使用假病毒感染的高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体

这里描述的方案概述了一种快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体，方法是评估恢复期血清样品通过增强型绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒抑制感染的能力。

这种方法提供了一种方法来回答有关正在开发的SARS-CORONAVIRUS-2疫苗的更重要问题之一。疫苗是否能够引发中和抗体反应？这种技术的主要优点是可以在二级密闭设施中完成。

它还相对快速且便宜，非常适合一次分析许多样品。为了演示中和酸的程序，我们有实验室的高级技师Ricardo Marius和医学博士生Taylor Jamieson。首先在DMEM中培养Vero E6细胞，在37摄氏度和5%二氧化碳下补充10%FBS。

要使细胞通过，首先通过加入10毫升PBS并轻轻摇动培养皿四到五次来洗涤它们。吸出PBS后，加入三毫升胰蛋白酶EDTA并摇动培养皿，以确保在37摄氏度下孵育之前覆盖整个表面。一旦细胞脱离，通过添加七毫升补充有10%FBS的DMEM来停用胰蛋白酶，然后通过上下移液几次来重悬细胞。

通过离心除去胰蛋白酶并吸出上清液而不干扰细胞沉淀，然后将细胞重悬于10毫升新鲜DMEM中。计数后，将大约10至第七个细胞加入每个15厘米的板中，并孵育培养物一到两天，直到细胞100%汇合。为了制备VSV尖峰EGFP假病毒以进行滴定，用稀释在12毫升无血清DMEM中的储备病毒感染感染0.01倍感染细胞。

加入病毒后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育一小时，偶尔摇晃。在孵育结束时，用补充有2%FBS和20毫摩尔堆的新鲜DMEM替换接种物，然后将细胞在34摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。第二天，使用荧光显微镜可视化受感染细胞的EGFP表达。

一旦观察到广泛的细胞病变效应和细胞脱离，收集培养物上清液并通过离心除去碎片。为避免多次冻融循环，在储存在零下80摄氏度之前等分上清液。为了确定病毒滴度，将Vero E6细胞以每孔6倍10至第5个细胞的接种密度接种在六个孔板中，并孵育过夜。

第二天，通过向第一管中加入900微升培养基至7微量离心管，并在第一管中加入100微升病毒原液，设置十倍连续稀释系列病毒原液。短暂涡旋后，将100微升稀释的病毒转移到每个后续管中，在每个管之间涡旋。然后用500微升的10至10至10至10至负7个病毒稀释液替换Vero E6培养板每个孔中的上清液。

在细胞培养箱中孵育45分钟后，每15分钟轻轻摇动一次，用覆盖溶液替换接种物，并将细胞在34摄氏度下用5%二氧化碳孵育48小时。在孵育结束时，通过结晶紫染色来观察斑块，用PBS洗涤细胞一次，然后向每个孔中加入两毫升0.1%结晶紫。将板放在摇臂上，在室温下约20分钟，然后用PBS轻轻清洗每个孔两次。

最后一次洗涤后，让板风干至少一个小时，然后使用指示的配方以每毫升斑块形成单位计算每个孔中病毒的滴度。要将细胞接种中和测定，请使用多通道移液器以每毫升10至第五个细胞的密度向96孔板的每个孔中加入100微升Vero E6细胞，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育板24小时。第二天，加热灭活患者血清样品，在56摄氏度的水浴中测试30分钟。

然后在A排的每个孔中加入8微升血清与抗生素的72微升无血清DMEM，在空的96孔组织培养板中设置患者血清样品的十倍稀释系列，然后在B行的每个孔中加入40微升无血清DMEM至G，向H排的每个孔中加入80微升。 混合A行中的样品，然后将40微升样品从A行的每个孔转移到B行的每个孔中.混合后，重复对每行后续孔的稀释，直到行F.接下来，向A行至G行中的每个孔中加入40微升VSV峰EGFP，感染率为0.05， 并通过移液四到五次混合，然后将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育一小时。在孵育结束时，小心地从Vero E6培养板的每个孔中吸出上清液，并将60微升抗体病毒混合物从样品稀释板的每个孔转移到细胞培养板的相应孔中。转移所有样品后，将细胞培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳下一小时，每20分钟摇动一次。

孵育完成后，向细胞培养板的每个孔中加入140微升羧甲基纤维素覆盖溶液，并将板转移到34摄氏度和5%二氧化碳培养箱中。24小时后，在488纳米波长的自动荧光成像仪上对板进行成像，并使用成像仪的自动计数功能来量化单个EGFP病灶。在这个具有代表性的例子中，市售的针对SARS-coronavirus-2尖峰受体结合域的中和抗体被用作阳性对照，与IgG一起用作阴性对照。

抑制百分比是根据通过荧光成像检测到的EGFP病灶的数量计算的。在SARS-coronavirus-2感染后约三个月收集的恢复期患者样本对假病毒中和显示，与不需要住院的患者相比，住院患者的中和能力有所提高。该程序还可用于评估旨在阻断病毒感染的其他COVID-19预防和治疗剂。