本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
随着由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行持续演变，中和抗体的存在可能为防止未来感染提供保护作用，这一点已变得日益明确。因此，在开发和转化有效的COVID-19疫苗以前所未有的速度推进的同时，建立快速且有效的SARS-CoV-2中和抗体检测方法，对于评估既往感染者和已接种疫苗个体的长期免疫保护效果将变得愈发重要。本文介绍了一种高通量检测方案，该方案使用携带SARS-CoV-2刺突蛋白的水疱性口炎病毒（VSV）假病毒，用于检测近期从COVID-19康复的患者恢复期血清中中和抗体的存在情况。采用可复制的假病毒系统，避免了处理SARS-CoV-2所需的生物安全三级实验室条件，从而使该方案几乎适用于任何生物安全二级实验室。本方法采用96孔板格式，可在24小时的短周期内同时处理大量样本。
引言
2019年12月，一种新型冠状病毒被发现，即我们现在所知的SARS-CoV-2，它是2019冠状病毒病（COVID-19）的致病因子1SARS-CoV-2 是一种属于β冠状病毒属的病毒 冠状病毒科 这些有包膜病毒含有较大的正链RNA基因组，可导致人类和动物的呼吸道及肠道感染。2截至2021年5月 全球报告的 COVID-19 病例已超过 1.57 亿例，死亡人数超过 320 万 百万死亡病例3开发一种有效疫苗已成为全球研究人员的首要目标，目前至少有77种 正在研究中的临床前疫苗和90 目前正在进行临床试验4.
冠状病毒编码四种结构蛋白，包括刺突蛋白（S）、核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。SARS-CoV-2的入侵需要S蛋白的受体结合域（RBD）与宿主受体人血管紧张素转换酶2（hACE2）相互作用，并在宿主细胞丝氨酸蛋白酶跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的蛋白水解切割后发生膜融合5,6,7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 铺板细胞（第1天）以生产与定量SARS-CoV-2假病毒
- 组织培养的准备工作
- 将1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（可选）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以及0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）置于水浴中约37 °C预热15分钟。
- 用70%乙醇对组织培养超净台进行消毒，并根据需要将组织培养皿、巴斯德吸管和血清移液管放入超净台内。将PBS、DMEM和胰蛋白酶从水浴中取出，在放入超净台前用70%乙醇消毒。
- 细胞接种与维持
- 将Vero E6细胞在含10% FBS的DMEM中培养于T75组织培养瓶或15 cm组织培养皿中，置于37 °C、5% CO2的培养箱中。当细胞融合度达到80–90%时，根据需要进行传代。
- 向每块培养皿中加入10 mL 1× PBS洗涤细胞，轻轻晃动4–5次，随后吸除PBS。向每块培养皿中加入3 mL胰蛋白酶-EDTA，轻摇培养皿确保整个表面被覆盖。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育约5分钟，或直至细胞完全脱落。
- 加入7 mL含10% FBS的DMEM以终止胰蛋白酶作用，并通过反复吹打使细胞重悬。使用台式离心机在500 × g条件下离心5分钟去除胰蛋白酶，小心吸除上清液而不扰动细胞沉淀，再将细胞重悬于10....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案概述了一种通过抑制VSV-S-eGFP假病毒感染来快速有效地检测抗SARS-CoV-2 S蛋白中和抗体的方法（可通过检测eGFP焦点减少进行定量）。方案的示意图见图1。建议每次实验运行时均使用商业来源的抗体作为阳性对照，以确保实验的一致性。本文展示了针对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的商业中和IgG抗体与IgG对照的稀释曲线（两种抗体的详细信息见材料表；图2）。
在 SARS-CoV-2 感染后约三个月采集康复期患者样本，并采用上述方法测定假病毒中和效果（图 3）。重要的是，使用健康供体血清时观察到的背景抑制作用极低。此外，该检测方法可根据患者是否需要住院治疗，区分症状严重程度较高的患者与症状较轻的患者。与其他研究报道一致，在我们的小型队列中观察到，需要住院的患者往往比无需住院的患者表现出更强的中和能力19
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法可根据不同实验室环境和资源需求进行相应调整。重要的是，本方案的主要限制在于需要生物安全二级（containment level 2）实验空间和组织培养操作台。使用携带SARS-CoV-2刺突蛋白的复制型RNA病毒假病毒（如VSV-S-eGFP），是替代需要在生物安全三级（containment level 3）工作区操作的SARS-CoV-2病毒的一种有力方案，但对部分研究团队而言仍可能存在限制。此处描述的其他所有步骤均具有较高灵活性，几乎可在任何生物安全二级实验室中完成。例如，无需配备具有自动计数功能的荧光成像仪。本方案采用的96孔板格式意味着，使用最低倍物镜（2x）仅需拍摄约4个视野即可覆盖每个孔的绝大部分区域。
可使用手动荧光显微镜对每个孔中的多个视野进行成像，然后利用ImageJ（免费软件）对eGFP焦点进行定量分析。此外，我们选择采用96孔板格式，以尽可能减少血清用量并最大限度降低耗材消耗。若无荧光显微镜，本实验方案可放大至6孔或12孔板格式，通过结晶紫固定和染色后检测噬斑形成（类似于上述病毒滴定实验方案）。执行本实验方案时最关键的注意事项是VSV-S-eGF.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明本出版物无相关竞争性财务利益。
致谢
我们感谢Whelan实验室慷慨提供了本方案中使用的VSV-S-eGFP病毒（详见Case et al. 2020）。我们还感谢Bill Cameron博士和Juthaporn Cowan博士（及其团队）协助采集了患者血液样本（REB方案编号：20200371-01H）。作者声明本研究、撰写和/或发表本文获得了以下资金支持：本研究由渥太华医院基金会的慷慨资助、加拿大卫生研究院（#448323）的资助以及Thistledown基金会为C.S.I.提供的COVID-19科学快速资助（Fast Grant）共同支持。T.R.J.获得了安大略省研究生奖学金和Mitacs联合培养博士后奖学金的资助。JP获得了Mitacs联合培养博士后奖学金的资助。T.A.获得了加拿大卫生研究院（CIHR）班廷博士后奖学金的资助。我们还要感谢所有参与本研究并捐献血液样本的志愿者。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | 全自动荧光成像仪 | |
| 羧甲基纤维素 | Sigma | C5678 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（粉末）(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| 杜尔贝科’s 磷酸盐缓冲液 (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG 同型对照（小鼠） | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体 | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 细胞 | ATCC | CRL-1586 |
参考文献
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
