Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Abstract

Şiddetli akut solunum yolu sendromu Coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu COVID-19 pandemisi gelişmeye devam ederken, virüse karşı nötralize edici antikorların varlığının gelecekteki enfeksiyona karşı koruma sağlayabileceği ortaya çıktı. Bu nedenle, etkili COVID-19 aşılarının oluşturulması ve çevirisi benzeri görülmemiş bir hızda devam ettikçe, SARS-CoV-2'ye karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi, hem daha önce enfekte olmuş hem de aşılanmış bireyler için enfeksiyona karşı uzun vadeli korumayı belirlemek için giderek daha önemli hale gelecektir. Bu makalede, COVID-19'dan yeni kurtulan hastalardan iyileşen serumda nötralize edici antikorların varlığını ölçmek için SARS-CoV-2 spike proteini ile sözde olarak yazılmış veziküler stomatit virüsü (VSV) kullanan yüksek verimli bir protokol açıklanmaktadır. Çoğaltıcı bir sözde virüs kullanımı, SARS-CoV-2 kullanımı için gerekli olan bir muhafaza seviyesi 3 tesisi için gerekliliği ortadan kaldırır ve bu protokolü hemen hemen her kapsama seviyesi 2 laboratuvarı için erişilebilir hale getirir. 96 kuyulu bir formatın kullanılması, birçok örneğin aynı anda 24 saat kısa bir geri dönüş süresiyle çalıştırılmasını sağlar.

Introduction

Aralık 2019'da, şimdi sars-CoV-2 olarak bildiğimiz, koronavirüs hastalığının etken maddesi 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2, Coronaviridae ailesine ait bir betakoronavirüstür. Bu zarflı virüsler büyük bir pozitif duyu RNA genomunu içerir ve hem insanlarda hem de hayvanlarda solunum ve bağırsak enfeksiyonlarından sorumludur2. Mayıs 2021 itibarıyla küresel olarak bildirilen 157 milyondan fazla COVID-19 vakası ve 3,2 milyondan fazla ölüm3. Etkili bir aşının geliştirilmesi, incelenmekte olan en az 77 klinik öncesi aşı ve şu anda klinik deneylerden geçen 90 ile dünya çapında araştırmacıların birincil hedefi haline gelmiştir4.

Koronavirüsler spike proteini (S), nükleocapsid (N), zarf proteini (E) ve membran proteini (M) dahil olmak üzere dört yapısal proteini kodlar. SARS-CoV-2'nin girişi, S'nin reseptör bağlayıcı etki alanının (RBD) konak reseptör ile etkileşimini gerektirir, insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) ve konak hücresel serine proteaz, transmembran proteaz serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 tarafından proteolitik bölünmeyi takiben sonraki membran füzyonu . SARS-CoV'un S proteininin humoral immün hakimiyeti daha önce bildirilmiştir ve şimdi SARS-CoV-211 , 12,13için de gösterilmiştir. Gerçekten de, SARS-CoV hastalarından iyileşen serumda S'ye karşı nötralize edici antikor yanıtları tespit edilmiştir Enfeksiyon 14 ' ten24ay sonra , uzun süreli immün yanıttaki kritik rollerini vurgulamaktadır. S proteini umut verici bir aşı hedefi olarak tanımlanmıştır ve bu nedenle geliştirilmekte olan çoğu aşının önemli bir bileşeni haline gelmiştir15,16.

Nötralize edici antikorların hızlı tespiti aşı geliştirmenin kritik bir yönü olmakla birlikte, etkilenen bölgelerde enfeksiyon ve sero-epidemiyolojik gözetim oranına da ışık tutabilir17. Biyogüvenlik seviye 2 ayarlarında SARS-CoV-2 enfeksiyonunu incelemek için vahşi tip VSV glikoproteinin yerine SARS-CoV-2 S glikoprotein ile sözde replikasyon yetkin bir VSV, Whelan ve iş arkadaşları tarafından nazikça bağışlandı18. SARS-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikor yanıtını belirlemek için VSV ekspresying spike (VSV-S) kullanılacaktır. Burada kullanılan VSV-S aynı zamanda gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) ifade ettiği için, enfeksiyonu ölçmek için 24 saat içinde eGFP odakları tespit edilebilirken, plak oluşumu 48 ila 72 saat sürebilir. Burada özetlenen, iyileşen hasta serumunun VSV-S-eGFP enfeksiyonunu nötralize etme yeteneğini belirlemek için basit ve etkili bir protokoldür. Bu yöntem, SARS-CoV-2 S proteininin konak-viral etkileşimini bozmayı amaçlayan diğer potansiyel terapötikleri sorgulamak için de kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SARS-CoV-2 psödovirüs üretimi ve niceliği için kaplama hücreleri (Gün 1)

  1. Doku kültürüne hazırlık
    1. Sıcak 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS); Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Modifiye Kartal Orta (DMEM) (isteğe bağlı); ve yaklaşık 15 dakika boyunca bir su banyosunda% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ila 37 °C.
    2. Bir doku kültürü davlumbazını% 70 etanol ile dezenfekte edin ve doku kültürü yemeklerini, Pasteur pipetlerini ve serolojik pipetleri gerektiğinde doku kültürü başlığına yerleştirin. PBS, DMEM ve tripsinleri su banyosundan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirmeden önce% 70 etanol ile dezenfekte edin.
  2. Hücrelerin kaplayıp bakımını
    1. DMEM'deki Vero E6 hücrelerini (%10 FBS içeren) T75 doku kültürü şişelerinde veya 15 cm doku kültürü yemeklerini% 5 CO2ile 37 °C inkübatörde büyütün. Hücreler% 80-90 birleştiğinde hücreleri gerektiği gibi geçiştirin.
    2. Her yemeğe 10 mL 1x PBS ekleyerek ve 4-5 kez hafifçe sallayarak hücreleri yıkayın; PBS'i aspire edin. Her yemeğe 3 mL tripsin-EDTA ekleyin, tüm yüzeyin kaplı olduğundan emin olmak için plakayı sallayın. Hücreleri 37 °C'de yaklaşık 5 dakika boyunca % 5 CO2 ile veya hücreler ayrılana kadar kuluçkaya yatırın.
    3. Trypsin'i devre dışı bırakmak için 7 mL DMEM (%10 FBS içeren) ekleyin ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyarak yeniden biriktirin. 5 dakika boyunca 500 × g'da bir tezgah üstü santrifüj kullanarak trypsin'i çıkarmak için hücreleri aşağı çevirin, hücre peletini bozmadan ortamı epire edin ve hücreleri 10 mL DMEM'de (% 10 FBS içeren) yeniden biriktirin. Gelecekteki deneyler için hücreler gerekiyorsa, 15 mL taze DMEM (%10 FBS içeren) içeren yeni bir tabağa 1 mL yerleştirin.
    4. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve her 15 cm plakaya yaklaşık 1 ×10 7 hücre ekleyin ve % 100 birleştiğinde(1-2 gün) % 5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkaya yatın.

2. VSV-S-EGFP psödovirüs hazırlığı

  1. Enfeksiyon
    1. 37 °C'de 1 saat serumsuz DMEM'in 12 mL'sinde VSV-S-eGFP stok virüsü ile çokluk enfeksiyon (MOI) 0.01'deki hücreleri % 5 CO 2 ile enfekteedin, bazen plakaları sallayın. İnoculumu taze DMEM ile değiştirin (%2 FBS ve 20 mM HEPES, pH 7.7 içerir) ve %5 CO2ile 34 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre geçin.
      NOT: VSV-S-eGFP'nin hücre kültüründe yayılması için 34 °C sıcaklık gereklidir.
    2. Kapsamlı sitopatik etki (CPE) ve hücre müfrezesinin gözlemlenmesi üzerine hücre süpernatantlarını toplayın, enfeksiyon sonrası yaklaşık 48 saat. Enfeksiyon sonrası 24 saat başlayarak enfekte hücreler tarafından eGFP'nin kapsamlı ekspresyonunu görselleştirmek için floresan mikroskop kullanın.
  2. Koleksiyon
    1. Hücre kalıntılarını gidermek için 1.000 × g'da 5 dakika boyunca tezgah üstü santrifüj kullanarak süpernatantları santrifüj edin. Birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için süpernatant Aliquot ve -80 °C'de saklayın.

3. VSV-S-eGFP psödovirüsü titering

  1. Viral titreyi belirlemek için seri seyreltme
    1. DMEM'de kuyu başına 6 × 10 5 hücre tohumlama yoğunluğunda6 kuyu plakalarında Plaka Vero E6 hücreleri (%10 FBS ile) ve %5 CO2ile 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatır.
      NOT: TMPRSS2 ve hACE2'yi aşırı ifade eden Vero hücreleri de kullanılabilir.
    2. Yedi mikrosantrifüj tüpüne 900 μL ortam yerleştirerek soğuk serumsuz DMEM'de VSV-S-eGFP virüsünün 10 kat seri seyreltme serisini kurun. 1'den 7'ye kadar etiket tüpleri. İlk tüpe ve girdaplara kısaca 100 μL viral stok ekleyin. 100 μL seyreltilmiş virüsü tüp 1'den tüp 2 ve girdaplara kısaca aktarın; tüp 7'ye kadar devam edin.
    3. Ortamı Vero E6 hücrelerini içeren 6 kuyu plakasının tüm kuyularından epire edin ve 10-2 ila 10-7arasında 500 μL seyreltme ile değiştirin. Plakaları 37 °C'de 45 dakika boyunca % 5 CO2ile kuluçkaya yaslayın, her 15 dakikada bir hafifçe sallayın.
    4. Inoculumu aspire edin ve 2x DMEM ve% 6 karboksimetil selüloz (CMC) karışımını içeren kaplama ile değiştirin,% 3 CMC'lik son konsantrasyon,% 10 FBS ile desteklenir; 34 °C'de 48 saat boyunca %5 CO2 ile kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kaplama karışımını enfeksiyon adımı sırasında 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika önceden ısıtın. CMC yerine %10 FBS ile desteklenmiş 2x DMEM ile %1 agarose karışımı kullanılabilir. Agarose ile kaplamak için% 1 agarose kaynatın (dH2O'da) ve soğuk 2x DMEM ile karıştırın. Hücre monolayerine (yaklaşık 37-40 °C) eklemeden önce karışımın uygun bir sıcaklık olduğundan emin olun. Kaplama için agarose kullanılırsa, hücreler boyamadan önce en az bir saat boyunca 2 mL 3:1 metanol:asetik asit inkübe edilerek sabitlenmelidir.
  2. Viral titreyi boyama ve hesaplama
    1. Kristal mor ile boyayarak veya floresan mikroskop altında eGFP'nin doğrudan görselleştirilmesiyle plakları görselleştirin.
    2. Plakaları lekelemek için kaplamayı epire edin, PBS ile bir kez yıkayın, ardından her kuyuya 2 mL% 0,1 kristal menekşe (% 80 metanol ve dH2O) ekleyin. Lekeyi silmeden önce oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika boyunca bir tabak sallayıcı üzerine yerleştirin. Kristal menekşeyi çıkarın ve dH2O veya PBS kullanarak her kuyuyu iki kez hafifçe yıkayın.
      NOT: Hücre monolayerinin işlem boyunca bozulmadan kalmasını sağlamak için yıkama ve boyama adımları her kuyunun kenarına doğru yavaşça pipetlenerek hafifçe yapılmalıdır.
    3. Plakaları saymadan önce plakaların en az 1 saat kurumasına izin verin. Plak sayımlarının 20 ila 200 plak içeren kuyulardan elde edildiğinden emin olun. ML başına plak oluşturan birimlerde (PFU) virüsün titresini hesaplamak için, sayılan kuyunun seyreltme faktörünü enfeksiyon hacmiyle çarpın ve bu sayıyı ilgili kuyuda bulunan plaklardan bölün.
      Equation 1

4. SARS-CoV-2 psödovirüsün piyasada bulunan antikorlar ve iyileşen hasta serumu ile nötralizasyonunun ölçümü için kaplama hücreleri (Gün 1)

  1. Doku kültürüne hazırlık
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi orta ve doku kültürü davlumbaz hazırlayın. Ek olarak, numune başına en az 2 çoğaltmaya (yani, 6 numune başına 1 plaka) uyum sağlamak için gerekli sayıda 96 kuyu plakası hazırlayın; örnek birim izin verirse ek çoğaltmalar ekleyin.
  2. Hücrelerin kaplayıp bakımını
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi Vero E6 hücrelerini büyütün ve koruyun. 96 kuyu plakası başına mL başına 2 × 105 hücre konsantrasyonda en az 10 mL hücre süspansiyonu hazırlayın (gerekirse 48 saat sonra yapılan tahliller için mL başına plaka1,5 × 10 5 hücre). Çok kanallı pipet kullanarak 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de24saat kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Hücre süspansiyonu iyice karıştırın ve hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için her plakayı her yöne hafifçe sallayın.

5. Antikor veya serum seyreltmeleri ve enfeksiyonları (Gün 2)

NOT: Bu protokol, VSV-S-eGFP'nin hem piyasada bulunan antikorlar hem de hasta serumu ile nötralizasyonunu ve klinik öncesi aşı geliştirme çalışmaları için hayvanlardan toplanan serumu ölçmek için uygulanabilir. *Hasta/hayvan serumu örneklerini kullanırken listelenen ek adımları not alın.

  1. Seri seyreltme serisi
    1. Serum örneklerini seyreltmeden önce, her numuneyi 56 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca ısı inaktive ederek komplemanı etkisiz hale getirin. Hasta numuneleri alınırken gerekli güvenlik önlemlerinin alınmasını sağlamak; sadece doku kültürü davlumbazındayken numune kaplarını açın ve uygun muhafaza seviyesi 2 kişisel koruyucu ekipmanın giyildiğinden emin olun.
    2. Seyreltme serisini boş bir 96 kuyu plakasına ayarlayın (Plaka 1).
    3. 96 kuyu plakasının A Satırındaki tüm seyreltmelere 80 μL'de başlayın. *Hasta örnekleri için, 72 μL serum içermeyen DMEM'e (%1 penisilin/streptomisin ile) 8 μL serum yerleştirerek seyreltme serisine 10'da 1'de başlayın.
      NOT: Kullanılan nötralize edici antikor konsantrasyonu, üretici tarafından tahmin edilen aktiviteye bağlı olacaktır. Burada kullanılan SARS-CoV-2 Spike nötralizasyon antikor için (Bkz. Malzeme Tablosu),en az% 50 nötralizasyon gözlemlemek için 5 μg / mL ile başlayın.
    4. B'den G'ye kadar olan satırlara 40 μL serumsuz DMEM (%1 penisilin/streptominin ile), H satırına ise 80 μL ekleyin. Yalnızca hücre denetimi görevi yaptığı için H satırına virüs eklemeyin.
    5. 12 kuyulu çok kanallı pipet kullanarak, 40 μL seyreltilmiş serum veya antikoru A satırından B satırına karıştırın ve aktarın. Yalnızca virüs kontrol satırını temsil ettiği için G satırına serum eklemeyin.
  2. Enfeksiyon ve kaplama
    1. MoI 0.05'te (veya 2000 pfu) her birini iyi tedavi etmek için uygun miktarda seyreltilmiş VSV-S-eGFP hazırlayın. (Bu hesaplamayı tamamlarken, toplam 80 μL hacminin sadece 60 μL'nin hücrelere taşınacağını unutmayın; bu nedenle, 2000 pfu'yu korumak için virüsün hacmini 1.33 ile çarpdığınızdan emin olun).
      NOT: VSV-S-eGFP sıcaklığa duyarlı olduğundan, viral stokların kullanılmadığında buzda kalmasını sağlayın ve tekrarlanan donma sonrasında titreler farklılık gösterecek şekilde birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
    2. Plaka 1'in A ila G satırlarındaki her kuyuya 40 μL seyreltilmiş virüs ekleyin ve 4-5 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın. Plakayı % 5 CO2ile 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    3. Hücreleri içeren plakayı inkübatörden çıkarın (Plaka 2) ve ortamı tüm kuyulardan dikkatlice emiş edin. Plaka 1'den Plaka 2'ye 60 μL antikor / virüs karışımı aktarın ve % 5 CO 2 ile 37 ° C'de1saat boyunca kuluçkaya yatırın, plakayı her 20 dakikada bir sallayın.
    4. %3 CMC'lik son konsantrasyon için DMEM'de CMC içeren 140 μL kaplama ile her kuyuya (%10 FBS ve %1 penisilin/streptominin) kadar yükleme. Plaka 2'yi görüntülemeden önce yaklaşık 24 saat boyunca %5 CO2 ile 34 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Kaplama karışımını enfeksiyon adımı sırasında 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika önceden ısıtın.

6. Görüntüleme ve nicelik (Gün 3)

  1. Otomatik floresan görüntüleyici (floresan izotiyosiyanat (FITC) filtresi veya 488 nm uyarsöy dalga boyu olan alternatif bir filtre kullanarak) kullanan görüntü plakaları. Bireysel eGFP odaklarını otomatik olarak tanımlayan ve sayan bir protokol oluşturarak viral enfeksiyonu ölçün. Otomatik sayım özelliği yoksa, eGFP odaklarının sayısını ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, VSV-S-eGFP psödovirüs enfeksiyonunun inhibisyonu yoluyla SARS-CoV-2 S proteinine karşı nötralize edici antikorları tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir (tespit edilen eGFP odaklarının kaybı ile ölçülebilir). Şekil 1'de protokolün şematik bir gösterimi resmedilmiştir. Testin tutarlılığını sağlamak için test her çalıştırılmasında pozitif kontrol olarak piyasada bulunan bir antikorun kullanılması önerilir. Burada, bir IgG kontrolüne kıyasla SARS-CoV-2 Spike RBD'ye karşı piyasada bulunan nötralize edici bir IgG antikoru kullanarak bir seyreltme eğrisi gösteriyoruz (her iki antikor hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın; Şekil 2).

SARS-CoV-2 enfeksiyonundan yaklaşık üç ay sonra iyileşen hasta örnekleri toplanmış ve yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak psödovirüs nötralizasyonu belirlenmiştir(Şekil 3). Daha da önemlisi, sağlıklı donör serum kullanılarak minimal arka plan inhibisyonu gözlendi. Ayrıca, bu test, yüksek semptom şiddeti olan hastalar ile hastaneye yatış ihtiyacına bağlı olarak daha hafif hastalığı olanlar arasında ayrım yapmaktadır. Diğer raporlar doğrultusunda, küçük kohortumuz içinde hastanede yatan hastaların hastaneye yatış gerektirmeyenlere göre nötralizasyon kapasitesinin arttığını gösterme eğiliminde olduğunu gözlemledik19,20. Hastanede yatan ve hastanede yatan olmayan hasta örnekleri için durum her zaman böyle olmasa da, tahlillerin çeşitli derecelerde nötralizasyonun ayırt edilebilmesi bir varlıktır. Hasta serumunun nötralize edici yeteneğinin burada gösterilenlerden çok daha yüksek olduğu durumlar da olabilir. Gerekirse, hasta serumunun başlangıç seyreltilmesi ayarlanabilir veya ek bir plaka üzerinde ek seyreltme adımları gerçekleştirilebilir.

Figure 1
Şekil 1: VSV-S-eGFP'nin iyileşen serum ile nötralizasyonunu gösteren protokol ana hatları. Kısaltmalar: VSV = veziküler stomatit virüsü; eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; COVID-19 = koronavirüs hastalığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: SARS-CoV-2'ye karşı piyasada bulunan nötralize edici antikor, negatif kontrol olarak IgG'nin yanında pozitif bir kontrol örneği olarak kullanılmıştır. Viral enfeksiyonu inhibe etmek için antikorları nötralize etme yeteneği değişecektir; seyreltme eğrisinin hangi konsantrasyona başlayacağını belirlemek için satın alınan spesifik antikor için mevcut bilgilere bakın (örnekler üç taraflı olarak çalıştırıldı, hata çubukları SD ± temsil ediyor). (A) Yüzde inhibisyon, (B) floresan görüntüleme yoluyla tespit edilen eGFP odaklarının sayısına göre hesaplanmıştır. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; IgG = immünoglobulin; SD = standart sapma; eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; RBD = reseptör bağlama etki alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Hastalardan iyileşen serumun VSV-S-eGFP'yi nötralize etme yeteneği semptomların şiddetine bağlı olarak değişir. Hasta serum örnekleri SARS-CoV-2 enfeksiyonu sonrası yaklaşık 3 ay, enfekte olmayan hastalardan kontrol örnekleri toplanarak (örnekler üç taraflı olarak çalıştırıldı, hata çubukları SD ± temsil ediyor). (A) Yüzde inhibisyon, (B) floresan görüntüleme yoluyla tespit edilen eGFP odaklarının sayısına göre hesaplanmıştır. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; SD = standart sapma; eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan yöntem, gerektiğinde farklı laboratuvar ortamlarına ve kaynaklarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Daha da önemlisi, bu protokolün ana sınırlaması, bir muhafaza düzeyi 2 alan ve doku kültürü başlığı için gerekliliktir. VSV-S-eGFP gibi SARS-CoV-2 ani yükselişi ile sözde çoğaltıcı bir RNA virüsünün uygulanması, kontrol altına alma seviyesi 3 çalışma alanı gerektiren SARS-CoV-2 virüsüne zorlu bir alternatiftir, ancak bazı gruplar için bir sınırlama olarak kalabilir. Burada açıklanan diğer tüm adımlar oldukça esnektir ve neredeyse herhangi bir muhafaza seviyesi 2 laboratuvarında gerçekleştirilebilir. Örneğin, otomatik sayım özelliğine sahip floresan görüntüleyicinin kullanılması gerekli değildir. Burada kullanılan 96 kuyu biçimi, mevcut en düşük hedefi (2x) kullanarak neredeyse tüm kuyuyu görüntülemek için yalnızca yaklaşık 4 görüş alanının gerekli olduğu anlamına gelir.

Her kuyunun birden fazla alanını görüntülemek için manuel bir floresan mikroskop kullanılabilir ve ImageJ (özgür yazılım) daha sonra eGFP odaklarını ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, mümkün olan en düşük serum hacmini kullanmak ve sarf malzemesi kullanımını minimumda tutmak için 96 kuyu formatını kullanmayı seçtik. Floresan mikroskop kullanılamıyorsa, bu protokol kristal mor fiksasyon ve boyamadan sonra plak oluşumunu tespit etmek için 6 veya 12 kuyu formatına kadar ölçeklendirilebilir (yukarıda açıklanan viral titer protokolüne benzer). Bu protokolü gerçekleştirirken akılda tutulması gereken en kritik husus VSV-S-eGFP'nin sıcaklık hassasiyetidir. VSV-S-eGFP ile çalışırken, birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için virüsü her zaman küçük hacimlerde aliquot ve mümkün olduğunda virüsü buzda tutun. Ek olarak, 24 saat sonra sağlam floresan sinyali tespit edilebilir; ancak enfeksiyon sonrası 20 ila 28 saat görüntülemeden sonra benzer sonuçlar elde ettik.

SARS-CoV-2'ye karşı antikorların varlığını tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır, altın standart enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) testi de dahil olmak üzere, S21 , 22'yekarşı toplam antikor miktarını ölçer. Burada, hastalardan iyileşen serumda immünodominant SARS-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları özellikle tespit etmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem özetledik. Psödovirüs enfeksiyonunun otomatik olarak ölçülmesiyle 24 saat içinde çok sayıda numunede nötralize edici antikorların tespit edilmesine izin veren ve nihai veri raporlarının hızlı bir şekilde geri dönüşünü sağlayan 96 kuyu formatına başarıyla uyum sağlayarak klasik plak azaltma nötralizasyon testini (PRNT) geliştirdik. Serum içindeki nötralize edici antikorları tespit etmenin yanı sıra, bu yöntem, viral girişi engellemek için monoklonal antikorlar, rekombinant çözünür hACE2 veya proteaz inhibitörleri gibi hACE2 ile SARS-CoV-2 spike protein etkileşimini doğrudan engellemeyi amaçlayan diğer terapötik stratejilerin yüksek verimli taramasını yapmak için uyarlanabilir23 . Birkaç SARS-CoV-2 spike protein varyantının ortaya çıkmasıyla, virüsün farklı varyantları ile enfeksiyonun ardından benzer nötralizasyon seviyelerinin oluşup oluşmadığını belirlemek için bu yöntemin uygulanabileceğini de belirtmek önemlidir24.

SARS-CoV-2'ye karşı antikorları tespit etmek için mevcut yöntemlerin diğer örnekleri arasında ELISA'lar, lentivirüs bazlı tahliller ve serum örneklerinin nötralizasyon kapasitesini değerlendirmek için ticari kitler sayilebilir. Yaygın olarak kullanılan IgM veya IgG bağlayıcı ELISA'lar, önceki enfeksiyonu veya bağışıklamayı izlemek için antikor konsantrasyonunun varlığını belirlemek için etkili bir yöntem olsa da, bağlayıcı antikorların nötralizasyon kapasitesini ayırt edemezler25. Sözde lentivirüs bazlı nötralizasyon tahlilleri, VSV-S-eGFP'nin çoğaltılmasının aksine çoğaltıcı olmayan viral parçacıklar kullanarak gelişmiş bir güvenlik profiline sahiptir; bununla birlikte, lentiviral titerler çok daha düşük olma eğiliminde olduğu için bu test kapasitesi açısından bir bariyer oluşturur26,27. Sars-CoV-2 spike proteininin (RBD özellikle RBD) iyileşen serum (örneğin, CUSABIO, GenScript, Abnova) ile inkübasyonu takiben hACE2 reseptörü ile bağlanması yoluyla antikorların enfeksiyonu engelleme yeteneğini ölçen piyasada bulunan birkaç kit vardır. Bu kitlerin çoğu saygın hassasiyete ve özgüllüke sahip olsa da, nispeten pahalı olma eğilimindedir ve bu nedenle büyük miktarda numune için ideal değildir. Burada sağlanan protokol hızlı, güvenilir ve ucuzdur. Bu yüksek aktarım hızı yöntemi, 24 saat içinde sağlam bir okuma elde ederek birçok örneği test etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların bu yayınla ilgili rakip finansal çıkarları bulunmamaktadır.

Acknowledgments

Whelan laboratuvarına, bu protokolde kullanılan VSV-S-eGFP virüsünü cömertçe sağladığı için teşekkür ederiz (Case ve ark. 2020'de açıklanmıştır). Ayrıca Dr. Bill Cameron ve Juthaporn Cowan'a (ve ekibine) hasta kan örneklerini (REB protokol kimliği 20200371-01H) topladıkları için teşekkür ederiz. Yazarlar, bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayımlanması için aşağıdaki finansal desteğin alındığını açıklamalıdır: Bu çalışma, Ottawa Hastanesi Vakfı'nın cömert desteği ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (#448323) bir hibe ve COVID-19 Bilimi için Thistledown Vakfı'ndan C.S.I. T.R.J.'e hızlı bir hibe ile finanse edilmektedir. JP bir küme Mitacs bursu tarafından finanse edilir. T.A. bir CIHR Banting Bursu tarafından finanse edilir. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Psödovirüs Nötralize edici antikor Veziküler stomatit virüsü Spike glikoprotein
Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter