Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Протокол, описанный здесь, описывает быстрый и эффективный метод измерения нейтрализующих антител против спайкового белка SARS-CoV-2 путем оценки способности реконвалесцентных образцов сыворотки ингибировать инфекцию усиленным зеленым флуоресцентным белком меченым вирусом везикулярного стоматита, псевдотипизированным с шиповым гликопротеином.

Abstract

Поскольку пандемия COVID-19, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), продолжает развиваться, стало очевидно, что наличие нейтрализующих антител против вируса может обеспечить защиту от будущей инфекции. Таким образом, поскольку создание и трансляция эффективных вакцин против COVID-19 продолжается с беспрецедентной скоростью, разработка быстрых и эффективных методов измерения нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 будет становиться все более важной для определения долгосрочной защиты от инфекции как для ранее инфицированных, так и для иммунизированных лиц. В этой статье описывается высокопроизводительный протокол с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV), псевдотипизированного с шиповым белком SARS-CoV-2, для измерения наличия нейтрализующих антител в реконвалесцентной сыворотке у пациентов, которые недавно выздоровели от COVID-19. Использование реплицируемого псевдотипного вируса устраняет необходимость в объекте сдерживания уровня 3, необходимом для обработки SARS-CoV-2, что делает этот протокол доступным практически для любой лаборатории уровня сдерживания 2. Использование формата 96 скважин позволяет одновременно запускать множество образцов с коротким временем обработки 24 ч.

Introduction

В декабре 2019 года был выявлен новый коронавирус, который мы теперь знаем как SARS-CoV-2, возбудитель коронавирусной болезни 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 — бетакоронавирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae. Эти вирусы в оболочке содержат большой геном РНК с положительным смыслом и ответственны за респираторные и кишечные инфекции как у людей, так и уживотных2. По состоянию на май 2021 года во всем мире зарегистрировано более 157 миллионов случаев COVID-19 и более 3,2 миллиона смертей3. Разработка эффективной вакцины стала основной целью исследователей по всему миру, по крайней мере, 77 доклинических вакцин находятся в стадии исследования и 90 в настоящее время проходят клинические испытания4.

Коронавирусы кодируют четыре структурных белка, включая спайк-белок (S), нуклеокапсид (N), белок оболочки (E) и мембранный белок (M). Вступление SARS-CoV-2 требует взаимодействия рецептор-связывающего домена (RBD) S с рецептором хозяина, человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) и последующим слиянием мембран после протеолитического расщепления клеточной сериновой протеазой хозяина, трансмембранной протеазой серином 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Гуморальная иммунодоминальность S-белка SARS-CoV была ранее сообщена и теперь показана также для SARS-CoV-211,12,13. Действительно, нейтрализующие реакции антител против S были обнаружены у выздоравливающих сывороток пациентов с SARS-CoV через 24 месяца после заражения14,что подчеркивает их критическую роль в долгосрочном иммунном ответе. Белок S был идентифицирован как перспективная мишень для вакцин и, таким образом, стал ключевым компонентом большинства разрабатываемых вакцин15,16.

Хотя быстрое выявление нейтрализующих антител является критическим аспектом разработки вакцины, оно может также пролить свет на уровень инфицирования и сероэпидемиологический надзор в затронутых районах17. Компетентный к репликации VSV псевдотипизированный с гликопротеином SARS-CoV-2 S вместо гликопротеина VSV дикого типа для изучения инфекции SARS-CoV-2 в условиях биобезопасности уровня 2 был любезно пожертвован Уиланом и его коллегами18. VSV-экспрессирующий спайк (VSV-S) будет использоваться для определения нейтрализующего ответа антител против спайкового белка SARS-CoV-2. Поскольку VSV-S, используемый здесь, также экспрессирует усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), очаги eGFP могут быть обнаружены в течение 24 ч для количественной оценки инфекции, тогда как образование бляшек может занять от 48 до 72 ч. Здесь обобщен простой и эффективный протокол определения способности выздоравливающей сыворотки пациента нейтрализовать инфекцию VSV-S-eGFP. Этот метод также может быть легко адаптирован для опроса других потенциальных терапевтических средств, которые направлены на нарушение взаимодействия хозяина с вирусом белка SARS-CoV-2 S.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Покрывающие клетки (День 1) для производства и количественной оценки псевдовируса SARS-CoV-2

  1. Подготовка к посеву тканей
    1. Теплый 1x фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS); Модифицированная орлиная среда (DMEM) от Dulbecco, содержащая 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/ стрептомицина (необязательно); и 0,25% трипсин-этилендиаминтрубтеановой кислоты (ЭДТА) до 37 °C на водяной бане в течение приблизительно 15 мин.
    2. Продезинфицируйте вытяжку для культивирование тканей 70% этанолом и поместите посуду для культивирование тканей, пипетки Пастера и серологические пипетки в вытяжку для культивирование тканей по мере необходимости. Удалите PBS, DMEM и трипсин с водяной бани и продезинфицируйте 70% этанолом перед помещением в вытяжку для культивации тканей.
  2. Покрытие и обслуживание ячеек
    1. Выращивайте клетки Vero E6 в DMEM (содержащих 10% FBS) в колбах для культуры тканей T75 или 15 см тканевых культур в инкубаторе с 37 °C с 5% CO2. Прохождение клеток по мере необходимости, когда клетки на 80-90% сливаются.
    2. Промыть ячейки, добавив в каждую посуду по 1 мл 1x PBS и осторожно покачивая 4-5 раз; аспирировать PBS. Добавьте 3 мл трипсина-ЭДТА в каждое блюдо, покачайте пластину, чтобы вся поверхность была покрыта. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2 в течение приблизительно 5 мин или до тех пор, пока клетки не отделятся.
    3. Добавьте 7 мл DMEM (содержащего 10% FBS) для деактивации трипсина и повторно суспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Раскрутите клетки, чтобы удалить трипсин с помощью настольную центрифугу при 500 × г в течение 5 мин, аспирировать жиму, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендировать клетки в 10 мл DMEM (содержащего 10% FBS). Если клетки необходимы для будущих экспериментов, поместите 1 мл в новую посуду, содержащую 15 мл свежего DMEM (содержащего 10% FBS).
    4. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра и добавьте приблизительно 1 ×10 7 клеток на каждую пластину 15 см и инкубируют при 37 °C с 5% CO2 до тех пор, пока они не будут 100% слитыми (1-2 дня).

2. Препарат для псевдовируса VSV-S-EGFP

  1. Инфекция
    1. Инфицировать клетки при кратности инфекции (MOI) 0,01 вирусом VSV-S-eGFP в 12 мл бессывороточного DMEM в течение 1 ч при 37 °C с 5% CO2, изредка раскачивая пластины. Замените инокуляту свежим DMEM (содержащим 2% FBS и 20 мМ HEPES, рН 7,7) и перейдите в инкубатор, установленный на 34 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для распространения VSV-S-eGFP в клеточной культуре требуется температура 34 °C.
    2. Собирают клеточные супернатанты при наблюдении обширного цитопатической эффекта (КПЭ) и отслойки клеток, примерно через 48 ч после заражения. Используйте флуоресцентный микроскоп для визуализации обширной экспрессии eGFP инфицированными клетками, начиная с 24 ч после заражения.
  2. Коллекция
    1. Центрифугировать супернатанты с помощью настольная центрифуги в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C для удаления остатков клеток. Aliquot - супернатант, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания, и хранить при -80 °C.

3. Титрование псевдовируса VSV-S-eGFP

  1. Серийное разведение для определения титра вируса
    1. Пластинчатые ячейки Vero E6 на 6-скважинных пластинах при плотности посева 6 × 105 клеток на скважину в DMEM (с 10% FBS) и инкубируют в течение ночи при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать ячейки Vero, которые чрезмерно экспрессируют TMPRSS2 и hACE2.
    2. Установите 10-кратную серию последовательного разведения вируса VSV-S-eGFP в dmEM без холодной сыворотки, поместив 900 мкл среды в семь микроцентрифужных пробирок. Этикетные тубы от 1 до 7. Добавьте 100 мкл вирусного запаса в первую трубку и кратковременно вихрь. Перенос 100 мкл разбавленного вируса из пробирки 1 в пробирку 2 и кратковременно вихрь; продолжать до трубки 7.
    3. Аспирировать среду из всех скважин 6-скважинной пластины, содержащей ячейки Vero E6, и заменить 500 мкл разбавлениями от 10-2 до 10-7. Инкубировать пластины в течение 45 мин при 37 °C с 5% CO2,осторожно раскачивая каждые 15 мин.
    4. Аспирировать инокуляту и заменить наложением, содержащим 1:1 смесь 2x DMEM и 6% карбоксиметилцеллюлозы (CMC), конечную концентрацию 3% CMC, дополненную 10% FBS; инкубировать при 34 °C с 5% CO2 в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно разогрейте накладную смесь на водяной бане при 37 °C в течение 15 минут на этапе заражения. Вместо КМЦ можно использовать смесь 1:1 из 1% агарозы с 2x DMEM, дополненной 10% FBS. Для наложения с агарозой кипятят 1% агарозу (в dH2O) и смешивают с холодным 2x DMEM. Убедитесь, что смесь имеет подходящую температуру перед добавлением в монослой ячейки (приблизительно 37-40 °C). Если для наложения используется агароза, клетки должны быть зафиксированы путем инкубации в 2 мл метанола: уксусной кислоты 3: 1 в течение не менее одного часа до окрашивания.
  2. Окрашивание и расчет вирусного титра
    1. Визуализируйте бляшки путем окрашивания кристаллическим фиолетовым или прямой визуализации eGFP под флуоресцентным микроскопом.
    2. Чтобы окрасить пластины, аспирировать накладку, промыть один раз PBS, затем добавить в каждую скважину 2 мл 0,1% кристаллической фиалки (в 80% метанола и dH2O). Поместите на пластину коромысла примерно на 20 мин при комнатной температуре перед окрашиванием. Удалите кристалл фиолетового цвета и осторожно вымойте каждую скважину дважды, используя dH2O или PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы промывки и окрашивания следует выполнять осторожно, медленно пипетируя в сторону каждой скважины, чтобы монослой ячейки оставался нетронутым на протяжении всей процедуры.
    3. Дайте пластинам высохнуть не менее 1 ч, прежде чем считать бляшки. Убедитесь, что количество бляшек получено из колодцев, содержащих от 20 до 200 бляшек. Чтобы рассчитать титр вируса в бляшеобразующих единицах (ПФУ) на мл, умножьте коэффициент разбавления подсчитанный объем инфекции скважины и разделите это число от бляшек, присутствующих в соответствующей скважине.
      Equation 1

4. Покрытие клеток (День 1) для измерения нейтрализации псевдовируса SARS-CoV-2 коммерчески доступными антителами и выздоравливающей сывороткой пациента

  1. Подготовка к посеву тканей
    1. Подготовьте вытяжку для культивирование среды и тканей, как описано в разделе 1. Кроме того, подготовить необходимое количество 96 плит скважин для размещения не менее 2 реплик на образец (т.е. 1 пластина на 6 образцов); добавьте дополнительные реплики, если это разрешено образцом тома.
  2. Покрытие и обслуживание ячеек
    1. Выращивайте и поддерживайте клетки Vero E6, как описано в разделе 1. Готовят по меньшей мере 10 мл клеточной суспензии на 96-ю скважинную пластину в концентрации 2 ×10 5 клеток на мл (пластина 1,5 ×10 5 клеток на мл для анализов, выполненных через 48 ч, если это необходимо). Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую скважину 96-скважинной пластины с помощью многоканальной пипетки и инкубировать в течение 24 ч при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо перемешайте клеточную суспензию и аккуратно покачайте каждую пластину во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек.

5. Разведения антител или сыворотки и инфекции (День 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен для измерения нейтрализации VSV-S-eGFP как коммерчески доступными антителами, так и сывороткой пациента, а также сывороткой, собранной у животных для доклинических исследований разработки вакцины. *Обратите внимание на дополнительные шаги, перечисленные при обработке образцов сыворотки пациента / животного.

  1. Серия последовательного разбавления
    1. Перед разбавливанием образцов сыворотки нагревайте каждый образец на водяной бане с температурой 56 °C в течение 30 мин для инактивации комплемента. Обеспечить необходимые меры предосторожности при обращении с образцами пациентов; открывайте контейнеры для образцов только в вытяжке для культивирование тканей и обеспечьте нанос средств индивидуальной защиты соответствующего уровня защиты уровня 2.
    2. Установите серию разбавления в пустую 96-скважинную пластину (пластина 1).
    3. Начинают все разведения в ряде А 96-колодезной пластины в 80 мкл. * Для образцов пациентов начинают серию разведения с 1 из 10, помещая 8 мкл сыворотки в 72 мкл DMEM без сыворотки (с 1% пенициллина/стрептомицина).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация нейтрализующих антител будет зависеть от активности, прогнозируемой производителем. Для нейтрализующего антитела SARS-CoV-2 Spike, используемого здесь (см. Таблицу материалов),начните с 5 мкг/мл, чтобы наблюдать, по крайней мере, 50% нейтрализацию.
    4. Добавьте 40 мкл бессывороточного DMEM (с 1% пенициллина/стрептомицина) в ряды B-G и 80 мкл в ряд H. Не добавляйте вирус в строку H, так как он служит в качестве элемента управления только для клеток.
    5. Используя 12-скважинную многоканальную пипетку, смешайте и перенесите 40 мкл разбавленной сыворотки или антитела из ряда A в ряд B. Перемешайте и повторите до ряда F, отбросьте 40 мкл из ряда F. Не добавляйте сыворотку в строку G, поскольку она представляет собой контрольную строку, в которую вложен только вирус.
  2. Заражение и наложение
    1. Подготовьте соответствующий объем разбавленного VSV-S-eGFP для обработки каждой скважины при MOI 0,05 (или 2000 pfu). (При завершении этого расчета имейте в виду, что только 60 мкл из общего объема в 80 мкл будут перемещены в клетки; поэтому обязательно умножьте объем вируса на 1,33, чтобы сохранить 2000 pfu).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку VSV-S-eGFP чувствителен к температуре, убедитесь, что вирусные запасы остаются на льду, когда они не используются, и избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания, поскольку титры будут отличаться после повторного замораживания.
    2. Добавьте 40 мкл разбавленного вируса в каждую скважину рядами от А до G пластины 1 и перемешайте путем пипетки вверх и вниз 4-5 раз. Инкубировать пластину в течение 1 ч при 37 °C с 5% CO2.
    3. Извлеките пластину, содержащую клетки, из инкубатора (пластина 2) и осторожно аспирировать жимы из всех колодцев. Переложить 60 мкл смеси антитела/вируса с пластины 1 на пластину 2 и инкубировать в течение 1 ч при 37 °C с 5% CO2,раскачивая пластину каждые 20 мин.
    4. Засыпать каждую скважину 140 мкл наложения, содержащего КМЦ в ДМЭМ, для конечной концентрации 3% КМЦ (с 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина). Поместите пластину 2 в инкубатор при 34 °C с 5% CO2 примерно за 24 ч перед визуализацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно разогрейте накладную смесь на водяной бане при 37 °C в течение 15 минут на этапе заражения.

6. Визуализация и количественная оценка (День 3)

  1. Изображения пластин с использованием автоматизированного флуоресцентного томообразователь (с использованием фильтра изотиоцианата флуоресцеина (FITC) или альтернативного фильтра с длиной волны возбуждения 488 нм). Количественная оценка вирусной инфекции путем создания протокола, который автоматически идентифицирует и подсчитывает отдельные очаги eGFP. Если функция автоматического подсчета недоступна, используйте программное обеспечение ImageJ для количественной оценки количества очагов eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе описан быстрый и эффективный метод обнаружения нейтрализующих антител против белка SARS-CoV-2 S путем ингибирования псевдовирусной инфекции VSV-S-eGFP (количественно определяемой по потере обнаруженных очагов eGFP). Схематическое представление протокола показано на рисунке 1. Рекомендуется, чтобы коммерчески доступное антитело использовалось в качестве положительного контроля каждый раз, когда проводится анализ, чтобы обеспечить согласованность анализа. Здесь мы демонстрируем кривую разведения с использованием коммерчески доступного нейтрализующего антитела IgG против SARS-CoV-2 Spike RBD по сравнению с контролем IgG (см. Таблицу материалов для получения подробной информации об обоих антителах; Рисунок 2).

Образцы реконвалесцентных пациентов собирали примерно через три месяца после заражения SARS-CoV-2, а нейтрализацию псевдовируса определяли с помощью метода, описанного выше(рисунок 3). Важно отметить, что минимальное фоновое торможение наблюдалось при использовании здоровой донорской сыворотки. Кроме того, следует отметить, что этот анализ различает пациентов с высокой тяжестью симптомов и пациентов с более легким заболеванием на основе необходимости госпитализации. В соответствии с другими отчетами, мы наблюдали в нашей небольшой когорте, что госпитализированные пациенты, как правило, демонстрируют повышенную нейтрализующую способность, чем те, кто не требовал госпитализации19,20. Хотя это не всегда может быть так для госпитализированных и негоспитализированных образцов пациентов, способность анализа дифференцировать различные степени нейтрализации является преимуществом. Также могут быть случаи, когда нейтрализующая способность сыворотки пациента намного выше, чем те, которые демонстрируются здесь. При необходимости может быть скорректировано начальное разведение сыворотки пациента или проведены дополнительные этапы разведения на дополнительной пластине.

Figure 1
Рисунок 1:Схема протокола, демонстрирующая нейтрализацию VSV-S-eGFP реконвалесцентной сывороткой. Сокращения: VSV = вирус везикулярного стоматита; eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок; COVID-19 = коронавирусная болезнь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Коммерчески доступное нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2 было использовано в качестве примера положительного контроля наряду с IgG в качестве отрицательного контроля. Способность нейтрализующих антител ингибировать вирусную инфекцию будет варьироваться; обратиться к информации, доступной для приобретенного специфического антитела, чтобы определить, с какой концентрации начать кривую разведения (образцы были проведены в трех местах, полосы ошибок представляют ± SD). (A)Процент ингибирования был рассчитан на основе количества очагов eGFP, обнаруженных с помощью(B)флуоресцентной визуализации. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; IgG = иммуноглобулин; SD = стандартное отклонение; eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок; RBD = рецептор-связывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Способность реконвалесцентной сыворотки у пациентов нейтрализовать VSV-S-eGFP варьируется в зависимости от выраженности симптомов. Образцы сыворотки пациентов были собраны примерно через 3 месяца после заражения SARS-CoV-2, а контрольные образцы были взяты у неинфицированных пациентов (образцы были проведены в трех значениях, полосы ошибок представляют собой ± SD). (A)Процент ингибирования был рассчитан на основе количества очагов eGFP, обнаруженных с помощью(B)флуоресцентной визуализации. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; SD = стандартное отклонение; eGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, описанный здесь, может быть адаптирован к различным лабораторным средам и ресурсам по мере необходимости. Важно отметить, что основным ограничением этого протокола является необходимость защиты пространства уровня 2 и вытяжки культуры тканей. Применение реплицируемого РНК-вируса, псевдотипированного с пиком SARS-CoV-2, такого как VSV-S-eGFP, является грозной альтернативой вирусу SARS-CoV-2, который требует рабочей зоны уровня сдерживания 3, но может оставаться ограничением для некоторых групп. Все остальные шаги, описанные здесь, являются довольно гибкими и могут быть выполнены практически в любой лаборатории уровня локализации 2. Например, использование флуоресцентного томообразователь с функцией автоматического подсчета не является необходимым. Формат 96 скважин, используемый здесь, означает, что для получения изображения почти всей скважины с использованием самой низкой доступной цели (2x) требуется только приблизительно 4 поля зрения.

Ручной флуоресцентный микроскоп может быть использован для изображения нескольких полей каждой скважины, а ImageJ (свободное программное обеспечение) затем может быть использован для количественной оценки очагов eGFP. Кроме того, мы решили использовать формат 96 скважин, чтобы использовать наименьший возможный объем сыворотки, а также свести к минимуму использование расходных материалов. Если флуоресцентный микроскоп недоступен, этот протокол может быть масштабирован до формата 6 или 12 скважин для обнаружения образования бляшек после фиксации и окрашивания кристаллического фиолетового цвета (аналогично протоколу вирусного титра, описанному выше). Наиболее важным соображением, которое следует иметь в виду при выполнении этого протокола, является температурная чувствительность VSV-S-eGFP. При работе с VSV-S-eGFP всегда ациклотировать вирус на небольшие объемы, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания, и держать вирус на льду, когда это возможно. Кроме того, через 24 ч может быть обнаружен надежный флуоресцентный сигнал; однако мы получили аналогичные результаты после визуализации через 20-28 ч после заражения.

Существует несколько методов обнаружения наличия антител против SARS-CoV-2, включая анализ иммуноферментов золотого стандарта (ИФА), который количественно определяет общее количество антител против S21,22. Здесь мы изложили быстрый и надежный метод специфических нейтрализующих антител против иммунодоминантного спайкового белка SARS-CoV-2 в реконвалесцентной сыворотке у пациентов. Мы усовершенствовали классический тест нейтрализации уменьшения зубного налета (PRNT), успешно адаптировавшись к формату 96 скважин, который позволяет обнаруживать нейтрализующие антитела в большом количестве образцов в течение 24 ч путем автоматизированной количественной оценки псевдовирусной инфекции, что позволяет быстро получать окончательные отчеты о данных. В дополнение к обнаружению нейтрализующих антител в сыворотке крови, этот метод может быть адаптирован для выполнения высокопроизводительного скрининга других терапевтических стратегий, направленных на прямое ингибирование взаимодействия спайкового белка SARS-CoV-2 с hACE2, таких как моноклональные антитела, рекомбинантные растворимые hACE2 или ингибиторы протеазы, чтобы препятствовать проникновению вируса23 . С появлением нескольких вариантов спайкового белка SARS-CoV-2 также важно отметить, что этот метод может быть применен для определения того, происходят ли аналогичные уровни нейтрализации после заражения различными вариантами вируса24.

Другие примеры доступных методов обнаружения антител против SARS-CoV-2 включают ИФА, анализы на основе лентивируса и коммерческие наборы для оценки нейтрализующей способности образцов сыворотки. Хотя обычно используемые IgM- или IgG-связывающие ИФА являются эффективным методом определения наличия концентрации антител для отслеживания предыдущей инфекции или иммунизации, они не могут различить нейтрализующую способность связывающих антител25. Псевдотипизированные анализы нейтрализации на основе лентивируса имеют улучшенный профиль безопасности за счет использования нерепликтивных вирусных частиц в отличие от репликации VSV-S-eGFP; однако это создает барьер с точки зрения способности к тестированию, поскольку титры лентивируса, как правило, намного ниже26,27. Существует несколько коммерчески доступных наборов, которые измеряют способность антител блокировать инфекцию посредством конкурентного ингибирования спайкового белка SARS-CoV-2 (особенно RBD), связывающегося с рецептором hACE2 после инкубации с выздоравливающей сывороткой (например, CUSABIO, GenScript, Abnova). Хотя многие из этих наборов имеют авторитетную чувствительность и специфичность, они также, как правило, относительно дороги и, следовательно, не идеальны для большого объема образцов. Протокол, предоставляемый здесь, быстрый, надежный и недорогой. Этот высокопроизводительный метод может быть использован для тестирования многих образцов, достигая надежного считывания в течение 24 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, связанных с этой публикацией.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Уилана за щедрое предоставление вируса VSV-S-eGFP, используемого в этом протоколе (описанного в Case et al. 2020). Мы также благодарим докторов Билла Кэмерона и Ютапорна Коуэна (и команду) за сбор образцов крови пациента (идентификатор протокола REB 20200371-01H). Авторы раскрывают получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и / или публикации этой статьи: Эта работа была профинансирована щедрой поддержкой Фонда больницы Оттавы и грантом от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (#448323) и быстрым грантом от фонда Thistledown для науки о COVID-19 C.S.I. T.R.J. финансируется стипендией для выпускников Онтарио и кластерной стипендией Mitacs. JP финансируется кластерной стипендией Mitacs. T.A. финансируется CIHR Banting Fellowship. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Псевдовирус Нейтрализующее антитело Вирус везикулярного стоматита Спайковый гликопротеин
Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter