Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Den protokol, der er beskrevet her skitserer en hurtig og effektiv metode til måling neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 spike protein ved at evaluere evnen af rekonvalescerende serum prøver til at hæmme infektion med en forbedret grøn fluorescerende protein-mærket vesikulær stomatitis virus pseudotypeeret med spike glycoprotein.

Abstract

I takt med at COVID-19-pandemien forårsaget af alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsætter med at udvikle sig, er det blevet tydeligt, at tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer mod virusset kan give beskyttelse mod fremtidig infektion. Efterhånden som oprettelsen og oversættelsen af effektive COVID-19-vacciner fortsætter med et hidtil uset tempo, vil udviklingen af hurtige og effektive metoder til måling af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 blive stadig vigtigere for at bestemme langsigtet beskyttelse mod infektion for både tidligere smittede og immuniserede individer. Dette papir beskriver en protokol med høj gennemløb ved hjælp af vesikulær stomatitisvirus (VSV), der er pseudotypen med SARS-CoV-2 spikeproteinet for at måle tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer i rekonvalescent serum fra patienter, der for nylig er kommet sig efter COVID-19. Brugen af en replikerende pseudotypevirus eliminerer behovet for en indeslutningsniveau 3-facilitet, der kræves til SARS-CoV-2-håndtering, hvilket gør denne protokol tilgængelig for stort set ethvert indeslutningsniveau 2-laboratorium. Brugen af et 96-brønds format gør det muligt at køre mange prøver på samme tid med en kort ekspeditionstid på 24 timer.

Introduction

I december 2019 blev der konstateret en ny coronavirus, som vi nu kender som SARS-CoV-2, der er årsagsmidlet til coronavirussen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er en betacoronavirus, der tilhører Coronaviridae-familien. Disse indhyllede vira omfatter et stort RNA-genom med positiv sans og er ansvarlige for luft- og tarminfektioner hos både mennesker og dyr2. I maj 2021 har der været mere end 157 millioner rapporterede tilfælde af covid-19 globalt og mere end 3,2 millioner dødsfald3. Udviklingen af en effektiv vaccine er blevet det primære mål for forskere over hele kloden med mindst 77 prækliniske vacciner under undersøgelse og 90 i øjeblikket gennemgår kliniske forsøg4.

Coronavirusser koder fire strukturelle proteiner, herunder spikeproteinet (S), nukleocapsid (N), konvolutprotein (E) og membranproteinet (M). Indtastning af SARS-CoV-2 kræver interaktion mellem det receptorbindende domæne (RBD) i S med værtsreceptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og efterfølgende membranfusion efter proteolytisk kavalergang ved værts cellulær serineprotease, transmembran protease serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humoristisk immundominanceans af S-proteinet af SARS-CoV er tidligere blevet rapporteret og er nu også blevet vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk er neutraliserende antistofresponser mod S blevet påvist i rekonvalescent serum fra SARS-CoV-patienter 24 måneder efter infektion14, hvilket fremhæver deres kritiske rolle i det langsigtede immunrespons. S-proteinet er blevet identificeret som et lovende vaccinemål og er således blevet en nøglekomponent i de fleste vacciner under udvikling15,16.

Mens den hurtige påvisning af neutraliserende antistoffer er et kritisk aspekt af vaccineudviklingen, kan det også kaste lys over infektionsraten og sero-epidemiologisk overvågning i påvirkede områder17. En replikation-kompetent VSV pseudotyped med SARS-CoV-2 S glycoprotein, i stedet for den vilde type VSV glycoprotein, at studere SARS-CoV-2 infektion i biosikkerhed niveau 2 indstillinger blev venligt doneret af Whelan og kolleger18. VSV udtrykke spike (VSV-S) vil blive udnyttet til at bestemme neutralisere antistofrespons mod SARS-CoV-2 spike protein. Da VSV-S, der anvendes her, også udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP foci påvises inden for 24 timer for at kvantificere infektion, mens plaquedannelse kan tage 48 til 72 timer. Sammenfattet her er en enkel og effektiv protokol til at bestemme evnen til rekonvalescent patient serum til at neutralisere VSV-S-eGFP infektion. Denne metode kan også let tilpasses til at afhøre andre potentielle terapeutiske midler, der har til formål at forstyrre værts-viral interaktion af SARS-CoV-2 S protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Platingceller (dag 1) til produktion og kvantificering af SARS-CoV-2 pseudovirus

  1. Forberedelse til vævskultur
    1. Varm 1x Dulbeccos fosfat-buffered saltvand (DPBS); Dulbeccos Modificerede Eagle Medium (DMEM), der indeholder 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (valgfrit); og 0,25 % trypsin-ethylendiamin tetraacetsyre (EDTA) til 37 °C i et vandbad i ca. 15 min.
    2. Desinficer en vævskultur hætte med 70% ethanol, og læg vævskultur retter, Pasteur pipetter, og serologiske pipetter i væv kultur hætte efter behov. Fjern PBS, DMEM, og trypsin fra vandbadet, og desinficere med 70% ethanol, før du placerer i vævskultur hætten.
  2. Plating og vedligeholdelse af celler
    1. Knyt Vero E6-celler i DMEM (indeholdende 10 % FBS) i T75-vævskulturflasker eller 15 cm vævskulturretter i en 37 °C-inkubator med 5 % CO2. Passage cellerne efter behov, når cellerne er 80-90% sammenløb.
    2. Vask cellerne ved at tilføje 10 mL 1x PBS til hver skål og forsigtigt vuggende 4-5 gange; aspirere PBS. Tilsæt 3 mL trypsin-EDTA til hver skål, rock pladen for at sikre, at hele overfladen er dækket. Inkuberes cellerne ved 37 °C med 5 % CO2 i ca. 5 min, eller indtil cellerne er løsnet.
    3. Tilsæt 7 mL DMEM (indeholdende 10% FBS) for at deaktivere trypsinen og genbruge cellerne ved at pipetter op og ned flere gange. Drej cellerne ned for at fjerne trypsin ved hjælp af en benchtop centrifuge ved 500 × g i 5 min, aspirere medierne uden at forstyrre cellepillen, og genbruge cellerne i 10 mL AF DMEM (indeholdende 10% FBS). Hvis der er behov for celler til fremtidige forsøg, skal du placere 1 mL i en ny skål, der indeholder 15 mL frisk DMEM (indeholdende 10% FBS).
    4. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller eller hæmocytometer, og tilsæt ca. 1 × 107 celler til hver 15 cm plade, og inkuber ved 37 °C med 5% CO2, indtil de er 100% sammenflydende (1-2 dage).

2. VSV-S-EGFP pseudoviruspræparat

  1. Infektion
    1. Inrmitér celler ved multiplicitet af infektion (MOI) 0,01 med VSV-S-eGFP lagervirus i 12 mL serumfri DMEM i 1 time ved 37 °C med 5% CO2, lejlighedsvis vuggende pladerne. Inoculum udskiftes med frisk DMEM (indeholdende 2% FBS og 20 mM HEPES, pH 7.7), og flyt til en inkubator indstillet til 34 °C med 5% CO2.
      BEMÆRK: Der kræves en temperatur på 34 °C til udbredelse af VSV-S-eGFP i cellekulturen.
    2. Saml celle supernatants ved observation af omfattende cytopatisk effekt (CPE) og celle løsrivelse, ca 48 timer efter infektion. Brug et fluorescerende mikroskop til at visualisere det omfattende udtryk af eGFP af inficerede celler, der starter ved 24 timer efter infektion.
  2. Samling
    1. Centrifugere supernatanterne ved hjælp af en bænk centrifuge i 5 min ved 1.000 × g ved 4 °C for at fjerne cellerester. Aliquot supernatanten for at undgå flere fryse-optøningscyklusser og opbevares ved -80 °C.

3. Titering af VSV-S-eGFP pseudovirus

  1. Seriel fortynding til bestemmelse af viral titer
    1. Plade Vero E6-celler på 6-brøndsplader ved en såningstæthed på 6 × 105 celler pr. brønd i DMEM (med 10% FBS) og inkuberes natten over ved 37 °C med 5 % CO2.
      BEMÆRK: Veroceller, der overekspresser TMPRSS2 og hACE2, kan også bruges.
    2. Opsætning af en 10-fold serie af VSV-S-eGFP-virus i kold serumfri DMEM ved at placere 900 μL medier i syv mikrocentrifugerør. Etiketrør fra 1 til 7. Tilsættes 100 μL af virusbestanden til det første rør og vortex kort. Der overføres kortvarigt 100 μL fortyndet virus fra rør 1 til rør 2 og hvirvler; fortsætte indtil rør 7.
    3. Aspirere mediet fra alle brønde af 6-brøndspladen, der indeholder Vero E6-celler, og udskift med 500 μL fortyndinger 10-2 til 10-7. Inkuberes pladerne i 45 min ved 37 °C med 5% CO2, forsigtigt vuggende hver 15 min.
    4. Aspirere inoculum og erstatte med overlay indeholder en 1:1 blanding af 2x DMEM og 6% carboxymethyl cellulose (CMC), endelig koncentration på 3% CMC, suppleret med 10% FBS; ved 34 °C med 5 % CO2 i 48 timer.
      BEMÆRK: Forvarm overlejringsblandingen i et 37 °C vandbad i 15 min under infektionstrinnet. En 1:1 blanding af 1% agarose med 2x DMEM suppleret med 10% FBS kan anvendes i stedet for CMC. For at overlejre med agarose koges 1% agarose (i dH2O) og blandes med kold 2x DMEM. Sørg for, at blandingen er en passende temperatur, før du tilføjer til cellemonomeren (ca. 37-40 °C). Hvis der anvendes agarose til overlejringen, skal cellerne fastgøres ved at inkubere i 2 ml 3:1 methanol:eddikesyre i mindst en time før farvning.
  2. Farvning og beregning af viral titer
    1. Visualiser plaques ved farvning med krystal violet eller direkte visualisering af eGFP under et fluorescerende mikroskop.
    2. For at plette plader, aspirere overlejringen, vask en gang med PBS, tilsæt derefter 2 mL 0,1% krystal violet (i 80% methanol og dH2O) til hver brønd. Placer på en plade rocker i ca 20 minutter ved stuetemperatur før de-farvning. Fjern krystal violet, og vask forsigtigt hver brønd to gange ved hjælp af dH2O eller PBS.
      BEMÆRK: Vaske- og farvningstrin skal udføres forsigtigt ved at pipetter langsomt mod siden af hver brønd for at sikre, at cellemonomeren forbliver intakt under hele proceduren.
    3. Lad pladerne tørre i mindst 1 time, før der tælles plaques. Sørg for, at plaktællinger er fremstillet af brønde, der indeholder 20 til 200 plaques. For at beregne virusets titer i plaquedannende enheder (PFU) pr. ML, multiplicere fortyndingsfaktoren for de godt optalte med infektionsvolumen og dividere dette tal fra de plaques, der er til stede i den respektive brønd.
      Equation 1

4. Platingceller (dag 1) til måling af neutralisering af SARS-CoV-2 pseudovirus ved kommercielt tilgængelige antistoffer og rekonvalescentpatientserum

  1. Forberedelse til vævskultur
    1. Forbered medium og væv kultur hætte som beskrevet i afsnit 1. Derudover skal der forberedes det nødvendige antal 96 brøndplader, så der er plads til mindst 2 gentagelser pr. prøve (dvs. 1 plade pr. 6 prøver); tilføje yderligere replikeringer, hvis prøvevolumen tillader det.
  2. Plating og vedligeholdelse af celler
    1. Vokse og vedligeholde Vero E6 celler som beskrevet i afsnit 1. Der fremstilles mindst 10 mL celleaffjedring pr. 96-brøndplade i en koncentration på 2 × 105 celler pr. minut (plade 1,5 × 105 celler pr. minut til analyser udført efter 48 timer, hvis det er nødvendigt). Der tilsættes 100 μL celleaffjedring til hver brønd af en 96-brønds plade ved hjælp af en multikanalpipette, og inkuber i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
      BEMÆRK: Bland celleaffjedringen godt, og rock hver plade forsigtigt i alle retninger for at sikre jævn fordeling af celler.

5. Antistof- eller serumfortyndinger og infektioner (dag 2)

BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes til at måle neutralisering af VSV-S-eGFP ved både kommercielt tilgængelige antistoffer og patientserum samt serum indsamlet fra dyr til prækliniske vaccineudviklingsundersøgelser. *Vær opmærksom på de yderligere trin, der er anført ved håndtering af patienter/dyreserumprøver.

  1. Seriel fortyndingsserie
    1. Før de fortynder serumprøver, skal hver prøve opvarmes i et 56 °C-vandbad i 30 minutter for at inaktivere komplement. Sørg for, at der træffes de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af patientprøver. kun åbne prøvebeholdere, når de er i vævskulturhætten, og sikre, at der bæres passende indeslutningsniveau 2 personlige værnemidler.
    2. Opsæt fortyndingsserien i en tom 96-brøndsplade (plade 1).
    3. Begynd alle fortyndinger i række A af 96-brøndpladen i 80 μL. *For patientprøver skal fortyndingsserien påbegyndes ved 1 ud af 10 ved at placere 8 μL serum i 72 μL serumfri DMEM (med 1% penicillin/streptomycin).
      BEMÆRK: Koncentrationen af neutraliserende antistof, der anvendes, vil afhænge af den aktivitet, som producenten forudsagde. For sars-CoV-2 Spike neutraliserende antistof, der anvendes her (se tabellen over materialer),skal du starte med 5 μg/mL for at observere mindst 50% neutralisering.
    4. Der tilsættes 40 μL serumfri DMEM (med 1% penicillin/streptomycin) til række B til G og 80 μL til række H. Føj ikke virus til række H, da det fungerer som et kontrolelement, der kun er for celler.
    5. Ved hjælp af en 12-brønd multikanal pipette blandes og overføres 40 μL fortyndet serum eller antistof fra række A til række B. Bland og gentag indtil række F, kassér 40 μL fra række F. Føj ikke serum til række G, da det repræsenterer kontrolrækken, der kun er virus.
  2. Infektion og overlejring
    1. Der fremstilles en passende mængde fortyndet VSV-S-eGFP til behandling af hver brønd ved MOI 0,05 (eller 2000 pfu). (Når du udfylder denne beregning, skal du huske på, at kun 60 μL af det samlede 80 μL-volumen vil blive flyttet til cellerne.
      BEMÆRK: Da VSV-S-eGFP er temperaturfølsom, skal du sikre, at virusbestandene forbliver på is, når de ikke er i brug, og undgå flere fryse-optøningscyklusser, da titere vil afvige efter gentagen frysning.
    2. Tilsæt 40 μL fortyndet virus til hver brønd i række A til G af plade 1 og bland ved pipetter op og ned 4-5 gange. Inkuberes pladen i 1 time ved 37 °C med 5% CO2.
    3. Fjern pladen, der indeholder celler fra inkubatoren (Plade 2), og gsugning forsigtigt mediet fra alle brønde. Overfør 60 μL antistof/virusblanding fra plade 1 til plade 2, og inkuber i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2, rokkende pladen hvert 20. minut.
    4. Fyld hver brønd op med 140 μL overlay indeholdende CMC i DMEM for en endelig koncentration på 3% CMC (med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin). Placer plade 2 i en inkubator indstillet til 34 °C med 5 % CO2 i ca. 24 timer før billeddannelse.
      BEMÆRK: Forvarm overlejringsblandingen i et 37 °C vandbad i 15 min under infektionstrinnet.

6. Billedbehandling og kvantificering (dag 3)

  1. Billedplader ved hjælp af en automatiseret fluorescerende billedtør (ved hjælp af et fluorescein isothiocyanatfilter (FITC) eller et alternativt filter med en excitationsbølgelængde på 488 nm). Kvantificer virusinfektion ved at oprette en protokol, der automatisk identificerer og tæller individuelle eGFP foci. Hvis en automatisk optællingsfunktion ikke er tilgængelig, skal du bruge ImageJ-software til at kvantificere antallet af eGFP foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol skitserer en hurtig og effektiv metode til påvisning af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 S protein via hæmning af VSV-S-eGFP pseudovirusinfektion (kvantificerbar ved tab af eGFP foci opdaget). En skematisk repræsentation af protokollen er afbildet i figur 1. Det anbefales, at et kommercielt tilgængeligt antistof anvendes som en positiv kontrol, hver gang analysen køres for at sikre konsistensen af analysen. Her demonstrerer vi en fortyndingskurve ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt neutraliserende IgG-antistof mod SARS-CoV-2 Spike RBD sammenlignet med en IgG-kontrol (se Materialetabellen for detaljer om begge antistoffer; Figur 2.

Rekonvalescentpatientprøver blev indsamlet ca. tre måneder efter SARS-CoV-2-infektion, og pseudovirusneutralisering blev bestemt ved hjælp af den metode, der er beskrevet ovenfor (Figur 3). Det er vigtigt, at der blev observeret minimal baggrundshæmning ved hjælp af sundt donorserum. Desuden, af note, denne analyse skelner mellem patienter med høj symptom sværhedsgrad versus dem med mildere sygdom baseret på behovet for hospitalsindlæggelse. I overensstemmelse med andre rapporter har vi observeret i vores lille kohorte, at indlagte patienter har tendens til at demonstrere øget neutraliserende kapacitet end dem, der ikke krævede indlæggelse19,20. Selv om dette ikke altid kan være tilfældet for indlagt versus ikke-indlagte patientprøver, evnen til analysen til at differentiere varierende grader af neutralisering er et aktiv. Der kan også være tilfælde, hvor patientens serums neutraliserende evne er meget højere end dem, der er påvist her. Om nødvendigt kan startfortyndingen af patientserum justeres, eller der kan udføres yderligere fortyndingstrin på en ekstra plade.

Figure 1
Figur 1: Protokoludformning, der viser neutralisering af VSV-S-eGFP ved rekonvalescent serum. Forkortelser: VSV = vesikulær stomatitisvirus; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein COVID-19 = coronavirussen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Et kommercielt tilgængeligt neutraliserende antistof mod SARS-CoV-2 er blevet brugt som eksempel på en positiv kontrol sammen med IgG som en negativ kontrol. Evnen til at neutralisere antistoffer til at hæmme virusinfektion vil variere; henviser til de oplysninger, der er tilgængelige for det specifikke antistof, der er købt for at bestemme, hvilken koncentration fortyndingskurven skal påbegyndes (prøverne blev kørt i tredotel, fejllinjer repræsenterer ± SD). (A) Procent hæmning er beregnet på grundlag af antallet af eGFP foci opdaget via (B) fluorescerende billeddannelse. Forkortelser: SARS-CoV-2 = svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2; IgG = immunoglobulin; SD = standardafvigelse; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein RBD = receptorbindende domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Rekonvalescent serum fra patienter til at neutralisere VSV-S-eGFP varierer afhængigt af sværhedsgraden af symptomer. Patient serumprøver blev indsamlet ca. 3 måneder efter SARS-CoV-2-infektion, og der blev indsamlet kontrolprøver fra ikke-inficerede patienter (prøver blev kørt i tredotel, fejlbarer repræsenterer ± SD). (A) Procent hæmning er beregnet på grundlag af antallet af eGFP foci opdaget via (B) fluorescerende billeddannelse. Forkortelser: SARS-CoV-2 = svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2; SD = standardafvigelse; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode, der er beskrevet her, kan tilpasses til forskellige laboratoriemiljøer og ressourcer efter behov. Vigtigere, den vigtigste begrænsning af denne protokol er nødvendigheden af en indeslutning niveau 2 rum-og væv kultur hætte. Anvendelsen af en replikerende RNA-virus, der er pseudotype med SARS-CoV-2-spiken, såsom VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-virus, som kræver et indeslutningsniveau 3-arbejdsområde, men kan forblive en begrænsning for nogle grupper. Alle andre trin, der er beskrevet her, er ret fleksible og kan udføres i næsten ethvert indeslutningsniveau 2 lab. For eksempel er brugen af en fluorescerende billedtør med en automatiseret tællefunktion ikke nødvendig. Det 96-brøndsformat, der bruges her, betyder, at der kun kræves ca. 4 synsfelter for at afbilde næsten hele brønden ved hjælp af det laveste tilgængelige mål (2x).

En manuel fluorescerende mikroskop kan bruges til at afbilde flere felter af hver brønd, og ImageJ (fri software) kan derefter bruges til at kvantificere eGFP foci. Derudover har vi valgt at bruge 96-brønd-formatet til at bruge den lavest mulige mængde serum samt holde forbrugsforbruget på et minimum. Hvis et fluorescerende mikroskop ikke er tilgængeligt, kan denne protokol skaleres op til et 6- eller 12-brønds format for at detektere plakdannelse efter krystal violet fiksering og farvning (svarende til den virale titer protokol beskrevet ovenfor). Den mest kritiske overvejelse at huske på, når du udfører denne protokol, er vsv-S-eGFP's temperaturfølsomhed. Når du arbejder med VSV-S-eGFP, altid aliquot virus i små mængder for at undgå flere fryse-optø cykler, og holde virus på is, når det er muligt. Derudover kan der påvises et robust fluorescerende signal efter 24 timer. vi har dog opnået lignende resultater efter billeddannelse ved 20 til 28 timer efter infektion.

Der findes flere metoder til at påvise tilstedeværelsen af antistoffer mod SARS-CoV-2, herunder den guldstandardetenzymrelaterede immunosorbentanalyse (ELISA), som kvantificerer den samlede mængde antistoffer mod S21,22. Her har vi skitseret en hurtig og pålidelig metode til specifikt at opdage neutraliserende antistoffer mod det immunodominante SARS-CoV-2 spikeprotein i rekonvalescerende serum fra patienter. Vi har forbedret den klassiske plaque-reduktion neutralisering test (PRNT) ved med succes at tilpasse sig en 96-brønd format, som giver mulighed for påvisning af neutraliserende antistoffer i et stort antal prøver inden for 24 timer ved automatiseret kvantificering af pseudovirus infektion, giver mulighed for hurtig vending af endelige datarapporter. Ud over at opdage neutraliserende antistoffer inden for serum kan denne metode tilpasses til at udføre screening med høj kapacitetsafvisning af andre terapeutiske strategier, som har til formål direkte at hæmme SARS-CoV-2 spikeproteininteraktionen med hACE2, såsom monoklonale antistoffer, rekombinantopløselige hACE2 eller proteasehæmmere for at hindre viral indrejse23 . Med fremkomsten af flere SARS-CoV-2 spike protein varianter, Er det også vigtigt at bemærke, at denne metode kan anvendes til at afgøre, om lignende neutralisering niveauer opstår efter infektion med forskellige varianter af virus24.

Andre eksempler på tilgængelige metoder til at opdage antistoffer mod SARS-CoV-2 omfatter ELISA'er, lentivirus-baserede analyser og kommercielle kits til at vurdere den neutraliserende kapacitet af serumprøver. Mens de almindeligt anvendte IgM- eller IgG-bindende ELISAs er en effektiv metode til at bestemme tilstedeværelsen af antistofkoncentration til at spore tidligere infektion eller immunisering, er de ikke i stand til at skelne mellem de bindende antistoffers neutraliserende kapacitet25. Pseudotypeerede lentivirusbaserede neutraliseringsanalyser har en forbedret sikkerhedsprofil ved at bruge ikke-replikative viruspartikler i modsætning til at replikere VSV-S-eGFP; dette skaber dog en barriere med hensyn til testkapacitet, da lentiviral titere har tendens til at være meget lavere26,27. Der er flere kommercielt tilgængelige kits, der måler antistoffernes evne til at blokere infektion via konkurrencedygtig hæmning af SARS-CoV-2 spikeproteinet (RBD specifikt) binding med hACE2-receptoren efter inkubation med rekonvalescerende serum (f.eks. CUSABIO, GenScript, Abnova). Mens mange af disse kits har velrenommeret følsomhed og specificitet, de har også tendens til at være relativt dyre og derfor ikke ideel til en stor mængde prøver. Protokollen her er hurtig, pålidelig og billig. Denne metode med høj gennemløb kan anvendes til at teste mange prøver og opnå en robust udlæsning inden for 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser i forbindelse med denne publikation.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Whelan-laboratoriet for generøst at levere VSV-S-eGFP-virus, der anvendes i denne protokol (beskrevet i sag et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for at indsamle patientens blodprøver (REB protokol ID 20200371-01H). Forfatterne afslører modtagelsen af følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskab og / eller offentliggørelse af denne artikel: Dette arbejde blev finansieret af den generøse støtte fra Ottawa Hospital Foundation og et tilskud fra canadian Institutes of Health Research (# 448323) og et Fast Grant fra Thistledown foundation for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansieret af et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs stipendium. JP er finansieret af en klynge Mitacs stipendium. T.A. er finansieret af en CIHR Banting Fellowship. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

Immunologi og infektion Udgave 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovirus Neutraliserende antistof Vesikulær stomatitisvirus Spike glycoprotein
Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter