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Immunology and Infection

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Abstract

Mentre la pandemia di COVID-19 causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua ad evolversi, è diventato evidente che la presenza di anticorpi neutralizzanti contro il virus può fornire protezione contro future infezioni. Pertanto, poiché la creazione e la traduzione di vaccini COVID-19 efficaci continua a una velocità senza precedenti, lo sviluppo di metodi rapidi ed efficaci per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 diventerà sempre più importante per determinare la protezione a lungo termine contro l'infezione sia per gli individui precedentemente infetti che per quelli immunizzati. Questo documento descrive un protocollo ad alto rendimento che utilizza il virus della stomatite vescicolare (VSV) pseudotipizzato con la proteina spike SARS-CoV-2 per misurare la presenza di anticorpi neutralizzanti nel siero convalescente di pazienti che sono recentemente guariti da COVID-19. L'uso di un virus pseudotipizzato replicante elimina la necessità di una struttura di livello di contenimento 3 necessaria per la gestione di SARS-CoV-2, rendendo questo protocollo accessibile praticamente a qualsiasi laboratorio di livello di contenimento 2. L'uso di un formato a 96 pozzedi consente di eseguire molti campioni contemporaneamente con un breve tempo di consegna di 24 ore.

Introduction

A dicembre 2019 è stato identificato un nuovo coronavirus, che ora conosciamo come SARS-CoV-2, l'agente eziologico della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 è un betacoronavirus appartenente alla famiglia Coronaviridae. Questi virus avvolti comprendono un ampio genoma di RNA a senso positivo e sono responsabili di infezioni respiratorie e intestinali sia nell'uomo che negli animali2. A partire da maggio 2021 ci sono stati più di 157 milioni di casi segnalati di COVID-19 a livello globale e oltre 3,2 milioni di decessi3. Lo sviluppo di un vaccino efficace è diventato l'obiettivo primario dei ricercatori di tutto il mondo con almeno 77 vaccini preclinici in fase di studio e 90 attualmente in fase di sperimentazione clinica4.

I coronavirus codificano quattro proteine strutturali tra cui la proteina spike (S), il nucleocapside (N), la proteina dell'involucro (E) e la proteina di membrana (M). L'ingresso di SARS-CoV-2 richiede l'interazione del dominio di legame del recettore (RBD) di S con il recettore dell'ospite, l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) e la successiva fusione di membrana a seguito della scissione proteolitica da parte della proteasi della serina cellulare dell'ospite, proteasi transmembrana serina2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . L'immunodominanza umorale della proteina S di SARS-CoV è stata precedentemente riportata ed è stata ora dimostrata anche per SARS-CoV-211,12,13. Infatti, le risposte anticorpali neutralizzanti contro S sono state rilevate nel siero convalescente da pazienti con SARS-CoV 24 mesi dopo l'infezione14, evidenziando il loro ruolo critico nella risposta immunitaria a lungo termine. La proteina S è stata identificata come un bersaglio vaccinale promettente ed è quindi diventata un componente chiave della maggior parte dei vaccini in fase di sviluppo15,16.

Mentre la rapida rilevazione di anticorpi neutralizzanti è un aspetto critico dello sviluppo del vaccino, può anche far luce sul tasso di infezione e sorveglianza siero-epidemiologica nelle aree colpite17. Un VSV competente per la replicazione pseudotipizzato con la glicoproteina SARS-CoV-2 S, al posto della glicoproteina VSV wild-type, per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 in contesti di livello di biosicurezza 2 è stato gentilmente donato da Whelan e colleghi18. Il vsV expressing spike (VSV-S) sarà utilizzato per determinare la risposta anticorpale neutralizzante contro la proteina spike SARS-CoV-2. Poiché il VSV-S utilizzato qui esprime anche una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), i focolai di eGFP possono essere rilevati entro 24 ore per quantificare l'infezione, mentre la formazione della placca può richiedere da 48 a 72 ore. Riassunto qui è un protocollo semplice ed efficace per determinare la capacità del siero del paziente convalescente di neutralizzare l'infezione da VSV-S-eGFP. Questo metodo può anche essere facilmente adattato per interrogare altre potenziali terapie che mirano a interrompere l'interazione ospite-virale della proteina SARS-CoV-2 S.

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Protocol

1. Cellule di placcatura (Giorno 1) per la produzione e la quantificazione dello pseudovirus SARS-CoV-2

  1. Preparazione per la coltura tissutale
    1. Warm 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (opzionale); e 0,25% di acido tetraacetico tripsina-etilendiammina (EDTA) a 37 °C a bagnomaria per circa 15 minuti.
    2. Disinfettare una cappa di coltura di tessuto con il 70% di etanolo e posizionare piatti di coltura tissutale, pipette Pasteur e pipette sierologiche nella cappa di coltura del tessuto, se necessario. Rimuovere PBS, DMEM e tripsina dal bagno d'acqua e disinfettare con etanolo al 70% prima di inserirli nella cappa di coltura del tessuto.
  2. Placcatura e manutenzione delle celle
    1. Coltiva cellule Vero E6 in DMEM (contenente il 10% di FBS) in palloni di coltura tissutale T75 o piatti di coltura tissutale da 15 cm in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Passare le cellule secondo necessità quando le cellule sono confluenti all'80-90%.
    2. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di 1x PBS a ciascun piatto e dondolando delicatamente 4-5 volte; aspirare il PBS. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA a ciascun piatto, scuotere la piastra per garantire che l'intera superficie sia coperta. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per circa 5 minuti, o fino a quando le cellule non si sono staccate.
    3. Aggiungere 7 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS) per disattivare la tripsina e risospentare le cellule tubando su e giù più volte. Abbassare le cellule per rimuovere la tripsina usando una centrifuga da banco a 500 × g per 5 minuti, aspirare il mezzo senza disturbare il pellet cellulare e risusciere le cellule in 10 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS). Se le cellule sono necessarie per esperimenti futuri, mettere 1 mL in un nuovo piatto contenente 15 mL di DMEM fresco (contenente il 10% di FBS).
    4. Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro e aggiungere circa 1 × 107 cellule a ciascuna piastra da 15 cm e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 fino a quando non sono confluenti al 100% (1-2 giorni).

2. Preparazione dello pseudovirus VSV-S-EGFP

  1. Infezione
    1. Infettare le cellule a molteplicità di infezione (MOI) 0,01 con il virus di riserva VSV-S-eGFP in 12 ml di DMEM senza siero per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2, occasionalmente facendo oscillare le piastre. Sostituire l'inoculo con DMEM fresco (contenente il 2% di FBS e 20 mM di HEPES, pH 7,7) e passare a un incubatore impostato a 34 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: per la propagazione di VSV-S-eGFP in coltura cellulare è necessaria una temperatura di 34 °C.
    2. Raccogliere supernatanti cellulari dopo l'osservazione di un esteso effetto citopatico (CPE) e distacco cellulare, circa 48 ore dopo l'infezione. Utilizzare un microscopio fluorescente per visualizzare l'ampia espressione di eGFP da parte di cellule infette a partire da 24 ore dopo l'infezione.
  2. Collezione
    1. Centrifugare i supernatanti utilizzando una centrifuga da banco per 5 minuti a 1.000 × g a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. Aliquotare il surnatante per evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento e conservare a -80 °C.

3. Titering dello pseudovirus VSV-S-eGFP

  1. Diluizione seriale per determinare il titolo virale
    1. Cellule Vero E6 a piastra su piastre a 6 pozzetti ad una densità di semina di 6 × 105 cellule per pozzetti in DMEM (con 10% FBS), e incubano durante la notte a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: è possibile utilizzare anche celle Vero che sovraesprimono TMPRSS2 e hACE2.
    2. Impostare una serie di diluizioni seriali 10 volte del virus VSV-S-eGFP in DMEM privo di siero freddo posizionando 900 μL di media in sette tubi di microcentrifuga. Tubi per etichette da 1 a 7. Aggiungere brevemente 100 μL di stock virale al primo tubo e vortice. Trasferire brevemente 100 μL di virus diluito dal tubo 1 al tubo 2 e vortice; proseguire fino al tubo 7.
    3. Aspirare il mezzo da tutti i pozzi della piastra a 6 pozzi contenente celle Vero E6 e sostituirlo con 500 μL di diluizioni da 10-2 a 10-7. Incubare le piastre per 45 min a 37 °C con il 5% di CO2,oscillando delicatamente ogni 15 min.
    4. Aspirare l'inoculo e sostituirlo con un overlay contenente una miscela 1:1 di 2x DMEM e 6% carbossimetilcellulosa (CMC), concentrazione finale del 3% CMC, integrata con 10% FBS; incubare a 34 °C con 5% di CO2 per 48 ore.
      NOTA: Preriscaldare la miscela di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti durante la fase di infezione. Una miscela 1:1 di agarose all'1% con 2x DMEM integrato con FBS al 10% può essere utilizzata al posto di CMC. Per sovrapporre con agarose, far bollire l'1% di acarosio (in dH2O) e mescolare con 2x DMEM freddo. Assicurarsi che la miscela sia a una temperatura adeguata prima di aggiungere al monostrato cellulare (circa 37-40 °C). Se l'acarosio viene utilizzato per la sovrapposizione, le cellule devono essere fissate incubando in 2 ml di metanolo 3:1: acido acetico per almeno un'ora prima della colorazione.
  2. Colorazione e calcolo del titolo virale
    1. Visualizza le placche colorando con viola cristallino o visualizzazione diretta di eGFP al microscopio fluorescente.
    2. Per macchiare le piastre, aspirare la sovrapposizione, lavare una volta con PBS, quindi aggiungere 2 ml di viola cristallo allo 0,1% (in metanolo all'80% e dH2O) a ciascun pozzo. Posizionare su un bilanciere a piastre per circa 20 minuti a temperatura ambiente prima della de-colorazione. Rimuovere il cristallo viola e lavare delicatamente ciascuno bene due volte usando dH2O o PBS.
      NOTA: le fasi di lavaggio e colorazione devono essere eseguite delicatamente mediante pipettaggio lento verso il lato di ciascun pozzo per garantire che il monostrato cellulare rimanga intatto durante tutta la procedura.
    3. Lasciare asciugare le piastre per almeno 1 ora prima di contare le placche. Assicurarsi che i conteggi delle placche siano ottenuti da pozzi contenenti da 20 a 200 placche. Per calcolare il titolo del virus in unità di formazione della placca (PFU) per ml, moltiplicare il fattore di diluizione del pozzo contato con il volume dell'infezione e dividere questo numero dalle placche presenti nel rispettivo pozzo.
      Equation 1

4. Cellule placcanti (Giorno 1) per la misurazione della neutralizzazione dello pseudovirus SARS-CoV-2 mediante anticorpi disponibili in commercio e siero per pazienti convalescenti

  1. Preparazione per la coltura tissutale
    1. Preparare il terreno di coltura e il cappuccio di coltura dei tessuti come descritto nel paragrafo 1. Inoltre, preparare il numero necessario di 96 piastre di pozzetti per ospitare un minimo di 2 repliche per campione (cioè 1 piastra per 6 campioni); aggiungere ulteriori repliche se il volume del campione lo consente.
  2. Placcatura e manutenzione delle celle
    1. Crescere e mantenere le cellule Vero E6 come descritto nel paragrafo 1. Preparare almeno 10 mL di sospensione cellulare per piastra a 96 pozzetti ad una concentrazione di 2 ×10 5 cellule per mL (piastra 1,5 ×10 5 cellule per mL per i saggi eseguiti dopo 48 ore, se necessario). Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzettino di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Mescolare bene la sospensione cellulare e scuotere delicatamente ogni piastra in tutte le direzioni per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.

5. Diluizioni e infezioni anticorpali o sieriche (Giorno 2)

NOTA: Questo protocollo può essere applicato per misurare la neutralizzazione di VSV-S-eGFP sia da anticorpi disponibili in commercio che dal siero del paziente, nonché dal siero raccolto dagli animali per studi di sviluppo pre-clinico del vaccino. *Prendere nota dei passaggi aggiuntivi elencati quando si maneggiano campioni di siero paziente/animale.

  1. Serie di diluizione seriale
    1. Prima di diluire i campioni di siero, inattivare termicamente ogni campione a bagnomaria a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento. Garantire che vengano prese le necessarie precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei campioni dei pazienti; Aprire i contenitori dei campioni solo quando si trovano nella cappa di coltura dei tessuti e garantire che siano indossati dispositivi di protezione individuale di livello 2 di contenimento appropriati.
    2. Impostare la serie di diluizione in una piastra vuota da 96 pozzi (Piastra 1).
    3. Iniziare tutte le diluizioni nella riga A della piastra a 96 pozzetti in 80 μL. *Per i campioni dei pazienti, iniziare la serie di diluizione a 1 su 10 posizionando 8 μL di siero in 72 μL di DMEM senza siero (con l'1% di penicillina/streptomicina).
      NOTA: La concentrazione di anticorpi neutralizzanti utilizzati dipenderà dall'attività prevista dal produttore. Per l'anticorpo neutralizzante SARS-CoV-2 Spike utilizzato qui (vedere la Tabella dei materiali),iniziare con 5 μg/mL per osservare almeno il 50% di neutralizzazione.
    4. Aggiungere 40 μL di DMEM senza siero (con 1% di penicillina/streptomicina) alle righe da B a G e 80 μL alla riga H. Non aggiungere virus alla riga H, in quanto funge da controllo solo cellulare.
    5. Utilizzando una pipetta multicanale a 12 pozzette, mescolare e trasferire 40 μL di siero diluito o anticorpo dalla riga A alla riga B. Mescolare e ripetere fino alla riga F, scartare 40 μL dalla riga F. Non aggiungere siero alla riga G in quanto rappresenta la riga di controllo solo virus.
  2. Infezione e sovrapposizione
    1. Preparare un volume appropriato di VSV-S-eGFP diluito per trattare ogni pozzo a MOI 0,05 (o 2000 pfu). (Quando si completa questo calcolo, tenere presente che solo 60 μL del volume totale di 80 μL verranno spostati sulle cellule; pertanto, assicurarsi di moltiplicare il volume del virus per 1,33 per mantenere 2000 pfu).
      NOTA: poiché VSV-S-eGFP è sensibile alla temperatura, assicurarsi che le scorte virali rimangano sul ghiaccio ogni volta che non sono in uso ed evitare più cicli di congelamento-disgelo poiché i titoli differiranno dopo ripetuti congelamenti.
    2. Aggiungere 40 μL di virus diluito a ciascun pozzetti nelle file da A a G della Piastra 1 e mescolare pipettando su e giù 4-5 volte. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2.
    3. Rimuovere la piastra contenente le cellule dall'incubatore (Piastra 2) e aspirare accuratamente il mezzo da tutti i pozzi. Trasferire 60 μL di miscela anticorpo/virus dalla Piastra 1 alla Piastra 2 e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2,facendo oscillare la piastra ogni 20 minuti.
    4. Completare ogni pozzetti con 140 μL di sovrapprezzo contenente CMC in DMEM per una concentrazione finale del 3% di CMC (con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina). Posizionare la Piastra 2 in un'incubatrice impostata a 34 °C con il 5% di CO2 per circa 24 ore prima dell'imaging.
      NOTA: Preriscaldare la miscela di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti durante la fase di infezione.

6. Imaging e quantificazione (Giorno 3)

  1. Piastre di immagine che utilizzano un imager fluorescente automatizzato (utilizzando un filtro isotiocianato di fluoresceina (FITC) o un filtro alternativo con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). Quantificare l'infezione virale creando un protocollo che identifica e conta automaticamente i singoli focolai eGFP. Se non è disponibile una funzione di conteggio automatico, utilizzare il software ImageJ per quantificare il numero di focolai eGFP.

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Representative Results

Questo protocollo delinea un metodo rapido ed efficace per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina SARS-CoV-2 S attraverso l'inibizione dell'infezione da pseudovirus VSV-S-eGFP (quantificabile dalla perdita di focolai eGFP rilevati). Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrata nella Figura 1. Si raccomanda di utilizzare un anticorpo disponibile in commercio come controllo positivo ogni volta che viene eseguito il test per garantire la coerenza del test. Qui, dimostriamo una curva di diluizione utilizzando un anticorpo IgG neutralizzante disponibile in commercio contro SARS-CoV-2 Spike RBD rispetto a un controllo IgG (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su entrambi gli anticorpi; Figura 2).

I campioni di pazienti convalescenti sono stati raccolti circa tre mesi dopo l'infezione da SARS-CoV-2 e la neutralizzazione dello pseudovirus è stata determinata utilizzando il metodo sopra descritto (Figura 3). È importante sottolineare che è stata osservata un'inibizione minima dello sfondo utilizzando siero di donatore sano. Inoltre, da notare, questo test distingue tra i pazienti con elevata gravità dei sintomi rispetto a quelli con malattia più lieve in base alla necessità di ricovero in ospedale. In linea con altri rapporti, abbiamo osservato all'interno della nostra piccola coorte che i pazienti ospedalizzati tendono a dimostrare una maggiore capacità neutralizzante rispetto a quelli che non hanno richiesto il ricovero in ospedale19,20. Anche se questo potrebbe non essere sempre il caso per i campioni di pazienti ospedalizzati rispetto a quelli non ospedalizzati, la capacità del test di differenziare vari gradi di neutralizzazione è una risorsa. Ci possono anche essere casi in cui la capacità neutralizzante del siero del paziente è molto più alta di quelle dimostrate qui. Se necessario, la diluizione iniziale del siero del paziente può essere regolata o ulteriori fasi di diluizione possono essere eseguite su una piastra aggiuntiva.

Figure 1
Figura 1: Schema del protocollo che dimostra la neutralizzazione di VSV-S-eGFP mediante siero convalescente. Abbreviazioni: VSV = virus della stomatite vescicolare; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; COVID-19 = malattia da coronavirus. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Un anticorpo neutralizzante disponibile in commercio contro SARS-CoV-2 è stato usato come esempio di controllo positivo insieme a IgG come controllo negativo. La capacità di neutralizzare gli anticorpi per inibire l'infezione virale varierà; fare riferimento alle informazioni disponibili per l'anticorpo specifico acquistato per determinare quale concentrazione iniziare la curva di diluizione (i campioni sono stati eseguiti in triplice copia, le barre di errore rappresentano ± SD). (A) L'inibizione percentuale è stata calcolata in base al numero di focolai eGFP rilevati tramite (B) imaging fluorescente. Abbreviazioni: SARS-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; IgG = immunoglobuline; SD = deviazione standard; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; RBD = dominio di legame del recettore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La capacità del siero convalescente dei pazienti di neutralizzare VSV-S-eGFP varia a seconda della gravità dei sintomi. I campioni di siero del paziente sono stati raccolti circa 3 mesi dopo l'infezione da SARS-CoV-2 e i campioni di controllo sono stati raccolti da pazienti non infetti (i campioni sono stati eseguiti in triplice copia, le barre di errore rappresentano ± SD). (A) L'inibizione percentuale è stata calcolata in base al numero di focolai eGFP rilevati tramite (B) imaging fluorescente. Abbreviazioni: SARS-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; SD = deviazione standard; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo qui descritto può essere adattato per adattarsi a diversi ambienti di laboratorio e risorse, se necessario. È importante sottolineare che la principale limitazione di questo protocollo è la necessità di uno spazio di livello 2 di contenimento e di una cappa di coltura tissutale. L'applicazione di un virus a RNA replicante pseudotipizzato con il picco SARS-CoV-2, come VSV-S-eGFP, è una formidabile alternativa al virus SARS-CoV-2, che richiede un'area di lavoro di livello 3 di contenimento, ma può rimanere una limitazione per alcuni gruppi. Tutti gli altri passaggi descritti qui sono abbastanza flessibili e possono essere eseguiti in quasi tutti i laboratori di livello di contenimento 2. Ad esempio, l'uso di un imager fluorescente con una funzione di conteggio automatico non è necessario. Il formato a 96 pozzi utilizzato qui significa che sono necessari solo circa 4 campi di visualizzazione per visualizzare quasi l'intero pozzo utilizzando l'obiettivo più basso disponibile (2x).

Un microscopio fluorescente manuale può essere utilizzato per l'immagine di più campi di ciascun pozzo, e ImageJ (software libero) può quindi essere utilizzato per quantificare i fuochi eGFP. Inoltre, abbiamo scelto di utilizzare il formato a 96 pozzette per utilizzare il volume più basso possibile di siero e mantenere al minimo l'utilizzo dei materiali di consumo. Se un microscopio fluorescente non è disponibile, questo protocollo può essere scalato fino a un formato a 6 o 12 pozzetto per rilevare la formazione di placche dopo la fissazione e la colorazione viola cristallina (simile al protocollo del titolo virale sopra descritto). La considerazione più critica da tenere a mente quando si esegue questo protocollo è la sensibilità alla temperatura di VSV-S-eGFP. Quando si lavora con VSV-S-eGFP, aliquotare sempre il virus in piccoli volumi per evitare più cicli di congelamento-disgelo e mantenere il virus sul ghiaccio quando possibile. Inoltre, un segnale fluorescente robusto può essere rilevato dopo 24 ore; tuttavia, abbiamo acquisito risultati simili dopo l'imaging a 20-28 ore dopo l'infezione.

Esistono diversi metodi disponibili per rilevare la presenza di anticorpi contro SARS-CoV-2, tra cui il test di immunoassorbinte enzimatico (ELISA) gold standard, che quantifica la quantità totale di anticorpi contro S21,22. Qui, abbiamo delineato un metodo rapido e affidabile per rilevare specificamente gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike immunodominante SARS-CoV-2 nel siero convalescente dei pazienti. Abbiamo migliorato il classico test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT) adattandoci con successo a un formato a 96 pozzette, che consente il rilevamento di anticorpi neutralizzanti in un gran numero di campioni entro 24 ore mediante quantificazione automatizzata dell'infezione da pseudovirus, consentendo una rapida inversione di tendenza dei rapporti sui dati finali. Oltre a rilevare gli anticorpi neutralizzanti all'interno del siero, questo metodo può essere adattato per eseguire uno screening ad alto rendimento di altre strategie terapeutiche, che mirano a inibire direttamente l'interazione della proteina spike SARS-CoV-2 con hACE2, come anticorpi monoclonali, hACE2 solubile ricombinante o inibitori della proteasi, per impedire l'ingresso virale23 . Con l'emergere di diverse varianti di proteina spike SARS-CoV-2, è anche importante notare che questo metodo può essere applicato per determinare se livelli di neutralizzazione simili si verificano in seguito all'infezione con diverse varianti del virus24.

Altri esempi di metodi disponibili per rilevare gli anticorpi contro SARS-CoV-2 includono ELISA, saggi basati su lentivirus e kit commerciali per valutare la capacità neutralizzante dei campioni di siero. Mentre gli ELISA IgM o IgG comunemente usati sono un metodo efficace per determinare la presenza di concentrazione di anticorpi per tracciare precedenti infezioni o immunizzazioni, non sono in grado di distinguere la capacità neutralizzante degli anticorpi leganti25. I saggi di neutralizzazione basati su lentivirus pseudotipizzati hanno un profilo di sicurezza migliorato, utilizzando particelle virali non replicanti anziché replicare VSV-S-eGFP; tuttavia, questo crea una barriera in termini di capacità di test in quanto i titoli lentivirali tendono ad essere molto più bassi26,27. Esistono diversi kit disponibili in commercio che misurano la capacità degli anticorpi di bloccare l'infezione attraverso l'inibizione competitiva della proteina spike SARS-CoV-2 (RBD in particolare) che si lega al recettore hACE2 dopo l'incubazione con siero convalescente (ad esempio, CUSABIO, GenScript, Abnova). Mentre molti di questi kit hanno sensibilità e specificità affidabili, tendono anche ad essere relativamente costosi e quindi non ideali per un grande volume di campioni. Il protocollo fornito qui è veloce, affidabile e poco costoso. Questo metodo ad alta produttività può essere utilizzato per testare molti campioni, ottenendo una lettura robusta entro 24 ore.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti relativi a questa pubblicazione.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il laboratorio Whelan per aver generosamente fornito il virus VSV-S-eGFP utilizzato in questo protocollo (descritto in Case et al. 2020). Ringraziamo anche i dottori Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e il team) per aver raccolto i campioni di sangue del paziente (ID protocollo REB 20200371-01H). Gli autori rivelano di aver ricevuto il seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e / o la pubblicazione di questo articolo: Questo lavoro è stato finanziato dal generoso sostegno della Ottawa Hospital Foundation e una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research (# 448323) e una sovvenzione veloce dalla fondazione Thistledown per la scienza COVID-19 a C.S.I. T.R.J. è finanziata da una borsa di studio per laureati dell'Ontario e da una borsa di studio Mitacs del cluster. JP è finanziato da una borsa di studio Del cluster Mitacs. T.A. è finanziato da una CIHR Banting Fellowship. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
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Immunologia e infezione Numero 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovirus Anticorpo neutralizzante Virus della stomatite vescicolare Glicoproteina spike
Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus
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Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

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