology

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक सरलीकृत विधि

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62452
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1,3
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, School of Medicine, 2Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 3Center for Critical Care Nephrology, University of Pittsburgh, School of Medicine

Summary

यहां हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल दो सप्ताह के भीतर गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करता है। परिणामी गुर्दे organoids बड़े पैमाने पर स्पिनर फ्लास्क या समानांतर दवा परीक्षण दृष्टिकोण के लिए बहु अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल प्लेटों में सुसंस्कृत किया जा सकता है।

Abstract

एचपीएससी से उत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स ने गुर्दे के ऊतकों का एक असीमित स्रोत प्रदान किया है। मानव गुर्दे organoids गुर्दे की बीमारी और चोट का अध्ययन करने, सेल आधारित उपचार विकसित करने और नए चिकित्सीय परीक्षण के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए, बड़ी संख्या में समान ऑर्गेनोइड्स और अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य assays की आवश्यकता होती है। हमने ऑर्गेनोइड्स के समग्र स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए अपने पहले से प्रकाशित किडनी ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल पर निर्माण किया है। इस सरल, मजबूत 3 डी प्रोटोकॉल में लिपिड, इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-एथेनोलामाइन पूरक और जीएसके 3 अवरोधक (CHIR99021) के साथ पॉलीविनाइल अल्कोहल युक्त न्यूनतम घटक माध्यम में समान भ्रूण निकायों का गठन शामिल है, इसके बाद नॉक-आउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) में संस्कृति होती है- युक्त माध्यम। इसके अलावा, आंदोलनकारी assays embryoid निकायों के clumping में कमी और एक समान आकार को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, जो organoids के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, कुशल और लागत प्रभावी विधि प्रदान करता है।

Introduction

हाल के वर्षों में, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स में अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल 1,2,3,4,5 विकसित किए गए हैं। गुर्दे organoids नए पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण, मॉडल गुर्दे से संबंधित बीमारियों, विषाक्तता अध्ययन और चिकित्सीय दवा के विकास में अनुसंधान में सहायता करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किया है। उनकी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स की सीमाएं हैं जैसे परिपक्वता की कमी, विट्रो में सीमित दीर्घकालिक संस्कृति क्षमता, और मानव गुर्दे में पाए जाने वाले कई सेलप्रकारों की कमी 6,7,8। हाल के काम ने ऑर्गेनोइड परिपक्वता के स्तर में सुधार करने, संस्कृति की अवधि का विस्तार करने और मौजूदा प्रोटोकॉल 9,10,11,12 को संशोधित करके गुर्दे की कोशिका आबादी की जटिलता का विस्तार करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हमारे स्थापित प्रोटोकॉल 5,13 के इस वर्तमान पुनरावृत्ति में, हमने प्रोटोकॉल के पहले चरण में मध्यम घटकों को सीरम-मुक्त बेस माध्यम में संशोधित किया है, जो इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-इथेनॉलामाइन (आईटीएसई), लिपिड, पॉलीविनाइल अल्कोहल (ई 5-आईएलपी) और CHIR99021 (चित्रा 1) के साथ पूरक है। ये परिवर्तन एक पूरी तरह से परिभाषित, सीरम-मुक्त, कम-प्रोटीन माध्यम प्रदान करते हैं, जिसमें हमारे पिछले मध्यम संरचना 5,13 की तुलना में कम घटक होते हैं और अतिरिक्त विकास कारकों के बिना। नतीजतन, पहला चरण माध्यम हमारे पहले प्रकाशित संस्करण की तुलना में तैयार करने के लिए कम श्रम-गहन है, और बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलताको कम कर सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इंसुलिन और ट्रांसफरिन दोनों सीरम-मुक्त संस्कृति14,15 में महत्वपूर्ण हैं, हालांकि, इंसुलिन का उच्च स्तर मेसोडर्म भेदभाव16 के लिए निरोधात्मक हो सकता है। हमने मूल प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए कम इंसुलिन के स्तर को बनाए रखा है, और परख के दूसरे चरण में KOSR (इंसुलिन युक्त) के स्तर को और कम कर दिया है। गुर्दे के ऑर्गेनोइड गठन के लिए अन्य प्रोटोकॉल के अनुरूप, KOSR के निम्न स्तर गुर्दे केऊतकों के प्रसार और भेदभाव के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए फायदेमंद हैं। इसके अलावा, हमने अपने चरण II माध्यम13 में ग्लूकोज एकाग्रता को कम कर दिया है।

हमारी विधि गुर्दे organoids के निलंबन परख के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है, एक प्रारंभिक ~ 60% confluent hPSC 100 मिमी संस्कृति प्लेट से ~ 1,000 organoids तक उपज के रूप में मूल प्रकाशन 5,13 में वर्णित है. इस प्रोटोकॉल को आसानी से कई 100 मिमी या 150 मिमी प्लेटों के साथ शुरू करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ताकि ऑर्गेनोइड संख्या को और बढ़ाया जा सके।

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Protocol

एचपीएससी का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ कक्षा II जैव सुरक्षा हुड में किए गए थे। सभी अभिकर्मक सेल संस्कृति-ग्रेड हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। सभी संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 वायु वातावरण में इनक्यूबेट किया जाता है। परख के सभी चरणों में, embryoid निकायों या गुर्दे organoids एकत्र किया जा सकता है, और तय या विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है। इस डेटा को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली एचपीएससी लाइनों को पूरी तरह से विशेषता और प्रकाशितकिया गया है।

1. संस्कृति प्लेटों की तैयारी

नोट: लगभग 1 ज h को विभाजित करने से पहले h, एक स्टेम सेल योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निकालने (BME) के साथ 2 x 100 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेटों कोट। कोई प्लेटों को पूर्व-कोट कर सकता है, उन्हें पैराफिन फिल्म के साथ सील कर सकता है और निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर सकता है।

  1. 2 x 100 मिमी ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों (गुर्दे organoid परख के लिए 1, सेल लाइन को बनाए रखने के लिए 1) और कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा हुड में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें।
  2. एलीकोट ठंड के 8 मिलीलीटर, सीरम मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में और ~ 4 एमएल 100 मिमी प्लेटों में से प्रत्येक में, मध्यम के साथ प्रत्येक प्लेट के नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
  3. फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) से बाहर बीएमई का 100 μL ऐलीकोट लें। एक 2 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करते हुए, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से ठंडे डीएमईएम के ~ 1 एमएल लें। धीरे-धीरे बीएमई एलीकोट को ठंडा डीएमईएम के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करके पिघलाएं, बुलबुले बनाने से बचें।
    नोट: BME ऐलीकोट को कमरे के तापमान पर बैठने न दें। तुरंत उपयोग करें।
  4. शेष DMEM के साथ 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में वापस पिघला हुआ DMEM / BME स्थानांतरित करें। एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ, धीरे से बीएमई को समान रूप से फैलाने के लिए कम से कम 8 बार ऊपर और नीचे पिपेट करके पतला बीएमई मिलाएं, बुलबुले बनाने से बचें।
  5. DMEM के साथ प्रत्येक प्लेट में पतला BME के 4 mL स्थानांतरित करें और धीरे से प्लेट को घुमाएं ताकि BME समान रूप से वितरित हो। कमरे के तापमान पर 1 घंटे या 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लेपित प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रति 100 मिमी प्लेट BME के 50 μL का उपयोग करें। अन्य एचपीएससी संस्कृति मीडिया और सेल लाइनों के उपयोग के लिए बीएमई की विभिन्न सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है।

2. पासिंग hPSCs

नोट:: नियमित hPSC संस्कृति के लिए, 70-80% confluency पर मार्ग सेल लाइनों।

  1. एचपीएससी प्लेट से संस्कृति माध्यम को पारित करने के लिए एस्पिरेट करें। HPSC प्लेट के लिए Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) के ~ 8 mL जोड़ें और कोशिकाओं को धोने के लिए धीरे से घुमाएं।
  2. Aspirate DBPS और 100 मिमी प्लेट में कोमल सेल पृथक्करण अभिकर्मक (GCDR) के 2 मिलीलीटर जोड़ें, कोशिकाओं को कवर करने के लिए शीर्ष पर ड्रॉप से ड्रॉप करें।
    नोट: अन्य पृथक्करण अभिकर्मकों का भी उपयोग किया जा सकता है। तदनुसार समायोजित करें।
  3. कमरे के तापमान पर ~ 6-8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि उपनिवेश टूट न जाएं और कोशिकाएं चरण के विपरीत (चित्रा 2 ए) के तहत अपवर्तक न हों।
    नोट:: समय कक्ष पंक्तियों के बीच भिन्न हो सकता है। तदनुसार समायोजित करें।
  4. इनक्यूबेट करते समय, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। एचपीएससी माध्यम के 16 एमएल (8 एमएल प्रति 100 मिमी प्लेट) जोड़ें और 5 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए Rho-associated kinase inhibitor (ROCKi) जोड़ें।
  5. BME-लेपित प्लेटों से Aspirate DMEM, और प्रत्येक प्लेट में hPSC माध्यम प्लस ROCKi के 8 mL जोड़ें।
  6. जब कोशिकाएं तैयार होती हैं (जैसा कि बिंदु 2.3, चित्रा 2 ए में वर्णित है), तो जीसीडीआर को एस्पिरेट करें और प्लेट को प्रयोगकर्ता की ओर ~ 45 डिग्री झुकाएं और सेल लिफ्टर के साथ कोशिकाओं को स्क्रैप करें।
    नोट:: यदि कक्ष detatching हैं, तो aspirating GCDR को छोड़ दें और आगे बढ़ें।
  7. प्लेट ~ 90 ° को चालू करें और शेष कोशिकाओं को उठाने के लिए फिर से स्क्रैप करें। प्लेट ~ 45 ° रखें और 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके एचपीएससी माध्यम के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को नीचे धोएं।
  8. बड़े clumps (2-3 बार से अधिक नहीं) को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पिपेट ऊपर और नीचे और तैयार प्लेटों पर ब्याज की सेल लाइन के लिए उपयुक्त अनुपात में कोशिकाओं को बीज दें। इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ प्लेट रखें और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से आकृति आठ गतियों में स्थानांतरित करें।
    नोट:: इस प्रयोग में hPSC लाइनों को 1:5 के अनुपात में विभाजित किया गया था, यह अन्य सेल लाइनों और शर्तों के लिए भिन्न हो सकता है। रात में प्लेट को बिना किसी बाधा के छोड़ दें।
  9. ~ 24 घंटे के बाद, अनुलग्नक के लिए कोशिकाओं की जांच करें। संलग्न छोटे व्यक्तिगत उपनिवेशों की तलाश करें। खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा एचपीएससी माध्यम के 8 एमएल के साथ फिर से भरें (कोई आरओसीकेआई नहीं जोड़ा गया)।
  10. जब तक कोशिकाएं गुर्दे के ऑर्गेनोइड परख शुरू करने के लिए ~ 60% confluency तक नहीं पहुंचती हैं तब तक दैनिक रूप से देखना और खिलाना जारी रखें (आमतौर पर 48 से 72 ज पोस्ट पासिंग तक पहुंच जाता है)। उपनिवेश आदर्श रूप से असतत होंगे और विलय नहीं करेंगे (चित्रा 2 बी)।
    नोट: कोशिकाओं को 80% से अधिक नहीं करने के लिए सीमित करने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है confluency क्रम में उनके pluripotency स्थिति बनाए रखने के लिए. Confluent संस्कृतियों, किसी न किसी तरह से हैंडलिंग या उच्च मार्ग अवांछित सहज भेदभाव या गुर्दे organoid गठन की कम दक्षता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

3. दिन 0 - गुर्दे organoid परख की स्थापना

  1. शुरू करने से पहले, फॉर्मूलेशन (तालिका 1 और तालिका 2) के अनुसार E5-ILP और चरण II मीडिया दोनों तैयार करें।
    नोट: मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक गुर्दे organoid परख के लिए (एक 100 मिमी संस्कृति प्लेट एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के लिए आवश्यक है), एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में पूरा E5-ILP माध्यम तैयार: E5-ILP के 18 mL 8 μM CHIR99021 (14.4 μL), 3.3 μM ROCKi (6 μL), 0.1 mM बीटा-mercaptoethanol (32.7 μL) के साथ पूरक।
  3. एक 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम अनुलग्नक प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूर्ण E5-ILP माध्यम के 2 एमएल जगह.
  4. डीपीबीएस के ~ 8 एमएल के साथ दो बार ~ 60% confluency (चित्रा 2B) पर hPSCs धोएं। Aspirate DPBS तो 100 मिमी प्लेट प्रति dispase के 2 mL जोड़ें, कोशिकाओं को कवर करने के लिए ड्रॉप द्वारा ड्रॉप और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: 6 मिनट के बाद, उपनिवेशों के किनारों को कर्ल करने के लिए शुरू हो जाएगा (चित्रा 2 सी, लाल तीर) जबकि कॉलोनी के बाकी संलग्न रहता है। यदि यह 6 मिनट के बाद प्राप्त नहीं किया जाता है, तो कोशिकाओं को अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। अन्य एचपीएससी मीडिया और मैट्रिक्स इस समय के साथ संगत नहीं हो सकते हैं। लैमिनिन आधारित बीएमई कोटिंग डिस्पैज़ के साथ संगत नहीं है। यदि लैमिनिन आधारित बीएमई मानक एचपीएससी मैट्रिक्स हैं, तो इस विधि में वर्णित बीएमई के साथ खंड 1 में प्लेटों में से एक को कोट करें ताकि गुर्दे के ऑर्गेनोइड परख के लिए उपयोग किया जा सके।
  5. DPBS के ~ 10 mL के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं। Aspirate DPBS तो प्लेट झुकाव ~ 45 ° और एक सेल भारोत्तोलक के साथ नीचे खुरचना.
    नोट: Dispase निष्क्रिय नहीं है, इसलिए इसे अच्छी तरह से धोने की आवश्यकता है। धोने की संख्या को कम न करें।
  6. एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पूर्ण E5-ILP माध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ शीर्ष से नीचे कालोनियों को धोएं। पिपेट किसी भी बड़े उपनिवेश को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे (2 या 3 बार आमतौर पर पर्याप्त होता है)।
  7. 6-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल जोड़कर कॉलोनी समूहों को समान रूप से वितरित करें। प्लेट को एक कक्षीय शेकर (सेटिंग्स: कक्षीय = 30, पारस्परिक = 330°, कंपन = 5° - 2 s) पर रखें जिसे 37 °C इनक्यूबेटर (चित्रा 2D) में रखा गया है।
    नोट: कंपन सुविधा organoids के पर्याप्त वितरण के लिए और clumping को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. दिन 2 - आधे मध्यम परिवर्तन से खिला

नोट: 48 घंटे के भीतर, कॉलोनी क्लस्टर भ्रूण निकायों का निर्माण करेंगे।

  1. पूरा माध्यम तैयार करें: एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में E5-ILP माध्यम + 8 μM CHIR99021 के 12 मिलीलीटर तैयार करें।
    नोट: बीटा-mercaptoethanol और ROCKi की आवश्यकता नहीं है।
  2. Embryoid निकायों को प्लेट के नीचे बसने दें, प्लेट ~ 45 ° को झुकाएं, फिर मध्यम को धीरे-धीरे शीर्ष से एस्पिरेट करें, प्रति अच्छी तरह से ~ 1 एमएल छोड़ दें।
    नोट: इस स्तर पर Embryoid निकायों तेजी से clump. उन्हें 5 मिनट के > के लिए बसने के लिए न छोड़ें।
  3. तैयार पूर्ण माध्यम (अनुभाग 4.1) प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेट को शेकर पर वापस कर दें।

5. दिन 3 - चरण II माध्यम के लिए embryoid निकायों का स्थानांतरण

  1. एक 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब और डीएमईएम (कम ग्लूकोज) तैयार करें। भ्रूणीय निकायों को प्लेट के नीचे बसने दें। प्लेट ~ 45 ° झुकाव और धीरे-धीरे शीर्ष से माध्यम aspirate, अच्छी तरह से प्रति ~ 1 एमएल छोड़ दें।
  2. एक 10 मिली सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं से सभी भ्रूणीय निकायों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और उन्हें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. DMEM (कम ग्लूकोज) के ~ 1 मिलीलीटर के साथ किसी भी शेष भ्रूण निकायों को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक को अच्छी तरह से धोएं और उन्हें उसी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें।
  4. भ्रूण निकायों को ट्यूब के नीचे बसने के लिए छोड़ दें, ~ 5 मिनट। प्रतीक्षा करते समय, 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में चरण II माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एक 200 μm सेल छलनी (चित्रा 2E) का उपयोग कर बड़े embryoid निकायों (>300 μm) बाहर seive.
    1. एक नई 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें और शीर्ष पर 200 μm सेल छलनी जगह है। पिपेट सेल छलनी पर ध्यान से एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सभी भ्रूणीय निकायों का उपयोग करते हैं।
    2. सेल छलनी में फंसे किसी भी भ्रूण निकायों को इकट्ठा करने के लिए डीएमईएम (कम ग्लूकोज) के एक अतिरिक्त ~ 5 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी कुल्ला। भ्रूणीय निकायों को शंक्वाकार ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें।
  5. जब भ्रूण निकायों को बसाया जाता है, तो supernatant aspirate और DMEM (कम ग्लूकोज) के ~ 10 मिलीलीटर के साथ धोएं।
  6. Aspirate DMEM और चरण II माध्यम के 6 mL में embryoid निकायों को फिर से निलंबित।
  7. भ्रूणीय निकायों को 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में वापस स्थानांतरित करें, उन्हें 6 कुओं के बीच समान रूप से वितरित करें।
  8. चरण 4.2 और 4.3 में वर्णित आधे मध्यम परिवर्तनों को हर दूसरे दिन करें।
    नोट: दिन 3 के बाद से, भ्रूण निकायों में एक 'सुनहरा' और चिकनी, गोलाकार उपस्थिति होगी (चित्रा 2 एफ)। ~ दिन 6 से, व्यक्तिगत भ्रूण निकायों में नलिका गठन स्पष्ट हो जाएगा, निम्नलिखित दिनों में बढ़ती संख्या के साथ इष्टतम संख्या और दिन 14 (चित्रा 2 जी, एच) तक वृद्धि तक पहुंच जाएगा। कभी-कभी clumping बनाने को खत्म करने के लिए, नेत्रहीन गुर्दे organoids, या नलिकाओं के बिना बहुत छोटे embryoid निकायों को देखने पर, <200 और बड़े >500 μm organoids के साथ एक 500 और 200 μm सेल strainers के साथ बाहर छलनी के रूप में चरण 5.4.1 और 5.4.2 में वर्णित है.

6. स्पिनर फ्लास्क और खिलाने के लिए स्थानांतरण

नोट: एक स्पिनर फ्लास्क का उपयोग दिन 3 से किसी भी समय उन प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जिनके लिए बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोइड्स का नियमित हस्तांतरण हमारी प्रयोगशाला में 6-8 दिनों के बीच होता है। उपकरण उपलब्ध नहीं है, तो कृपया विकल्पों के लिए चर्चा अनुभाग देखें।

  1. चरण II माध्यम के 45 मिलीलीटर के साथ एक 125 एमएल स्पिनर फ्लास्क में भ्रूण निकायों को स्थानांतरित करें। चुंबकीय हलचल गति को 120 आरपीएम पर सेट करें और इनक्यूबेटर में रखें (चित्रा 2I)।
  2. भ्रूणीय निकायों या गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स को खिलाने के लिए, गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स को स्पिनर फ्लास्क के नीचे संक्षेप में बसने दें। फ्लास्क के एक तरफ की बांह से ढक्कन उठाएं और एस्पिरेटिंग पिपेट को अंदर रखें, टिप के साथ दीवार के विपरीत को छूते हुए।
  3. धीरे-धीरे एस्पिरेटिंग पिपेट को नीचे की ओर कोण करें और माध्यम के लगभग आधे हिस्से को एस्पिरेट करें। एक ही उद्घाटन के माध्यम से इसे pipetting द्वारा ताजा चरण द्वितीय माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ फिर से भरें।

7. 6-अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल प्लेट (6MSP) की स्थापना

नोट:: 6MSP स्वरूप स्पिनर फ्लास्क के स्थान पर उपयोग किया जा सकता है यदि एकाधिक स्थितियों का परीक्षण करने की आवश्यकता है। यौगिक या नेफ्रोटॉक्सिन उपचार के लिए 6MSP का उपयोग करें। यह प्रसार के माध्यम से पोषक तत्वों की उपलब्धता को बनाए रखते हुए दूसरे चरण में उपयोग किए जाने वाले माध्यम की मात्रा को बचाता है।

  1. एक ऊतक संस्कृति उपयुक्त डिटर्जेंट में संक्षेप में धोकर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अंडाकार चुंबकीय हलचल सलाखों को साफ करें (यदि कभी उपयोग नहीं किया जाता है) या पहले उपयोग किए जाने पर > 1 घंटे के लिए भिगोएं।
  2. संक्षेप में बाँझ DPBS में 3x धोएं।
  3. 70% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए 1x धोएं, बाँझ DPBS में 1x।
  4. विरोधी पालन समाधान के साथ कुल्ला और बाँझ DPBS और aspirate में 1x धोना.
  5. ध्यान से, लंबे बाँझ संदंश का उपयोग करके भ्रूणीय निकायों या गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक चुंबकीय हलचल बार रखें।
  6. प्लेट को 6MSP पर रखें और गति को 120 rpm (चित्रा 2J) पर सेट करें। धारा 4.2 और 4.3 के अनुसार आधे मध्यम परिवर्तन के साथ गुर्दे organoids बनाए रखें।
    नोट: चुंबकीय हलचल सलाखों के लिए स्थिति में स्नैप करने और कताई शुरू करने के लिए, आपको पहले शक्ति स्तर को संक्षेप में 100 तक रखने की आवश्यकता हो सकती है, फिर एक बार जब वे सभी कताई कर रहे हैं, तो बिजली के स्तर को 25 तक नीचे लाएं।

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Representative Results

हमारे प्रोटोकॉल के इस सबसे हालिया संस्करण में, गुर्दे के ऑर्गेनोइड भेदभाव को एक परिभाषित, कम प्रोटीन माध्यम में शुरू किया जाता है। assays पूरी तरह से निलंबन में प्रदर्शन कर रहे हैं और hPSCs भेदभाव और tubulogenesis की दीक्षा के लिए संगठन की सहज क्षमता पर भरोसा करते हैं. एक एकल परख एक 100 मिमी ~ 60% confluent hPSC संस्कृति प्लेट से उत्पन्न नियमित रूप से 500-1,000 गुर्दे organoids उपज, के रूप में हमारे पिछले प्रकाशन5 में दिखाया गया है. उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की इतनी उच्च संख्या के कारण, यह प्रोटोकॉल यौगिक परीक्षण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हम नियमित रूप से यौगिक परीक्षण के लिए 6-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करते हैं, हालांकि, इस प्रोटोकॉल को आसानी से दूसरे चरण (दिन 3 के बाद) में उच्च-थ्रूपुट यौगिक परीक्षण के लिए अन्य बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में स्केल किया जा सकता है। पैराफिन वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऑर्गेनोइड्स में नेफ्रॉन खंडों की उपस्थिति को दर्शाता है, यानी हेपेटोसाइट न्यूक्लियर फैक्टर -1 बीटा (एचएनएफ 1 बी) और लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन (एलटीएल) (चित्रा 3 ए - एचएनएफ 1 बी, एलटीएल) को व्यक्त करने वाले गुर्दे की नलिकाएं, और पोडोसाइट क्लस्टर वी-मैफ मस्कुलोपोन्यूरोटिक फाइब्रोसारकोमा ऑन्कोजीन होमोलॉग बी (एमएएफबी) और नेफ्रिन (एनपीएचएस 1) (चित्रा 3 ए - एमएएफबी) - एनपीएचएस 1)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में संशोधन एंडोथेलियल कोशिकाओं के विस्तार का समर्थन कर सकते हैं जैसा कि चित्रा 3 बी में देखा गया है, जो संस्कृति के दिन 26 में प्लेटलेट और एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु 1 (PECAM1) के साथ धुंधला दिखाता है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक कॉन्क. काम कर रहे conc. प्रति 250 मिलीलीटर राशि
TeSR-E5 n/a n/a 238.48 mL
PVA 10% 0.25% 6.25 mL
पेन-स्ट्रेप 100x 1x 2.5 mL
ITSE 100x 0.1x 250 μL
रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड 100x 1x 2.5 mL
प्लास्मोसिन 25 mg/mL 2.5 μg/mL 25 μL

तालिका 1: E5-ILP मध्यम संरचना. रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड और एंटी-माइकोप्लाज्मा अभिकर्मक को छोड़कर सभी अभिकर्मकों को सीधे 0.22 μm स्टेरिकअप निस्पंदन इकाई के ऊपरी कक्ष में पिपेट करते हैं। निस्पंदन के बाद, लिपिड और एंटी-माइकोप्लाज्मा अभिकर्मक जोड़ें। दो सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक कॉन्क. काम कर रहे conc. प्रति 500 मिलीलीटर राशि
DMEM (कम ग्लूकोज) n/a n/a 417.5 mL
KOSR n/a 10% 50 mL
PVA 10% 0.25% 12.5 मिलीलीटर
पेन-स्ट्रेप 100x 1x 5 mL
MEM-NEAA 100x 1x 5 mL
GlutaMAX 100x 1x 5 mL
HEPES 100x 1x 5 mL
प्लास्मोसिन 25 mg/mL 2.5 μg/mL 50 μL

तालिका 2: चरण II मध्यम संरचना। पिपेट को छोड़कर सभी अभिकर्मकों और विरोधी mycoplasma अभिकर्मक एक 0.22 μm स्टेरिकप निस्पंदन इकाई के ऊपरी कक्ष में सीधे. एक बार फ़िल्टर करने के बाद, एंटी-माइकोप्लाज्मा अभिकर्मक जोड़ें। दो सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल अवलोकन. प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन दो चरणों के समय और स्पिनर फ्लास्क और 6MSP के उपयोग को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल के चरण( ए) जीसीडीआर के साथ इलाज किए गए एचपीएससी कॉलोनी की ब्राइट-फील्ड छवि। (बी) इष्टतम confluency, और कॉलोनी आकार एक गुर्दे organoid परख शुरू करने के लिए. (सी) एचपीएससी को 6 मिनट के लिए डिस्पैज़ के साथ इलाज किया जाता है। लाल तीर कर्लिंग उपनिवेशों के किनारों को इंगित करते हैं। (डी) एक कक्षीय शेकर पर ऑर्गेनोइड एसेस। (ई) बड़े भ्रूणीय निकायों को छलनी करने के लिए 200 μm सेल छलनी का उपयोग। (च) चरण II माध्यम में स्थानांतरित होने से पहले दिन 3 (D3) पर भ्रूणीय निकाय। (जी) नलिका गठन का उद्भव दिन 8 (डी 8) और (एच) दिन 14 (डी 14) पर ऑर्गेनोइड कटाई और उपचार के लिए इष्टतम समय बिंदु पर देखा जा सकता है। (I) स्पिनर फ्लास्क एक बहु-स्थिति चुंबकीय प्लेट पर थोक संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है। (जे) एक बहु अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल प्लेट पर परख. स्केल बार्स, 200 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: अपेक्षित परिणाम( ए) दिन 14 गुर्दे organoids के immunofluorescently लेबल पैराफिन वर्गों की प्रतिनिधि confocal छवियों ट्यूबल एपिथेलिया (HNF1B और LTL) और पोडोसाइट क्लस्टर (MAFB) के लिए सकारात्मक धुंधला दिखा रहा है। (बी) दिन 26 गुर्दे organoid वर्गों podocyte क्लस्टर (NPHS1) और एंडोथेलियल कोशिकाओं (PECAM1) के लिए लेबल. स्केल सलाखों, 100 μm (ए); 200 μm (B). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रारंभिक प्रोटोकॉल चरण मध्यवर्ती मेसोडर्म भेदभाव 5,19,20 के लिए महत्वपूर्ण हैं और इसलिए, इस स्तर पर एक कठोर मध्यम संरचना को लागू करना आवश्यक है। प्रोटोकॉल के पहले चरण से सीरम, एल्बुमिन, प्रोटीन मुक्त हाइब्रिडोमा माध्यम II जैसे अपरिभाषित घटकों को हटाने से assays21 के बीच लगातार भेदभाव दक्षता में सुधार करने में मदद मिल सकती है।

गुर्दे की कोशिकाओं की चयापचय स्थिति उनके कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, और ग्लूकोज परिवर्तन परिवर्तित चयापचय स्थिति22 का कारण बन सकता है। पिछले अध्ययनों में वर्णित किया गया है कि ग्लूकोज के उच्च स्तर (25 एमएम तक) एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन को प्रेरित कर सकते हैं और गुर्दे की कोशिकाओं की वृद्धि और ऑक्सीडेंट क्षमता को बदल सकतेहैं 22,23,24। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन24 को बदलने के लिए ग्लूकोज के उच्च स्तर को भी वर्णित किया गया है, जो गुर्दे की बीमारी और नेफ्रोटॉक्सिसिटी की जांच करते समय या गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके दवा की खोज करते समय प्रतिकूल हो सकता है। इसलिए, हमने ऑर्गेनोइड किडनी कोशिकाओं के विवो जैसी चयापचय स्थिति में अधिक को बढ़ावा देने के लिए अपने प्रोटोकॉल में ग्लूकोज के स्तर को कम कर दिया है। नतीजतन, गुर्दे organoid परख के लिए संशोधनों एक सुसंगत, मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जबकि अपनी सादगी बनाए रखने.

गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स अपरिपक्व होते हैं, और विस्तारित संस्कृति (>20 दिन) प्रो-फाइब्रोटिक और गैर-गुर्दे की कोशिका प्रकारों की घटनाओं को जन्म दे सकती है जैसा कि पहले5,25 वर्णित किया गया था, जिससे ऑर्गेनोइड्स स्वस्थ मानव गुर्दे के ऊतकों का कम प्रतिनिधि बन सकते हैं। हमारे अनुभव के आधार पर, इष्टतम उपचार खिड़की, जहां गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स अपने सबसे स्वस्थ हैं, 14-18 दिनों के बीच है। स्पिनर फ्लास्क और बहु-अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल का उपयोग जैसा कि ऊपर वर्णित है, स्थैतिक संस्कृति21,26 के विपरीत समान पोषक तत्वों की उपलब्धता को बढ़ाएगा। यदि निलंबन संस्कृति के लिए उपकरण जैसे शेकर या चुंबकीय हलचल उपलब्ध नहीं हैं, तो यह प्रोटोकॉल अभी भी स्थैतिक संस्कृति में अल्ट्रा-कम अनुलग्नक प्लेटों में पूरी तरह से किया जा सकता है। हालांकि भ्रूणीय निकायों / ऑर्गेनोइड विलय की घटनाओं में वृद्धि हो सकती है, जिससे हाइपोक्सिया के कारण नेक्रोटिक कोर के साथ बड़े नमूने होते हैं। 500 μm से बड़े किसी भी organoids वर्णित सेल strainers का उपयोग करके हटाया जा सकता है। उन मामलों में ऑर्गेनोइड्स के विलय की संभावना को कम करने के लिए, हम प्रति 6-अच्छी तरह से 100 से अधिक ऑर्गेनोइड्स को सीडिंग नहीं करने का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, खिलाने के बाद, ऑर्गेनोइड्स को प्लेट के साथ आंकड़ा आठ गतियों का प्रदर्शन करके समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए।

ऑर्गेनोइड गठन की कम दक्षता (<50%) देखी जा सकती है। यह आमतौर पर तब होता है जब एचपीएससी संस्कृतियां मानक पासिंग के दौरान उच्च confluency (>80%) तक पहुंच गई हैं। यह महत्वपूर्ण है कि एचपीएससी रखरखाव सुसंगत है और कोशिकाओं को ओवर-कॉन्फ्लुएंट बनने के लिए नहीं छोड़ा जाता है। उच्च confluency और असंगत passaging तकनीक भी सहज भेदभाव और वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यदि भेदभाव एचपीएससी संस्कृति में मौजूद है, तो हम परख शुरू करने से पहले, एक ठीक पिपेट टिप के साथ एस्पिरेटिंग करके विभेदित क्षेत्रों को हटाने की सलाह देते हैं यदि यह सेल आबादी के 5% से अधिक नहीं है। यदि भेदभाव क्षेत्र 5% से अधिक है, तो हम अनुशंसा करते हैं कि hPSCs का एक नया बैच पिघला हुआ है और एक नया परख शुरू करने से पहले कम से कम एक बार विभाजित किया जाता है।

हमने देखा है कि कुछ एचपीएससी लाइनें गैर-गुर्दे की कोशिका प्रकारों, जैसे कार्डियक या तंत्रिका ऊतक बनाने के लिए अधिक प्रवण हैं। यदि ऐसा होता है, तो सेल स्ट्रेनर्स का उपयोग करके आकार निस्पंदन उन ऑर्गेनोइड्स को हटाने में मदद कर सकता है जिनमें गैर-गुर्दे की वृद्धि होती है। वैकल्पिक रूप से, एचपीएससी माध्यम और / या मैट्रिक्स को बदलने से गैर-गुर्दे की वृद्धि को कम करने में मदद मिल सकती है। हमारे अनुभव से, वैकल्पिक एचपीएससी मीडिया जिसमें न्यूनतम घटक होते हैं, और बीएमई जैसे कि विट्रोनेक्टिन, एक अधिक कठोर प्लुरिपोटेंट आला प्रदान करते हैं और इस प्रकार अधिक सजातीय एचपीएससी संस्कृतियों को उत्पन्न करने में मदद करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ R01 DK069403, UC2 DK126122 और P30-DK079307 और ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21-985-023
Anti-adherence rinsing solution STEMCELL Technologies 7010
CHIR99021 STEMCELL Technologies 72054 10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks Fisher Scientific 07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates Fisher Scientific 07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers Fisher Scientific 11-495-03 Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase STEMCELL Technologies 7923 Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermo Fisher 11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium Thermo Fisher 14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars 2mag PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers Fisher Scientific 17-456-103 Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL Foxx Life Sciences 138-3211-FLS Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher 08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL Fisher Scientific 14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters - Cell lifter Fisher Scientific 08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators Fisher Scientific 88-861-047 Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher A1413302 BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 GCDR
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35-050-061 L-glutamine supplement.
HEPES (1M) Thermo Fisher 15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Thermo Fisher 51-500-056 ITSE
KnockOut  Serum Replacement - Multi-Species Thermo Fisher A3181502 KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined Millipore-Sigma L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher 11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL Fisher Scientific S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL Fisher Scientific S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit 2mag VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive 2mag VMF 40600 6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution Fisher Scientific MP0976670A4 Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. 
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-268
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15-140-122 Aliquot and freeze
Plasmocin Invivogen ant-mpt Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm Fisher Scientific NC0776417 Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm Fisher Scientific NC0822591 Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA) Millipore-Sigma P8136-250G 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) STEMCELL Technologies 72304 10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  - 10mL Fisher Scientific 13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL Fisher Scientific 13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL Fisher Scientific 13-678-12D
TeSR-E5 STEMCELL Technologies 5916 Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor 2mag VMF 90512 If you use more than one MIXdrive

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References

  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  3. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  4. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
  5. Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  8. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  9. Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  10. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  11. Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
  12. Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
  13. Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
  14. Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
  15. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
  16. Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
  17. Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
  18. Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
  19. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
  20. Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
  21. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  22. Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
  23. Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
  24. Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
  25. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  26. Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 170 गुर्दे organoids CHIR99021 नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन embryoid निकायों गुर्दे के ऊतक pluripotent स्टेम कोशिकाओं निलंबन संस्कृति
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक सरलीकृत विधि
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Przepiorski, A., Crunk, A. E., Holm, T. M., Sander, V., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62452, doi:10.3791/62452 (2021).

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