方法文章

使用假病毒感染的高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体

DOI：

10.3791/62486

⸱

2021年6月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里描述的方案概述了一种快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体，方法是评估恢复期血清样品通过增强型绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒抑制感染的能力。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行的不断发展，很明显，针对该病毒的中和抗体的存在可以提供针对未来感染的保护。因此，随着有效的COVID-19疫苗的创建和转化以前所未有的速度继续，开发快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2的中和抗体对于确定先前感染者和免疫个体的长期感染保护将变得越来越重要。本文介绍了一种高通量方案，该方案使用与SARS-CoV-2刺突蛋白假型的水泡性口炎病毒（VSV）来测量最近从COVID-19中康复的患者的恢复期血清中是否存在中和抗体。使用复制伪型病毒消除了SARS-CoV-2处理所需的3级收容设施的必要性，使几乎任何收容2级实验室都可以访问该协议。使用96孔格式允许同时运行许多样品，周转时间短至24小时。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2019年12月，发现了一种新型冠状病毒，我们现在将其称为SARS-CoV-2，这是2019年冠状病毒病（COVID-19）的病原体1。SARS-CoV-2是一种属于 冠状病毒科 的β冠状病毒。这些包膜病毒组成了一个大的阳性感觉RNA基因组，负责人类和动物的呼吸道和肠道感染2。截至 2021 年 5 月，全球已报告超过 1.57 亿例 COVID-19 病例，超过 320 万人死亡3。开发有效的疫苗已成为全球研究人员的主要目标，至少有77种临床前疫苗正在研究中，90种目前正在进行临床试验4。

冠状病毒编码四种结构蛋白，包括刺突蛋白（S），核衣壳（N），包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。SARS-CoV-2的进入需要S的受体结合域（RBD）与宿主受体，人血管紧张素转换酶2（hACE2）的相互作用，以及随后的膜融合，随后通过宿主细胞丝氨酸蛋白酶，跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）5，6，7，8，9，10.SARS-CoV的S蛋白的体液免疫优势以前已有报道，现在也被证明用于SARS-CoV-2 11，12，13。事实上，在感染24个月后，在SARS-CoV患者的恢复期血清中检测到针对S的中和抗体反应14，突出了它们在长期免疫反应中的关键作用。S蛋白已被确定为一种有前途的疫苗靶标，因此已成为大多数正在开发的疫苗的关键成分15，16。

虽然快速检测中和抗体是疫苗开发的一个关键方面，但它也可能揭示受影响地区的感染率和血清流行病学监测17。Whelan及其同事捐赠了一种具有复制能力的VSV假型，用SARS-CoV-2 S糖蛋白代替野生型VSV糖蛋白，在生物安全2级环境中研究SARS-CoV-2感染18。VSV表达尖峰（VSV-S）将用于确定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体反应。由于这里使用的VSV-S也表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP），因此可以在24小时内检测到eGFP病灶以量化感染，而斑块形成可能需要48至72小时。这里总结的是一个简单有效的方案，用于确定恢复期患者血清中和VSV-S-eGFP感染的能力。这种方法也可以很容易地适应于询问其他潜在的治疗方法，这些疗法旨在破坏SARS-CoV-2 S蛋白的宿主 - 病毒相互作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 用于SARS-CoV-2假病毒生产和定量的电镀细胞（第1天）

  1. 组织培养的准备
    1. 温热的1倍杜尔贝克磷酸盐缓冲盐水（DPBS）;Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（可选）;和0.25%胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）在水浴中至37°C约15分钟。
    2. 用70%乙醇消毒组织培养罩，并根据需要将组织培养皿，巴斯德移液器和血清学移液器放入组织培养罩中。从水浴中取出PBS，DMEM和胰蛋白酶，并在放入组织培养罩之前用70%乙醇消毒。
  2. 电镀和维持电池






    3. figure-protocol-1





访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议概述了一种通过抑制VSV-S-eGFP假病毒感染（可通过检测到的eGFP病灶的丧失来量化）来检测针对SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体的快速有效方法。该协议的原理图如图 1所示。建议每次运行检测时使用市售抗体作为阳性对照，以确保测定的一致性。在这里，我们展示了与IgG对照相比，使用市售的中和IgG抗体对抗SARS-CoV-2 Spike RBD的稀释曲线（有关两种抗体的详细信息，请参见 材料表 ; 图 2）。

在SARS-CoV-2感染后约三个月收集恢复期患者样本，并使用上述方法测定假病毒中和（图3）。重要的是，使用健康的供体血清观察到最小的背景抑制。此外，值得注意的是，该测定根据住院治疗的需要区分症状严重程度高的患者和病情较轻的患者。与其他报告一致，我们在小型队列中观察到，住院患者往往比不需要住院的患者表现出更高的中和能力1...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处描述的方法可以根据需要进行调整，以适应不同的实验室环境和资源。重要的是，该协议的主要局限性是需要2级密封空间和组织培养罩。应用具有SARS-CoV-2尖峰的复制RNA病毒假型，如VSV-S-eGFP，是SARS-CoV-2病毒的强大替代品，SARS-CoV-2病毒需要3级工作区域，但对于某些群体来说可能仍然是一个限制。此处描述的所有其他步骤都非常灵活，几乎可以在任何2级密闭实验室中执行。例如，不需要使用具有自动计数功能的荧光成像仪。这里使用的96孔格式意味着只需要大约4个视野就可以使用可用的最低物镜（2x）对几乎整个孔进行成像。

手动荧光显微镜可用于对每个孔的多个场进行成像，然后可以使用ImageJ（免费软件）来量化eGFP病灶。此外，我们选择使用96孔格式，以尽可能低的血清量，并将耗材使用量保持在最低限度。如果没有荧光显微镜，该方案可以放大到6孔或12孔格式，以检测晶体紫固定和染色后的斑块形成（类似于上述病毒滴度方案）。执行此协议时要记住的最关键的考虑因素是VSV-S-eGFP的温度灵敏度。使用VSV-S-eGFP时，应始终将病毒等分成小体积，以避免多次冻融循环，并尽可能将...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者与本出版物没有相互竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢惠兰实验室慷慨地提供了该协议中使用的VSV-S-eGFP病毒（在Case et al. 2020中描述）。我们还感谢Bill Cameron博士和Juthaporn Cowan博士（以及团队）收集患者血液样本（REB协议ID 20200371-01H）。作者披露了对本文的研究，作者身份和/或发表的以下财务支持:这项工作由渥太华医院基金会的慷慨支持和加拿大卫生研究院（#448323）的赠款以及Thistledown COVID-19科学基金会向C.S.I.T.R.J.的快速资助资助，由安大略省研究生奖学金和集群Mitacs奖学金资助。JP由集群Mitacs奖学金资助。T.A.由CIHR Banting奖学金资助。我们还要感谢所有参与并为这项研究捐献血液样本的个人。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （Gibco）Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher Scientific自动荧光成像仪
羧甲基纤维素SigmaC5678
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （Gibco）Fisher scientific10-013-CV
Dulbecco 改良 Eagle的培养基（粉末） （Gibco）ThermoFisher Scientific12-800-017
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG 同种型对照品（小鼠）Thermo Fisher Scientific31903
青霉素/链霉素Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 （2019-nCoV） 刺突中和抗体，小鼠 MabSinoBiological40592-MM57
Vero E6 细胞ATCC CRL-1586
Thermo 系列

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299(2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455(2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462(2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Pseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

相关文章