Summary
본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.
Abstract
Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 유망한 벡터입니다. 여기서, AAV2 벡터는 스페큘로바이러스(BV)-AAV2-GFP(또는 치료 유전자) 및 BV-AAV2-rep-rep-cap-serum-free 서스펜션 배양에 감염된 Sf9 세포를 가진 Spodoptera 검소페라(Sf9) 세포의 공동 배양에 의해 생성된다. 세포는 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에서 플라스크에서 배양됩니다. AAV 입자를 방출하기 위해, 생산자 세포는 세제를 포함하는 완충액으로 용액이 되며, 이는 이후 저속 원심분리 및 여과에 의해 명확화된다. AAV 입자는 AAV 입자를 결합하는 AVB 세포로즈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포 용해로부터 정제됩니다. 바운드 입자는 PBS로 세척되어 오염 물질을 제거하고 pH 3.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 사용하여 수지에서 용출된다. 산성 용출은 알칼리성 Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)로 중화되고, 인산염 완충식식(PBS)으로 희석되고, 접선 유동 여과(TFF)로 더 농축된다. 이 프로토콜은 인간 유전자 치료 응용 을 위한 대규모 임상 급 AAV 제조에 규모업과 호환되는 소규모 전임상 벡터 생산을 설명합니다.
Introduction
Adeno 관련 바이러스(AAV)는 4.6 kb의 단일 좌초 DNA를 포함하는 비 봉투인간 파르보바이러스이다. AAV 벡터는 유전자 치료 응용 프로그램1,2,3,4에대한 다른 바이러스 벡터에 비해 몇 가지 장점이 있다. AAV는 자연적으로 복제할 수 없기 때문에 복제를 위해 도우미 바이러스와 호스트 기계가 필요합니다. AAV는 어떤 질병도 일으키지 않으며 감염된 숙주3,5에서면역원성이 낮다. AAV는 세포를 정지하고 능동적으로 분할하는 세포를 모두 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합하지 않고 피형으로 지속될 수 있습니다(AAV는 거의 숙주 게놈에 통합되지 않습니다)1,3. 이러한 특징은 AAV유전자 치료 응용 프로그램에 대한 바람직한 도구를 만들었습니다.
AAV 유전자 전달 벡터를 생성하기 위해, 치료 유전자를 포함하는 트랜스진 카세트는, 전형적으로 AAV 혈청형 2로부터 유래되는 2개의 내부 말단 반복(ItRs) 사이에서 복제된다. 5'ITR에서 3' ITR까지의 최대 크기는 트랜스진 서열을 포함하여 4.6 kb6이다. 상이한 capsids는 다른 세포 또는 조직 트로피즘이 있을 수 있습니다. 따라서, 캡시드는 AAV 벡터7로표적화되기 위한 조직 또는 세포 유형에 기초하여 선택되어야 한다.
재조합 AAV 벡터는 일반적으로 인간 배아 신장 세포, HEK293 과도 성 AAV 유전자 전달 벡터, AAV rep-cap 및 도우미 바이러스 플라스미드2,3과같은 포유류 세포주에서 일반적으로 생산된다. 그러나, 부착 HEK293 세포의 일시적인 과도 한 과도 한 연동에 의해 대규모 AAV 생산을 위한 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 많은 수의 셀 스택이나 롤러 병이 필요합니다. 둘째, 고품질 플라스미드 DNA 및 트랜스프션 시약이 필요하며, 이는 제조 비용을 증가시킵니다. 마지막으로, 부착된 HEK293 세포를 사용할 때, 혈청은 최적의 생산을 위해 자주 필요하며, 다운스트림 처리1,2,3을복잡하게 만든다. AAV 제조의 대안 방법은 곤충 세포주, 스포드옵테라 검거(Sf9) 세포, 및 재조합 사인 칼리포니카 다중캡슐핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV 또는 바쿨로바이러스)8,9,10을사용하는 것을 포함한다. Sf9 세포는 확장이 용이하고 플라스미드 또는 트랜스페션 시약을 필요로하지 않는 대규모로 현재의 좋은 제조 관행 (cGMP) 생산과 호환되는 혈청없는 서스펜션 배양에서 재배됩니다. 더욱이, Sf9-바쿨로바이러스 시스템을 이용한 AAV 생산비용은 HEK293세포(11)로플라스미드의 과도한 과도순환을 사용하는 비용보다 낮다.
바쿨로바이러스-Sf9 세포를 이용한 본래의 rAAV 생산 시스템은 유전자 전달 카세트를 함유한 바쿨로바이러스 1개, 렙레유전자를 함유한 제2바쿨로바이러스, 혈청형 특이적 캡시드 유전자12,13을함유한 제3바쿨로바이러스를 사용했다. 그러나, rep 구조를 포함하는 바큘로바이러스는 대규모 AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스의 증폭을 방지하는 여러 통로에 유전적으로 불안정했습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 새로운 rAAV 벡터 시스템이 개발되었다, 이는 두 개의 바쿨로 바이러스를 포함 (TwoBac): AAV 유전자 전송 카세트를 포함하는 하나의 바큘로 바이러스와 원래 시스템보다 유전적으로 더 안정적이고 3 개의14대신 2박을 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리AAV를 생산하는 것이 더 편리합니다. 15. OneBac 시스템은 2박 또는 ThreeBac2,16,17을사용하는 대신 하나의 바큘로바이러스를 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리한 단일 바쿨로바이러스에서 AAV 유전자 전달 카세트 및 렙캡유전자를사용합니다. 우리의 연구에서, TwoBac 시스템은 최적화에 사용되었다.
AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스 시스템은 또한 한계가 있습니다: baculovirus 입자는 혈청 없는 매체11에있는 장기 저장을 위한 불안정하고, 바쿨로바이러스 티터가 낮으면, AAV 생산 도중 Sf9 세포의 성장에 유독할 수 있는 바쿨로바이러스 상피제의 다량이 필요합니다 (개인 관측). 티터가 없는 감염세포 보존 및 스케일업(TIPS) 세포 또는 바큘로바이러스감염 곤충 세포(BIIC)의 사용은 바쿨로바이러스감염Sf9 세포가 제조되고, 냉동 보존되고, 이후에 신선한 Sf9 세포의 감염에 사용되는 AAV 생산을 위한 좋은 선택권을 제공한다. 또 다른 장점은 극저온 보존 후 Sf9 세포에서 바쿨로바이러스(BV)의 안정성이 증가하여10,11이다.
팁 세포의 두 가지 유형은 AAV 생산을 가능하게 하기 위하여 생성됩니다: BV-AAV2-GFP 또는 치료 유전자를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 첫번째, BV-AAV2-rep-cap를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 두 번째. TIPS 세포는 작고 즉시 사용할 수 있는 알리쿼트에서 냉동 보존됩니다. AAV 벡터는 바쿨로바이러스및 신선한 Sf9 세포를 생성하는 TIPS 세포를 공동 배양하여 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에 배치된 플라스크에서 혈청 없는 서스펜션 배양으로 생산됩니다. Sf9 세포는 AAV2-GFP 벡터및 렙캡 서열을 운반하는 바큘로바이러스에 의해 감염되어 AAV를 생성한다. 4~5일 후, AAV 수율이 가장 높은 경우, 생산자 세포는 세제로 리세팅되어 AAV 입자를 방출합니다. 세포 용액은 이후 저속 원심 분리 및 여과에 의해 명확화됩니다. AAV 입자는 AVB 세파로즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 용해로부터 정제된다. 마지막으로 AAV 벡터는 TFF를 사용하여 농축됩니다. 이 프로토콜은 연구 및 전임상 연구에 유용한 소규모AAV 생산을 설명합니다. 그러나, 이 방법은 유전자 치료 응용을 위한 임상급 AAV 벡터제조와 확장가능하고 호환된다.
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Protocol
프로토콜을 요약한 그림 1을 참조하십시오.
1. 바쿨로바이러스 감염 팁 세포의 생성
- Sf9 세포의 한 유리병을 해동하고 곤충 세포 배양 배지의 50mL에 즉시 종자. 125 rpm및 28°C의 궤도 셰이커 인큐베이터에서 Sf9 세포를 성장시키고, 28°C를 둥근 바닥 플라스크에서 공기8,9의교환을 위해 느슨하게 부착된 캡을 가진다. TIP 세포 생산을 위한 충분한 세포를 얻기 위하여 매체의 200 mL를 포함하는 1 L 플라스크에서 세포를 전파합니다.
- 2개의 플라스크에 2 x 106 세포/mL에 Sf9 세포의 50mL를 추가하십시오: bV(BV)-AAV2-GFP (또는 치료 유전자)의 0.5mL와 Sf9 세포의 플라스크1개를 감염시키고 BV-AAV2-rep-cap의 0.5mL를 가진 세포의 그밖 플라스크를 감염시하십시오.
참고: AAV 벡터 플라스미드는 로버트 M. 코틴 박사(NIH)가 아낌없이 제공했습니다. 바쿨로바이러스의 바쿨로바이러스 생산은 박미드 DNA(Bac-to-Bac System)로부터 이전에 설명된8,9. 통로 도중 바쿨로바이러스 안정성은 rAAV의 스케일업 생산을 위한 중요한 문제입니다. 바쿨로바이러스의 낮은 통로 수를 사용하는 것이 좋습니다 (통로 번호 4까지). 팁셀 생산 중 유동 세포측정법(도2)을이용하여 바쿨로바이러스 감염 효율을 확인하여 경험적으로 바쿨로바이러스 의 최적 부피를 결정한다. - 감염된 Sf9 세포에서 바쿨로바이러스 gp64를 염색하여 감염 후 3-4일 후에 바쿨로바이러스 감염을 모니터링한다.
- 스테인 2 x105 Sf9 세포(감염되지 않은 세포 및 바쿨로바이러스 감염 세포 모두)는 0.5 μg의 마우스 항바쿨로바이러스 gp64 항체(1:200)를 함유하고 있으며, 주변 온도에서 30분 동안 블로킹 버퍼의 100μL에서 형광염염을 함유하고 있다.
- PBS의 1mL로 세포를 세척하여 항체를 제거하고 0.5% 소 세럼 알부민을 함유하는 PBS의 300 μL에서 스테인드 세포를 재보중단한다.
- 유동 세포측정을 이용한 세포에 대한 바쿨로바이러스 gp64 발현을 분석한다(도2).
참고: 유동 세포측정제 획득 및 분석을 경험적으로 결정하기 위한 게이팅 전략을 결정합니다. 총 10,000개의 단일 라이브 셀이 획득됩니다. Sf9 세포 표면에 바쿨로바이러스 gp64 발현은 바쿨로바이러스 감염을 나타낸다. 3-4일 후, 대부분의 Sf9 세포는 바쿨로바이러스 gp64 발현(그림2)에의해 입증된 바와 같이 바쿨로바이러스에 감염된다.
- 세포가 직경의 증가와 함께 80%-90%가 가능할때(도 3),-80°C에서 느린 동결 용기에서 10%의 태아 소 혈청과 10% 디메틸 설프리산화물을 보충한 곤충 배양 배지 1mL에서 세포및 냉동 보존 1 x 107 세포를 수확한다. 다음 날, TIPS 세포를 함유한 튜브를 액체 질소 냉동고로 옮겨 장기 보관합니다.
참고: 생물안전 수준 2(BSL-2)에서 표준 무균 실험실 기법에 따라 생물안전 캐비닛에서 세포 배양을 수행합니다.
2. AAV 벡터 의 생산
- 1일차: 바쿨로바이러스 감염 TIPS 세포를 가진 공동 배양 Sf9 세포
- AAV 생산에 필요한 셰이커 인큐베이터에서 곤충 세포 배양 배지400mL을 함유하는 2L 플라스크에서 28°C에서 1 x 106 세포/mL에서 순진한 Sf9 세포를 배양하고 성장시다. 3-4일 후에, 세포 밀도는 5 x 106 -6x 106 세포/mL까지 증가합니다.
참고: CO2 및 습도는 Sf9 세포의 성장을 위한 중요한 요인이 아닙니다. - Sf9 세포를 쉐이크 플라스크 또는 생물 반응기에서 다음과 같이 시드합니다.
- 궤도 셰이커 인큐베이터에서 플라스크에서의 AAV 생산: 파이펫 또는 연막 펌프를 사용하여 2 x 106 셀/mL에서 Sf9 배양 400mL를 2 L 플라스크에 2 L 플라스크로 부칭합니다. 궤도 셰이커를 125 rpm 및 28°C에서 설정합니다.
참고 AAV 생산 규모에 따라 연동 펌프 또는 표준 파이펫을 사용합니다. - 생물 반응기에서 AAV 생산: 연동 펌프를 사용하여 2 x 106 세포/mL에서 Sf9 배양 1L을 10 L 생체 반응기 백에 무균으로 시드합니다. 28°C에서 배양하기 위해 가방을 바이오 리액터 장치에 적재합니다. 0.1 psi에서 생물 반응기 가방에 40 %의 산소를 추가합니다. 생물 반응기 장치를 20° 각도로 설정하고 25 rpm에 가방을 흔들어.
- 궤도 셰이커 인큐베이터에서 플라스크에서의 AAV 생산: 파이펫 또는 연막 펌프를 사용하여 2 x 106 셀/mL에서 Sf9 배양 400mL를 2 L 플라스크에 2 L 플라스크로 부칭합니다. 궤도 셰이커를 125 rpm 및 28°C에서 설정합니다.
- 각 BV-AAV2-GFP (또는 치료 유전자) 및 BV-AAV2-rep-cap TIPS 세포의 1개의 유리병을 해동합니다. 곤충 배양 배지의 20mL로 세포를 희석시키고 트라이팬 블루를 사용하여 세포의 생존 수를 수행한다. 셰이커 플라스크 또는 생물 반응기에서 배양된 순진한 Sf9 세포에 비해 팁 세포를 1:10,000의 비율로 접종한다.
참고: 팁 세포의 생존은 냉동 보존으로 인해 감소되며, 세포 생존율이 트라이판 블루 염색으로 결정되면 회복률은 약 50%입니다. 대규모 rAAV 생산 전에 TIPS 세포 및 순진한 Sf9 세포의 비율을 경험적으로 결정하기 위한 파일럿 실험을 수행한다.
- AAV 생산에 필요한 셰이커 인큐베이터에서 곤충 세포 배양 배지400mL을 함유하는 2L 플라스크에서 28°C에서 1 x 106 세포/mL에서 순진한 Sf9 세포를 배양하고 성장시다. 3-4일 후에, 세포 밀도는 5 x 106 -6x 106 세포/mL까지 증가합니다.
- 2일차: 문화 모니터링
- Sf9 배양1mL를 무균적으로 수확하십시오. 세포 수, 생존 가능성 및 형태학을 분석하기 위해 Trypan 블루 염료를 가진 얼룩.
- 3일차: 문화 모니터링 및 수유
- Sf9 배양의 1mL를 수확하고 세포 수, 생존 가능성 및 형태학을 분석합니다. 1.3단계에서 언급된 바와 같이 Sf9 세포를 염색한 후 바쿨로바이러스 감염의 상태를 확인한다.
참고: 세포 직경및 세포병증 효과의 증가는 바쿨로바이러스 감염의 표시입니다. 직경의 증가는 세포 생존가능성의 감소보다 앞서며, 이러한 파라미터는 AAV 생산 중 세포 수확 시간을 결정하는 데 사용된다. 최적의 시간 점을 경험적으로 결정합니다. - Sf9 배양에 신선한 곤충 배양 배지를 1:5 의 비율로 공급한다.
- Sf9 배양의 1mL를 수확하고 세포 수, 생존 가능성 및 형태학을 분석합니다. 1.3단계에서 언급된 바와 같이 Sf9 세포를 염색한 후 바쿨로바이러스 감염의 상태를 확인한다.
- 4일차: 문화 모니터링
- Sf9 배양의 1mL를 수확하고 세포 수, 생존 가능성 및 형태학을 분석합니다. 생물 반응기 가방에서 산소 공급을 분리합니다.
- 5일차: 문화 모니터링 및 수확
- Sf9 배양의 1mL를 수확하고 세포 수, 생존 가능성 및 형태학을 분석합니다. Sf9 세포 생존가능성이 약 50%로 감소했을 때 배양 배지 및 세포를 수확한다(그림4).
- 4°C에서 15분 동안 2100 x g에서 셀 서스펜션을 회전시. 상체및 세포 펠릿을 수집하고 -80 °C에 저장합니다.
3. 세포의 리시스 및 AAV의 방출
- AAV 생산자 셀 펠릿을 해동합니다. 세포 용해 버퍼 100mL(20m Tris-HCl pH 8.0, 염화 나트륨 150m, 0.5% Triton-X-100)를 세포 펠릿에 넣고, 양면에서 30분 동안 교배하여 AAV 입자를 방출한다.
- 4°C에서 30분 동안 2100 × g의 원심분리기는 세포 용양을 새 용기로 옮긴다. 해동 후 세포 리세이트와 세포 배양 상수체를 섞는다.
- DNA와 RNA를 소화하기 위하여 세포 리스에 20 개의 U/mL 핵및 10 mM MgCl2를 추가합니다. 37 °C에서 2-4 h에 대한 인큐베이션.
- 펌프를 사용하여 0.8 μm 및 0.2 μm 및 0.2 μmpolyethersulfone 이중 여과 시스템을 통해 lysate를 필터링합니다.
- 정제된 셀 용해물을 하룻밤 사이에 4°C에 저장하거나 AAV를 즉시 정화합니다.
4. 친화도 크로마토그래피 시스템을 이용한 AAV 벡터 의 정화
- 50mL/분의 유속으로 멸균수, 수산화나트륨 1N 나트륨, 물 및 인산염 완충식염(PBS, pH 7.4)으로 시료 및 완충선을 순차적으로 세척하여 크로마토그래피 기기를 준비한다.
- AVB 세파로즈 컬럼(10.0mL)을 크로마토그래피 시스템에 탑재하고, 5mL/min의 유속으로 100mL의 PBS를 실행한다.
참고: AAV 생산 규모에 따라 AV Sepharose 컬럼의 더 낮거나 높은 볼륨을 사용하고 컬럼 또는 수지 제조업체에서 제안한 유량을 설정합니다(재료 표참조). - AAV 입자를 포함하는 컬럼 통과 용액의 분수를 수집하려면, AAV 입자를 포함하는 버퍼 및 용출 버퍼를 수집하려면 크로마토그래피 기기의 분수 수집슬롯에 튜브를 삽입합니다.
- 5.0mL/min의 유속도로 PBS로 열을 상형화합니다.
- 샘플 펌프가 장착된 크로마토그래피 기계를 사용하여 AAV 입자를 함유한 여과된 셀 리세테를 컬럼에 적재한다. 샘플을 분당 3.0mL의 유량으로 실행합니다.
- 자외선(UV) 흡광도 곡선(280 nm)이 기준선으로 돌아와 안정될 때까지 AVB 세파로즈 컬럼을 3.0mL/min의 유량으로 PBS를 실행한다.
- 50mM 나트륨 구연산(pH 3.0) 버퍼로 컬럼으로부터 AAV 입자를 3.0mL/min(그림5)의유량으로 엘테.
참고: AAV 입자가 수지에서 해리되고 UV 검출기를 통과하는 동안 크로마토그램에서 단백질의 용출 피크를 볼 수 있습니다. - AAV 상체를 500m Tris-HCl(pH 8.0)의 5분의 1 부피로 즉시 희석하여 상류제를 함유하는 AAV의 pH를 약 pH 5.5로 증가하여 산성 용출 완충제로 pH 매개 저하를 방지한다. 또한, PH를 완전히 중화시키기 위해 PBS로 AAV 상수 10배를 희석한다.
참고: pH 값은 rAAV 용액을 중화한 후 약 5.5입니다. AAV를 중화한 후, AAV가 생리적 완충제에 되도록 PBS(pH 7.4)로 rAAV 용액을 10배 희석한다. - 각 컬럼 런스루 샘플, 세척 버퍼 및 100 μL의 1mL을 저장하여 대상 세포의 감염에 의해 AAV의 존재를 평가한다.
- 100mMM구연산(pH 2.1)의 100mL와 5.0mL/min의 유속도로 100mL의 PBS(pH7.4)로 AVB 세파로즈 컬럼을 청소한다. 5.0mL/min의 유량으로 20%의 에탄올로 컬럼을 헹구고 4°C에 보관하십시오.
- 섹션 4.1에 설명된 대로 열 오프라인 위치로 크로마토그래피 기기의 파이프라인을 청소합니다. 마지막으로, 50.0mL/min의 유량으로 200mL의 200mL로 크로마토그래피 시스템을 헹구고 20%에 탄올에 보관합니다.
5. 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 AAV 벡터의 농도 및 분과
- AAV를 농축하기 위해 폴리설폰 멤브레인 카트리지(100kDa 분자량 차단)를 장착한 TFF 시스템을 설정합니다.
- 10 분 동안 PBS의 200 mL와 TFF 모듈을 평형.
- 2-3 psi에서 트랜스 멤브레인 압력을 유지하면서 시료가 원하는 부피로 감소될 때까지 펌프의 흐름을 제어하여 AAV 샘플을 로드합니다.
- 본 연구에서 사용되는 바와 같이 PBS의 100mL로 재발을 diafiltrate, 또는 AAV의 장기적인 안정성을 지원하는 대체 버퍼를 경험적으로 정의합니다.
- AAV 샘플을 원하는 부피에 농축한 후 AAV 샘플을 수집하여 0.2 μm polyethersulfonefilter, aliquot를 통해 필터링한 다음 -80°C에 저장합니다.
6. 정화 단계에서 AAV의 존재를 평가하기 위해 표적 세포로 AAV 샘플의 감염
- 접종 7 x 104 HT1080 세포/웰 24웰 플레이트에서 500 μL의 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)는 L-글루타민 1%, 피루바테 나트륨 1%, 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하였다. 37°C 및 5% CO2에서인큐베이터에서 세포를 배양한다.
- 감염 하기 전에 세포를 계산 합니다. 컬럼이 실행되기 전에 희석된 정제되지 않은 AAV 벌크 샘플을 추가하고, 컬럼 런스스스 샘플, 세척 버퍼 및 정제된 AAV 샘플을 발동합니다.
참고: 혈전계로 트라이판 블루 스테인드 셀을 계산합니다. AAV 샘플의 희석 계수 및 부피(μL)를 경험적으로 결정합니다. AAV 티터가 높을수록 희석이 더 필요합니다. 기둥이 실행되기 전에 불응지의 벌크 샘플의 바쿨로바이러스 입자가, 컬럼 런스루 샘플, 세척 버퍼가 50°C에서 50°C에서 열비활성화되어 있는지 확인한 후 타겟 세포를 감염시키고 AAV의 전염성 티터를 결정한다. - 감염 후 2일 후, 유동 세포계를 이용하여 세포내 단백질 발현(예를 들어, GFP 또는 치료 유전자)을 분석한다.
- 감염 시 세포의 수, 희석 인자 및 수식을 가진 GFP+ 세포의 백분율을 사용하여 AAV의 전염성 적도를 계산합니다: (총 셀 수 x 백분율 GFP+ 세포 x 희석 인자) / 밀리리터의 AAV 부피.
참고: 예를 들어, 세포의 수는 1 x105이고,GFP+ 세포의 백분율은 3.4%, 희석 계수는 100이고, AAV의 부피는 2 μL이다. AAV의 티터는 1.7 x 108 전염성 장치 (IU)/mL입니다. 용출분획의 25mL에서 정제된 AAV 입자의 총 양은 4.3 x 109 전염성 단위(IU)/mL(도6)이다. 초기 무정제 AAV 입자의 총 수는 1.09 x 1010 IU/mL이며 정제된 AAV 입자는 4.3 x 109 IU/mL입니다. 따라서 회복비율은 39.4%이다. GFP+ 셀의 백분율은 AAV의 전염성 티터를 계산하는 데 사용될 때 선형 범위에 해당하는 1%-30% 사이여야 합니다. 더 농축된 AAV 벡터 입자가 표적 세포로 감염되는 경우; AAV 입자의 여러 복사본이 벡터의 단일 복사본으로 표시되는 단일 셀을 감염시킬 가능성이 있다. 따라서, 표적 세포에서 1%-30% 벡터 감염을 얻기 위해 AAV 벡터 상수체를 희석한다. AAV 벡터가 리포터 유전자가 없는 경우, 유동 세포계를 이용하여 검출및 수량화할 수 있는 형광염을 함유하는 항체를 갖는 AAV 벡터에 의해 발현된 트랜스진 또는 치료 유전자를 얼룩지게 한다. 모든 AAV 혈청형이 HT1080 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 다른 AAV 혈청형에 대한 감염성 분석방법을 수행하려면, 상이한 세포주를 사용한다. HT1080 세포에 정제되기 전 및 정제 후 AAV2-GFP 입자를 적티어 유동 세포측정에 의한 GFP 발현을 측정한다. 정제전에 정제된 AAV 입자의 수와 AAV 입자의 수의 비율로 회복(%)을 100배 곱한 값으로 계산한다.
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Representative Results
여기서, Sf9 곤충 세포 시스템을 이용한 AAV 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발의 대표적인 결과가 나타난다. 이 방법은 바쿨로바이러스에 감염된 TIPS 세포를 이용한 Sf9 세포의 공동 배양, AAV 입자를 방출하기 위해 생산자 세포의 수확 및 용해, 뉴클레아제 처리, 원심분리 및 여과, AVB 세포 세포 친화성 을 이용한 AAV의 정제, 1피오포그래피(Tromography)를 포함한다.
TIPS 세포는 BV-AAV2-GFP 또는 치료 유전자 및 BV-AAV2-rep-cap를 Sf9 세포로 별도로 감염시킴으로써 생성된다. 대부분의 Sf9 세포는 다발적인 감염으로 인해 3-4일 만에 바쿨로바이러스에 감염되고, 바쿨로바이러스 당단백질 gp64 발현(도2)에의해 입증되고 세포는 직경증가(도3)를보여준다. TIPS 세포는 감염 후 3-4일 동안 수확되고 냉동 보존됩니다. Sf9 세포는 순진한 Sf9 세포를 감염시키는 배양 배지에서 바쿨로바이러스 입자를 분비하는 TIPS 세포와 공동 배양된다. 바쿨로 바이러스는 복제 능력이 있습니다. 따라서, 감염된 세포의 수는 배양 배지로분비되는 새로 생성된 바쿨로바이러스 입자를 가진 다중 둥근 감염에 의해 급속히 증가한다8,9. 세포는 직경의 증가, 세포병증 효과 및 세포의 약 절반이 감염 후 5일 이내에 죽는것으로, 이는 AAV 생산완료의 징후이다(도4).
AAV 생산자 세포는 세포 용해로 AAV를 방출하는 세제를 함유한 완충제로 용인되는 저속 원심분리에 의해 수확됩니다. 그런 다음 점도를 줄이기 위해 DNA와 RNA의 소화를 위한 뉴클레아제로 치료되고, 0.8 μm 및 0.2 μm 막을 통해 여과하고, 이어서 정제 및 농축된다. 셀 리세이트는 크로마토그래피 시스템을 사용하여 AVB 세포로스 컬럼에 로드됩니다. AVB 세파로즈 수지는 캡시드 단백질에 대한 친화성으로 인해 AAV2 입자를 결합합니다. 세척 버퍼는 자외선(UV) 흡광도 곡선(280 nm)이 기준선에서 안정될 때까지 언바운드 및 느슨하게 결합된 재료를 제거하기 위해 AVB 세파로즈 컬럼을 통해 실행됩니다. AAV 입자가 AVB 세파로즈를 강하게 결합하기 때문에 세척 중에 상당수의 AAV2 입자가 검출되지 않습니다. AAV 입자는 AAV 입자와 AV Sepharose 수지 사이의 상호 작용을 해리시키는 산성 완충제(pH 3.0)로 동산성 버퍼로 용출됩니다. 산성 용액에 의한 AAV의 pH 매개 분해를 방지하기 위해, 용액은 알칼리성 버퍼(pH 8.0)로 중화된다. 단백질의 피크는 AAV 분획에 대응하는 산성 완충제로 용출하는 동안 볼 수 있습니다(도5 및 도 6). 정제 된 AAV는 PBS로 10 배 희석되고, TFF 시스템과 교환 된 농축 및 버퍼입니다. 이 예에서, 세포 용액(560mL)의 총 AAV 입자는 1.1 x 1014 벡터 게놈(vg),AVB 세파로즈 크로마토그래피 정제(25mL) 후 4.1 x 1013vg, TFF(25mL)를 가진 농도 후 2.4 x10 13vg이다. 정제된 AAV 샘플은 SDS-PAGE 및 실버 염색 후 3가지 뚜렷한 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3를보여줍니다(그림 7)
그림 1: AAV 벡터의 생산 및 정화를 위한 회로도를 참조하십시오.
그림 2: Sf9 세포에서 바쿨로바이러스 gp64 발현의 유동 세포 분석. Baculovirus 감염 Sf9 세포는 유동 세포측정에 의해 검출되는 형광염을 포함하는 마우스 항바쿨로바이러스 gp64 항체로 염색된다. (A)감염되지 않은 Sf9 세포. (B)바쿨로바이러스 감염Sf9 세포는 대부분의 세포에서 gp64 발현을 나타내고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 바큘로바이러스 감염 Sf9 (TIPS) 세포의 형태학. 바쿨로바이러스는 TIPS 세포를 생성하기 위해 Sf9 세포에 감염된다. (A)감염되지 않은 Sf9 세포. (B)바쿨로바이러스 감염 Sf9 (TIPS) 세포. 세포는 200배율로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: AAV 생산 중 바큘로바이러스감염 Sf9 세포의 형태학. TIPS 세포는 AAV 생산 도중 공동 배양된 순진한 Sf9 세포를 감염시키는 바쿨로바이러스를 분비합니다. (A)감염되지 않은 Sf9 세포. (B)바쿨로바이러스 감염 Sf9 세포는 직경의 증가를 나타내고 있다. 5 일 감염 후, 세포의 거의 절반은 죽는다 (trypan 블루 염색 후 반전 된 상 현미경으로 시각화). 적색 화살표는 살아있는 세포를 나타내고 파란색 화살표는 죽은 세포를 나타냅니다. 세포는 200배율로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: AV B 세파로즈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 AAV 정제. 크로마토그램은 컬럼, 세척 및 용출시 시료 하중 시 280nm에서 단백질 샘플의 흡수를 보여줍니다. 크로마토그램은 그림에 맞게 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 컬럼, 세척 및 용출에 적재하는 동안 흐름 에 있는 전염성 AAV 입자의 수입니다. 총 560mL의 AAV 샘플이 10mL AVB 세파로즈 컬럼에 로드됩니다. 컬럼 하중의 분획량은 50mL이고 컬럼 세척은 50mL이고 용출은 25mL입니다. AAV 티터는 정제의 각 단계에서 AAV의 존재를 조사하기 위해 컬럼, 세척 및 용출에 로드하는 동안 컬럼 런스루 샘플과 HT1080 세포의 감염 후 측정됩니다. 총 정제 된 AAV 수율은 4.3 x 109 전염성 단위입니다. 각 다이아몬드 모양의 심볼은 각 분수에서 AAV의 전염성 단위(IU)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. SDS-PAGE 및 은색 염색은 캡시드 단백질을 나타내는 순수 AAV 벡터입니다. 감소된 AAV 샘플은 SDS-PAGE에서 실행되며 실버 염색이 수행됩니다. AAV 캡시드 단백질의 세 가지 뚜렷한 밴드, VP1, VP2 및 VP3가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
AAV 벡터의 생산, 정제 및 농도의 공정 개발을 위해 이 프로토콜에 사용되는 파라미터는 유전자 치료 응용을 위한 AAV 벡터의 소규모 및 대규모 제조 모두에 적용될 수 있다. 전체 업스트림 및 다운스트림 프로세스는 현재 의 양호한 제조 관행(cGMP)과 호환되는 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있습니다. Sf9-baculovirus 시스템의 주요 장점은 저렴한 비용으로 대규모 GMP 급 AAV 생산을 위한 확장성입니다. 이 시스템은 HEK293 세포를 사용하여 AAV의 생산에 필요한 고가의 플라스미드 및 트랜스프션 시약을 필요로하지 않습니다. HEK293 세포와 Sf9 세포 모두 유사한 품질의 AAV 벡터를 산출하는 것으로 보고되었습니다 (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, 추상 #100). 주요 과제는 이 시스템에 상당한 시간과 노력이 필요한 바쿨로바이러스 및 TIPS 세포의 생성이 필요하다는 것입니다.
이 프로토콜에서, TIPS 세포의 두 가지 유형 (TwoBac 시스템)이 사용되었다: AAV 유전자 전달 카세트와 바쿨로 바이러스를 포함하는 하나의 TIPS 세포와 AAV-rep-cap을 포함하는 또 다른 TIPS 세포. OneBac 시스템2,16,17은 단일 바쿨로바이러스에서 AAV 유전자 전달 카세트 및 렙캡 유전자를 모두 포함하는 TIPS 세포를 생성할 수 있다. OneBac 시스템은 TwoBac 시스템에 설명된 대로 두 세트가 아닌 하나의 TIPS 셀 만 사용하여 rAAV를 생성하는 대체 방법을 제공하므로 프로토콜을 더욱 단순화합니다.
이 프로토콜은 Sf9 셀에서 AAV 생산을 설명합니다. 좋은 AAV 수율을 얻기 위해 바이러스에 감염된 TIPS 세포의 비율을 생산자 순진한 Sf9 세포에 최적화하는 것이 중요하다. 이 비율이 최적이 아닌 경우 AAV의 수율은11을감소시게 됩니다. 예를 들어, 유전자 전달 벡터를 함유하는 더 많은 AAV ITR이 팁 및 생산자 세포의 하위 최적 비율로 인해 생산자 세포내의 캡시드보다 생성되는 경우, 사용 가능한 모든 유전자 전달 벡터는 전체 AAV 입자를 생성하기에 충분한 캡시드를 얻지 못할 것이다. 한편, 생산자 세포내AAV 유전자 전달 벡터보다 더 많은 캡시드가 생성되는 경우, 모든 캡시드는 빈 AAV 입자를 초래하는 유전자 전달 벡터를 포함하는 AAV ITR을 얻지 못한다.
세포가 번식함에 따라 배양 배지의 영양소가 소진되고 대사 폐기물이 축적됩니다. 따라서, TIPS 세포와 Sf9 세포의 공동 배양 후 2일 후 세포 배양으로 20% 신선한 성장 배지를 보충하면 AAV 티터를 크게 증가시킬 수 있다(아민 A. 카멘, 국가연구위원회 캐나다, 개인 커뮤니케이션).
AAV 입자의 순도는 시험관 내 및 생체 내 연구3,5모두에 대한 세포 독성없이 표적 세포의 효과적인 변환을 달성하기위한 중요한 요소입니다. 따라서, AAV 입자를 선택적으로 정화하고 숙주 세포 단백질 및 파편, 게놈 및 바쿨로바이러스 DNA, 및 집합 및 단편화된 벡터와 같은 불순물을 제거할 수 있는 크로마토그래피 단계를 포함하는 것이 중요하다. AvB Sepharose 컬럼에 AAV 상체를 로드하는 동안 수지에 결합하지 않고 컬럼을 통과할 수 있는 AAV 입자의 존재에 대해 유동 시료를 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우,(1) AAV 입자를 결합하는 데 더 긴 체류 시간이 필요한 낮은 실행 속도가 필요하며, (2) 열에 로드된 샘플의 양을 감소시켜야 하며, (3) AV Sepharose의 부피를 늘려서 컬럼의 바인딩 용량이 AAV 입자의 수를 초과하지 않도록 한다. AVB 세파로즈 수지는 높은 유량과 높은 친화력 및 용량으로 AAV 입자를 결합하는 능력이 정화 시간을 줄이는 데 중요합니다. AVB 세파로즈의 주요 한계는 AAV 혈청형 1, 2 및 5의 캡시드를 결합한다는 것입니다. 따라서, 다른 크로마토그래피 수지는 다른 AAV혈청형(18)의정제를 위해 시험되고 사용해야 한다. 본 명세서에 기재된 다운스트림 정제 프로토콜은 HEK 293 세포에서 생산된 AAV를 정화하는 데도 사용될 수 있다.
이 프로토콜은 세포 용해에서 AAV를 정화할 수 있지만 빈 입자를 제거할 수는 없습니다. 몇몇 기사는 정제 된 AAV 주식19,20에서전체 AAV 입자 대 비어 있는입자를구별 할 수있는 방법을 설명했다. 그러나 빈 입자의 생성을 최소화하기 위해 상류 공정 수준에서 AAV 생산을 최적화해야 한다고 생각합니다. 생산자 세포에서 AAV 유전자 전달 벡터 및 캡시드 생산의 비율이 최적이지 않으면 더 많은 빈 입자가 생성될 수 있다.
전체 AAV 입자를 결합하는 것 외에도 AVB Sepharose 배지는 TFF를 사용하여 제거할 수 있는 단편화된 AAV 입자 또는 캡시드 단백질을 결합합니다. 대부분의 저분자량 입자는 기둥 크로마토그래피의 TFF 스텝 하류를 포함시킴으로써 AAV 샘플로부터 제거된다. 또한, TFF는 완충 교환/diafiltration을 수행하고 AAV10,21을집중시키기 위해 사용된다.
세슘 염화 또는 이오디산올 그라데이션을 이용한 AAV 용액의 초원심분리가 소규모 및 전임상 AAV 정제를 위한 바람직한 방법이지만, 이 방법은 확장성이 없고 AAV21,22의대규모 정화에 덜 적합하다.
결론적으로, AAV의 생산 및 정제 공정 개발을 위한 이 프로토콜은 상속된 유전질환의 유전자 치료를 위한 재조합 AAV의 소규모 전임상 및 대규모 제조에 유용할 것이다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 로버트 M. 코틴 박사 (국립 심장, 혈액 및 폐 연구소, NIH) 우리에게 AAV 플라스미드와 다니엘 스틸과 레베카 에른스트 (신시내티 어린이 병원)를 아낌없이 제공하는 데 감사드립니다. 이 작품은 신시내티 아동 연구 재단에서 M.N에 이르는 스타트업 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
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