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Biology

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/62829
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Abstract

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores prometedores para aplicaciones de terapia génica. Aquí, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con células Sf9 infectadas con baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap en cultivo de suspensión sin suero. Las células se cultivan en un matraz en un agitador orbital o biorreactor de onda. Para liberar las partículas AAV, las células productoras se lisan en tampón que contiene detergente, que posteriormente se clarifica mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas AAV se purifican a partir del lisado celular mediante cromatografía de columna AVB Sepharose, que se une a las partículas AAV. Las partículas unidas se lavan con PBS para eliminar los contaminantes y se eluyen de la resina utilizando tampón de citrato de sodio a pH 3.0. El eluido ácido se neutraliza con tampón alcalino Tris-HCl (pH 8.0), se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se concentra aún más con filtración de flujo tangencial (TFF). El protocolo describe la producción de vectores preclínicos a pequeña escala compatible con la ampliación a la fabricación de AAV de grado clínico a gran escala para aplicaciones de terapia génica humana.

Introduction

Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus humanos no envueltos que contienen un ADN monocatenario de 4,6 kb. Los vectores AAV tienen varias ventajas sobre otros vectores virales para aplicaciones de terapiagénica 1,2,3,4. Los AAV son naturalmente incompetentes para la replicación, por lo tanto, requieren un virus ayudante y una maquinaria huésped para la replicación. Los AAV no causan ninguna enfermedad y tienen baja inmunogenicidad en el huésped infectado3,5. El AAV puede infectar tanto a las células inactivas como a las que se dividen activamente y puede persistir como episoma sin integrarse en el genoma de las células huésped (los AAV rara vez se integran en el genoma del huésped)1,3. Estas características han hecho de AAV una herramienta deseable para aplicaciones de terapia génica.

Para generar un vector de transferencia de genes AAV, el casete transgénico, incluido el gen terapéutico, se clona entre dos repeticiones terminales internas (ITR), que generalmente se derivan del serotipo AAV 2. El tamaño máximo de 5' ITR a 3' ITR, incluyendo la secuencia transgénica, es de 4,6 kb6. Diferentes cápsides pueden tener un tropismo celular o tisular diferente. Por lo tanto, las cápsides deben elegirse en función del tipo de tejido o célula que se pretende atacar con el vector AAV7.

Los vectores AAV recombinantes se producen comúnmente en líneas celulares de mamíferos como las células renales embrionarias humanas, HEK293 por transfección transitoria del vector de transferencia del gen AAV, AAV rep-cap y plásmidos de virus auxiliares2,3. Sin embargo, existen varias limitaciones para la producción de AAV a gran escala mediante la transfección transitoria de células HEK293 adherentes. Primero, se necesita una gran cantidad de pilas de celdas o botellas de rodillos. En segundo lugar, se necesitan ADN plásmido de alta calidad y reactivos de transfección, lo que aumenta el costo de fabricación. Finalmente, cuando se utilizan células ADHERENTES HEK293, el suero se necesita con frecuencia para una producción óptima, lo que complica el procesamiento posterior1,2,3. Un método alternativo de fabricación de AAV implica el uso de la línea celular de insectos, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y un virus de insecto llamado autografia californica multicápside recombinante virus de poliedrosis nuclear (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Las células Sf9 se cultivan en un cultivo de suspensión sin suero que es fácil de escalar y es compatible con la producción actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) a gran escala, que no requiere plásmidos ni reactivos de transfección. Además, el costo de la producción de AAV utilizando el sistema Sf9-baculovirus es menor que el costo de usar la transfección transitoria de plásmidos en células HEK29311.

El sistema original de producción de rAAV utilizando células baculovirus-Sf9 utilizó tres baculovirus: un baculovirus que contiene casete de transferencia de genes, el segundo baculovirus que contiene el gen rep y el tercer baculovirus que contiene el gen de la cápside específico del serotipo12,13. Sin embargo, el baculovirus que contenía la construcción de rep era genéticamente inestable en múltiples rondas de pasajes, lo que impedía la amplificación del baculovirus para la producción de AAV a gran escala. Para resolver este problema, se desarrolló un nuevo sistema vectorial rAAV, que contenía dos baculovirus (TwoBac): un baculovirus que contiene el cassette de transferencia del gen AAV y otro baculovirus que contiene los genes AAV rep-cap juntos que son genéticamente más estables que el sistema original y más convenientes para producir rAAV debido al uso de TwoBac en lugar de tres14, 15. El sistema OneBac utiliza el casete de transferencia de genes AAV y los genes rep-cap en un solo baculovirus que es más conveniente para producir el rAAV debido al uso de un baculovirus en lugar de usar TwoBac o ThreeBac2,16,17. En nuestro estudio, se utilizó el sistema TwoBac para la optimización.

El sistema de baculovirus para la producción de AAV también tiene limitaciones: las partículas de baculovirus son inestables para el almacenamiento a largo plazo en medio libre de suero11, y si el título de baculovirus es bajo, se necesita un gran volumen de sobrenadante de baculovirus, que puede volverse tóxico para el crecimiento de las células Sf9 durante la producción de AAV (observación personal). El uso de células de preservación y ampliación de células infectadas sin título (TIPS), o células de insectos infectadas por baculovirus (BIIC), proporciona una buena opción para la producción de AAV en la que las células Sf9 infectadas por baculovirus se preparan, criopreservan y posteriormente se utilizan para la infección de células Sf9 frescas. Otra ventaja es el aumento de la estabilidad del baculovirus (VB) en las células Sf9 después de la criopreservación10,11.

Se generan dos tipos de células TIPS para permitir la producción de AAV: la primera por infección de células Sf9 con el gen BV-AAV2-GFP o terapéutico, y la segunda por infección de células Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Las células TIPS se criopreservan en alícuotas pequeñas y listas para usar. Los vectores AAV se producen en cultivo de suspensión sin suero en un matraz colocado en un agitador orbital o biorreactor de onda mediante el cultivo conjunto de células TIPS que producen baculovirus y células Sf9 frescas. Las células Sf9 están infectadas por baculovirus que transportan el vector AAV2-GFP y las secuencias rep-cap para generar AAV. Cuatro o cinco días después, cuando los rendimientos de AAV son los más altos, las células productoras se lisan con detergente para liberar las partículas de AAV. El lisado celular se clarifica posteriormente mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas de AAV se purifican a partir del lisado mediante cromatografía en columna AVB Sepharose. Finalmente, los vectores AAV se concentran utilizando TFF. El protocolo describe la producción de AAV a pequeña escala, útil para la investigación y los estudios preclínicos. Sin embargo, los métodos son escalables y compatibles con la fabricación de vectores AAV de grado clínico para aplicaciones de terapia génica.

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Protocol

Consulte la Figura 1 para ver una ilustración que resume el protocolo.

1. Generación de células TIPS infectadas por baculovirus

  1. Descongele un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 50 ml de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora agitadora orbital a 125 rpm y 28 °C en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire8,9. Propague las células en un matraz de 1 L que contenga 200 ml de medio para obtener suficientes células para la producción de células TIPS.
  2. Añadir 50 mL de células Sf9 a 2 x 106 células/ml en dos matraces: infectar un matraz de células Sf9 con 0,5 mL de baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y el otro matraz de células con 0,5 mL de BV-AAV2-rep-cap.
    NOTA: Los plásmidos vectoriales AAV fueron generosamente proporcionados por el Dr. Robert M. Kotin (NIH). La producción de baculovirus a partir de ADN bacmid (Sistema Bac-to-Bac) ha sido descrita previamente8,9. La estabilidad del baculovirus durante el paso es un problema crítico para la ampliación de la producción de rAAV. Es mejor usar un número de paso más bajo de baculovirus (hasta el número de paso 4). Determinar empíricamente el volumen óptimo del sobrenadante de baculovirus comprobando la eficiencia de la infección por baculovirus mediante citometría de flujo (Figura 2) durante la producción de células TIPS.
  3. Monitoree la infección por baculovirus 3-4 días después de la infección tiñendo el baculovirus gp64 en células Sf9 infectadas de la siguiente manera.
    1. Tinción de 2 x 105 células Sf9 (células no infectadas e infectadas por baculovirus) con 0,5 μg de anticuerpo anti-baculovirus gp64 de ratón (1:200) que contiene un colorante fluorescente en 100 μL de tampón de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Lavar las células con 1 ml de PBS para eliminar el anticuerpo y resuspendir las células teñidas en 300 μL de PBS que contengan albúmina sérica bovina al 0,5%.
    3. Analizar la expresión del baculovirus gp64 en células mediante citometría de flujo (Figura 2).
      NOTA: Determinar empíricamente la estrategia de cierre para la adquisición y análisis de citometría de flujo. Se adquiere un total de 10.000 células vivas individuales. La expresión de Baculovirus gp64 en las superficies celulares de Sf9 indica infección por baculovirus. Después de 3-4 días, la mayoría de las células Sf9 se infectan con el baculovirus, como lo demuestra la expresión de baculovirus gp64 (Figura 2).
  4. Cuando las células son 80%-90% viables con un aumento en el diámetro (Figura 3), cosechar las células y criopreservar 1 x 107 células en 1 mL de medio de cultivo de insectos suplementado con 10% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido en un recipiente de congelación lenta a -80 °C. Al día siguiente, transfiera el tubo que contiene las células TIPS a un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Realizar cultivo celular en un gabinete de bioseguridad siguiendo la técnica estándar de laboratorio aséptico en Biosafety Level 2 (BSL-2).

2. Producción de vector AAV

  1. Día 1: Cocultivo de células Sf9 con las células TIPS infectadas por baculovirus
    1. Cultive y cultive células Sf9 naïve a 1 x 106 células/ml a 28 °C en varios matraces de 2 L que contengan 400 ml de medio de cultivo de células de insectos en una incubadora agitadora que se necesita para la producción de AAV. Después de 3-4 días, la densidad celular aumenta hasta 5 x 106-6 x 106 células / ml.
      NOTA: El CO2 y la humedad no son factores importantes para el crecimiento de las células Sf9.
    2. Sembra las células Sf9 ya sea en matraces de agitación o en un biorreactor de la siguiente manera.
      1. Producción de AAV en matraces en una incubadora de agitadores orbitales: Utilice una pipeta o una bomba peristáltica para sembrar 400 mL de cultivo sf9 a 2 x 106 células/ml en un matraz de 2 L asépticamente. Configure el agitador orbital a 125 rpm y 28 °C.
        NOTA Utilice una bomba peristáltica o pipeta estándar dependiendo de la escala de la producción de AAV.
      2. Producción de AAV en un biorreactor: Utilice una bomba peristáltica para sembrar 1 L de cultivo de Sf9 a 2 x 106 células/ml en una bolsa de biorreactor de 10 L de forma aséptica. Cargue la bolsa en la unidad biorreactor para su cultivo a 28 °C. Agregue oxígeno al 40% a la bolsa del biorreactor a 0.1 psi. Configure la unidad de biorreactor en un ángulo de 20° y agite la bolsa a 25 rpm.
    3. Descongele un vial de cada célula TIPS BV-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap. Diluir las células con 20 ml de medio de cultivo de insectos y realizar un recuento de viabilidad de las células utilizando azul de tripano. Inocular ambas células TIPS en una proporción de 1:10.000 en relación con las células Sf9 ingenuas cultivadas en un matraz agitador o biorreactor.
      NOTA: La supervivencia de las células TIPS se reduce debido a la criopreservación, y la tasa de recuperación es de aproximadamente el 50% cuando se determina la viabilidad celular con la tinción azul tripano. Realice un experimento piloto para determinar empíricamente la proporción de células TIPS y células Sf9 ingenuas antes de la producción de rAAV a gran escala.
  2. Día 2: Seguimiento de la cultura
    1. Cosecha 1 mL de cultivo de Sf9 asépticamente. Tinción con el tinte azul Trypan para analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología.
  3. Día 3: Monitoreo de la cultura y alimentación
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Compruebe el estado de la infección por baculovirus después de teñir las células Sf9 como se menciona en el paso 1.3.
      NOTA: El aumento en el diámetro celular y el efecto citopático son indicaciones de infección por baculovirus. El aumento en el diámetro precede a una disminución en la viabilidad de la célula, y estos parámetros se utilizan para determinar el tiempo de cosecha de células durante la producción de AAV. Determine empíricamente el punto de tiempo óptimo.
    2. Alimente el cultivo Sf9 con medio de cultivo de insectos frescos en una proporción de 1: 5 asépticamente.
  4. Día 4: Seguimiento de la cultura
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Desconecte el suministro de oxígeno de la bolsa del biorreactor.
  5. Día 5: Seguimiento de la cultura y cosecha
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Cosechar el medio de cultivo y las células cuando la viabilidad de las células Sf9 haya disminuido a alrededor del 50%(Figura 4).
    2. Girar la suspensión celular a 2100 x g durante 15 min a 4 °C. Recoge el sobrenadante y el pellet celular y guárdalos a -80 °C.

3. Lisis de las células y liberación de AAV

  1. Descongelar el pellet de célula productora AAV. Añadir 100 mL de tampón de lisis celular (20 mM Tris-HCl pH 8.0, cloruro de sodio 150 mM, 0.5 % Triton-X-100) al pellet celular, mezclar vigorosamente e incubar durante 30 min a temperatura ambiente para liberar las partículas AAV.
  2. Centrifugar a 2100 × g durante 30 min a 4 °C y transferir el lisado celular a un nuevo recipiente. Mezcle el lisado celular y el sobrenadante de cultivo celular después de la descongelación.
  3. Añadir 20 U/mL de nucleasa y 10 mM de MgCl2 al lisado celular para digerir el ADN y el ARN. Incubar durante 2-4 h a 37 °C.
  4. Filtre el lisado a través de un sistema de filtración dual de 0,8 μm y 0,2 μmpolyethersulfone utilizando una bomba.
  5. Guarde el lisado celular clarificado a 4 °C durante la noche o purifique el AAV inmediatamente.

4. Purificación del vector AAV mediante sistema de cromatografía de columna de afinidad

  1. Prepare el instrumento de cromatografía lavando secuencialmente la muestra y las líneas tampón con agua estéril, hidróxido de sodio 1 N, agua y solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4) a una velocidad de flujo de 50 ml / min.
  2. Monte la columna AVB Sepharose (10.0 mL) en el sistema de cromatografía y ejecute 100 mL de PBS a un caudal de 5 mL / min.
    NOTA: Utilice un volumen menor o mayor de columna avB Sepharose dependiendo de la escala de producción de AAV y configure el caudal según lo sugerido por el fabricante de la columna o resina (consulte la Tabla de materiales).
  3. Para recoger las fracciones de la solución de paso de columna, el tampón de lavado y el tampón de elución que contienen partículas AAV, inserte tubos en las ranuras del colector de fracciones del instrumento de cromatografía.
  4. Equilibre la columna con PBS a un caudal de 5,0 mL/min.
  5. Cargue el lisado de celda filtrada que contiene partículas AAV en la columna utilizando la máquina de cromatografía equipada con una bomba de muestras. Ejecute la muestra a un caudal de 3,0 ml por minuto.
  6. Ejecute PBS a través de la columna avB Sepharose a una velocidad de flujo de 3.0 mL / min hasta que la curva de absorbancia ultravioleta (UV) (280 nm) regrese a la línea de base y se vuelva estable.
  7. Eluya las partículas AAV de la columna con un tampón de citrato de sodio (pH 3.0) de 50 mM a un caudal de 3.0 mL/min (Figura 5).
    NOTA: Mientras que las partículas AAV se disocian de la resina y pasan a través del detector UV, se puede ver un pico de elución de proteína en el cromatograma.
  8. Diluya inmediatamente el sobrenadante AAV con un quinto de volumen de 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) para aumentar el pH del AAV que contiene sobrenadante a aproximadamente pH 5.5 para evitar la degradación mediada por pH con tampón de elución ácida. Además, diluya el sobrenadante AAV 10 veces con PBS para neutralizar completamente el pH.
    NOTA: El valor de pH es de aproximadamente 5,5 después de neutralizar la solución rAAV. Después de neutralizar el AAV, diluya la solución de rAAV 10 veces con PBS (pH 7.4) para que el AAV esté en un tampón fisiológico.
  9. Almacene 1 ml de cada columna de muestras de recorrido, tampón de lavado y 100 μL del sobrenadante AAV eluido para evaluar la presencia de AAV por infección de las células diana.
  10. Limpie la columna de sefalrosa AVB con 100 ml de ácido cítrico 100 mM (pH 2.1) y 100 ml de PBS (pH7.4) a un caudal de 5.0 ml / min. Enjuague la columna con etanol al 20% a un caudal de 5,0 ml/min y guárdelo a 4 °C.
  11. Limpie las tuberías del instrumento de cromatografía con la posición de la columna fuera de línea como se describe en la sección 4.1. Finalmente, enjuague el sistema de cromatografía con 200 ml de etanol al 20% a una velocidad de flujo de 50,0 ml / min y almacene en etanol al 20%.

5. Concentración y diafiltración del vector AAV mediante filtración de flujo tangencial (TFF)

  1. Configure el sistema TFF equipado con un cartucho de membrana de polisulfona (100 kDa Molecular Weight Cut Off) para concentrar el AAV.
  2. Equilibrar el módulo TFF con 200 mL de PBS durante 10 min.
  3. Cargue la muestra AAV controlando el flujo de la bomba hasta que la muestra se reduzca al volumen deseado mientras mantiene una presión transmembrana a 2-3 psi.
  4. Diafiltrar el retentato con 100 ml de PBS, como se utiliza en este estudio, o definir empíricamente un tampón alternativo que apoye la estabilidad a largo plazo de AAV.
  5. Después de concentrar la muestra de AAV al volumen deseado, recoja la muestra de AAV, filtre a través de un polietersulfonefonercer de 0,2 μm, alícuota y luego guárdela a -80 °C.

6. Infección de muestras de AAV en las células diana para evaluar la presencia de AAV en las etapas de purificación

  1. Inocular 7 x 104 células HT1080/pozo en una placa de 24 pocillos en 500 μL de Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio y 10% de suero fetal bovino (FBS) el día antes de la infección. Cultive las células en una incubadora a 37 °C y 5% CO2.
  2. Cuente las células antes de la infección. Agregue la muestra a granel de AAV diluida no purificada antes de la ejecución de la columna, las muestras de ejecución de la columna, el tampón de lavado y la muestra de AAV purificada eluida.
    NOTA: Cuente las células teñidas de azul de Tripano con un hemocitómetro. Determinar empíricamente el factor de dilución y el volumen (μL) de las muestras de AAV. Cuanto más altos sean los títulos de AAV, más dilución se necesita. Asegúrese de que las partículas de baculovirus de la muestra a granel no purificada antes de que la columna funcione, las muestras de ejecución de columna, el tampón de lavado se inactiven por calor a 50 ° C durante 50 minutos antes de infectar las células objetivo para determinar los títulos infecciosos de AAV.
  3. Dos días después de la infección, analice la expresión de proteínas (por ejemplo, GFP o gen terapéutico) en las células utilizando un citómetro de flujo.
  4. Calcule los títulos infecciosos de AAV utilizando el número de células en el momento de la infección, el factor de dilución y el porcentaje de células GFP + con la fórmula: (Número total de células x Porcentajes de células GFP + x Factor de dilución) / Volumen de AAV en mililitros.
    NOTA: Por ejemplo, el número de células es 1 x 105, el porcentaje de células GFP+ es del 3,4%, el factor de dilución es 100 y el volumen de AAV añadido es de 2 μL. El título de AAV es de 1,7 x 108 unidades infecciosas (UI)/ml. La cantidad total de partículas AAV purificadas en 25 mL de la fracción eluida es de 4,3 x 109 unidades infecciosas (UI)/ml (Figura 6). El número total de partículas AAV iniciales no purificadas es de 1,09 x10 10 UI/ml, y las partículas AAV purificadas son 4,3 x 109 UI/ml. Por tanto, el porcentaje de recuperación es del 39,4%. El porcentaje de células GFP+ debe estar entre el 1% y el 30%, lo que corresponde a un rango lineal cuando se utiliza para calcular el título infeccioso de AAV. Si se infectan partículas vectoriales AAV más concentradas en las células diana; existe la posibilidad de que múltiples copias de las partículas AAV puedan infectar una sola célula que se mostrará como una sola copia del vector. Por lo tanto, diluya el sobrenadante del vector AAV para obtener una infección vectorial del 1% -30% en las células objetivo. Si el vector AAV no tiene un gen informador, tiñe el transgén o el gen terapéutico expresado por el vector AAV con un anticuerpo que contenga un colorante fluorescente que pueda detectarse y cuantificarse utilizando un citómetro de flujo. No todos los serotipos AAV pueden infectar eficientemente las células HT1080. Por lo tanto, para realizar el ensayo de infectividad para otros serotipos AAV, use diferentes líneas celulares. Titule las partículas AAV2-GFP antes de la purificación y después de la purificación en las células HT1080 y mida la expresión de GFP por citometría de flujo. Calcule la recuperación (%) por la relación entre el número de partículas AAV purificadas y el número de partículas AAV antes de la purificación multiplicado por 100.

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Representative Results

Aquí, se muestran los resultados representativos del desarrollo de procesos para la producción y purificación de vectores AAV utilizando el sistema de células de insectos Sf9. El método incluye el cocultivo de células Sf9 con células TIPS infectadas por baculovirus, la alimentación de las células con medio de crecimiento, la recolección y lisis de las células productoras para liberar las partículas AAV, la clarificación del lisado celular con tratamiento con nucleasa, centrifugación y filtración, purificación de AAV mediante cromatografía de afinidad AVB Sepharose y concentración con TFF(Figura 1).

Las células TIPS se generan por infección de BV-AAV2-GFP o gen terapéutico y BV-AAV2-rep-cap en células Sf9 por separado. La mayoría de las células Sf9 se infectan con el baculovirus en 3-4 días debido a las múltiples rondas de infección, evidenciadas por la expresión de la glicoproteína gp64 del baculovirus en (Figura 2) y las células muestran un aumento en el diámetro (Figura 3). Las células TIPS se cosechan 3-4 días después de la infección y se criopreservan. Las células Sf9 se cocultivan con las células TIPS que secretan partículas de baculovirus en el medio de cultivo que infectan las células Sf9 naïve. El baculovirus es competente para la replicación; por lo tanto, el número de células infectadas aumenta rápidamente por múltiples infecciones redondas con partículas de baculovirus recién producidas que se secretan en el medio de cultivo8,9. Las células muestran un aumento en el diámetro, el efecto citopático, y alrededor de la mitad de las células mueren en 5 días después de la infección, que son los signos de finalización de la producción de AAV(Figura 4).

Las células productoras de AAV se cosechan por centrifugación de baja velocidad, lisadas con tampón que contiene detergente para liberar el AAV en el lisado celular. Esto se trata con nucleasa para la digestión de ADN y ARN para reducir la viscosidad, se filtra a través de una membrana de 0,8 μm y 0,2 μm, y posteriormente se purifica y concentra. El lisado celular se carga en una columna de sefalrosa AVB utilizando un sistema de cromatografía. La resina AVB Sepharose se une a las partículas de AAV2 debido a su afinidad con las proteínas de la cápside. El tampón de lavado se ejecuta a través de la columna de sefalrosa AVB para eliminar los materiales desatados y sueltos hasta que la curva de absorbancia ultravioleta (UV) (280 nm) se vuelva estable en la línea de base. Dado que las partículas AAV se unen fuertemente a AVB Sepharose, no se detecta un número significativo de partículas AAV2 durante el lavado. Las partículas AAV se eluyen con tampón ácido (pH 3.0), que disocia la interacción entre las partículas AAV y la resina AVB Sepharose. Para evitar la degradación mediada por pH del AAV por la solución ácida, el eluyente se neutraliza con un tampón alcalino (pH 8.0). Se observa un pico de proteína mientras se produce elución con tampón ácido correspondiente a la fracción AAV(Figura 5 y Figura 6). El AAV purificado se diluye 10 veces con PBS, se concentra y se intercambia con un sistema TFF. En este ejemplo, las partículas totales de AAV en lisado celular (560 mL) son 1.1 x 1014 genoma vectorial (vg), después de la purificación de cromatografía AVB Sepharose (25 mL) son 4.1 x 1013 vg, y después de la concentración con TFF (25 mL) son 2.4 x 1013 vg. Las muestras de AAV purificadas muestran tres proteínas de cápside distintas, VP1, VP2 y VP3, después de SDS-PAGE y tinción de plata (Figura 7)

Figure 1
Figura 1: Un diagrama esquemático para la producción y purificación de AAV Vector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de citometría de flujo de la expresión de baculovirus gp64 en células Sf9. Las células Sf9 infectadas por baculovirus se tiñen con un anticuerpo anti-baculovirus gp64 de ratón que contiene un colorante fluorescente, que se detecta mediante citometría de flujo. (A) Células Sf9 no infectadas. (B) Las células Sf9 infectadas por Baculovirus muestran expresión de gp64 en la mayoría de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Morfología de las células Sf9 infectadas por baculovirus (TIPS). El baculovirus se infecta en las células Sf9 para producir las células TIPS. (A) Células Sf9 no infectadas. (B) Células Sf9 infectadas por Baculovirus (TIPS). Las células se muestran con un aumento de 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Morfología de las células Sf9 infectadas por baculovirus durante la producción de AAV. Las células TIPS secretan baculovirus que infectan células Sf9 naïve cocultivadas durante la producción de AAV. (A) Células Sf9 no infectadas. (B) Las células Sf9 infectadas por baculovirus muestran un aumento en el diámetro. Cinco días después de la infección, casi la mitad de las células mueren (visualizadas bajo un microscopio de fase invertida después de la tinción azul tripano). Las flechas rojas indican células vivas y las flechas azules indican células muertas. Las células se muestran con un aumento de 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Purificación AAV mediante cromatografía de columna AVB Sepharose. Un cromatograma muestra la absorbancia de muestras de proteínas a 280 nm durante la carga de muestras en columna, lavado y elución. El cromatograma ha sido modificado para encajar en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6:El número de partículas infecciosas de AAV en el flujo durante la carga en la columna, el lavado y la elución. Un total de 560 ml de muestras de AAV se cargan en una columna de sefalrosa AVB de 10 ml. El volumen de fracción para la carga de la columna es de 50 ml, el lavado de columna es de 50 ml y la elución es de 25 ml. Los títulos de AAV se miden después de la infección de las células HT1080 con las muestras de paso de la columna mientras se cargan en la columna, el lavado y la elución para investigar la presencia de AAV en cada paso de la purificación. El rendimiento total de AAV purificado es de 4,3 x 109 unidades infecciosas. Cada símbolo en forma de diamante representa las unidades infecciosas (UI) de AAV en cada fracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. SDS-PAGE y tinción de plata del vector AAV puro que muestra proteínas de la cápside. Las muestras AAV reducidas se ejecutan en SDS-PAGE y se realiza la tinción de plata. Tres bandas distintas de proteínas de la cápside AAV, VP1, VP2 y VP3, son visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los parámetros utilizados en este protocolo para el desarrollo del proceso de producción, purificación y concentración de vectores AAV se pueden aplicar tanto a la fabricación a pequeña como a gran escala de vectores AAV para aplicaciones de terapia génica. Todo el proceso ascendente y descendente se puede realizar en un sistema cerrado compatible con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales. Las principales ventajas del sistema Sf9-baculovirus son la escalabilidad para la producción de AAV de grado GMP a gran escala a un costo asequible. El sistema no necesita plásmidos y reactivos de transfección costosos, que son necesarios para la producción de AAV utilizando células HEK293. Se ha informado que tanto las células HEK293 como las células Sf9 producen vectores AAV de calidad similar (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Resumen # 100). El mayor desafío es que este sistema requiere la generación de baculovirus y células TIPS que necesitan un tiempo y esfuerzo significativos.

En este protocolo, se utilizaron dos tipos de células TIPS (sistema TwoBac): una célula TIPS que contiene baculovirus con cassette de transferencia de genes AAV y otra célula TIPS que contiene AAV-rep-cap. El sistema OneBac2,16,17 puede generar células TIPS que contienen tanto casete de transferencia de genes AAV como genes rep-cap en un solo baculovirus. El sistema OneBac proporciona un enfoque alternativo para producir el rAAV utilizando solo un conjunto de celdas TIPS en lugar de dos como se describe en el sistema TwoBac, lo que simplificaría aún más el protocolo.

Este protocolo describe la producción de AAV en células Sf9. Es importante optimizar la proporción de las células TIPS infectadas por baculovirus con las células Sf9 ingenuas productoras para obtener un buen rendimiento de AAV. Si esta relación es subóptima, el rendimiento de AAV se reducirá11. Por ejemplo, si se generan más vectores de transferencia de genes que contienen AAV ITR que las cápsides en las células productoras debido a la proporción subóptima de TIPS y células productoras, todos los vectores de transferencia de genes disponibles no obtendrán suficientes cápsides para producir partículas AAV completas. Por otro lado, si se generan más cápsides que los vectores de transferencia del gen AAV en las células productoras, todas las cápsides no obtendrán AAV ITR que contenga vectores de transferencia de genes que resulten en partículas AAV vacías.

A medida que las células se multiplican, los nutrientes del medio de cultivo se agotan y los productos de desecho metabólicos se acumulan. Por lo tanto, la suplementación de un medio de crecimiento fresco al 20% en el cultivo celular 2 días después del cocultivo de células TIPS y células Sf9 puede aumentar significativamente los títulos de AAV (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, comunicación personal).

La pureza de las partículas AAV es un factor crítico para lograr la transducción efectiva de las células diana sin ninguna citotoxicidad para estudios tanto in vitro como in vivo 3,5. Por lo tanto, es importante incluir un paso de cromatografía que pueda purificar selectivamente las partículas de AAV y eliminar impurezas como proteínas y desechos de células huésped, ADN genómico y baculoviral, y vectores agregados y fragmentados. Al cargar el sobrenadante AAV en una columna avb sefarosa, es fundamental verificar las muestras de flujo continuo para detectar la presencia de partículas AAV que pueden pasar a través de la columna sin unirse a la resina. Si ese es el caso, (1) se necesitará una velocidad de funcionamiento más baja que resulte en un tiempo de residencia más largo para unir las partículas AAV, (2) se debe reducir la cantidad de muestra cargada en la columna y / o (3) se debe aumentar el volumen de la sefalrosa AVB, de modo que la capacidad de unión de la columna nunca exceda el número de partículas AAV. La capacidad de la resina AVB Sepharose para unirse a las partículas AAV a un alto caudal y con alta afinidad y capacidad es importante para reducir el tiempo de purificación. La principal limitación de AVB Sepharose es que se une a la cápside de los serotipos AAV 1, 2 y 5. Por lo tanto, se deben probar diferentes resinas de cromatografía y utilizarlas para la purificación de otros serotipos AAV18. El protocolo de purificación aguas abajo descrito en este documento también se puede utilizar para purificar el AAV producido en células HEK 293.

Este protocolo puede purificar el AAV del lisado celular, pero no puede eliminar las partículas vacías. Algunos artículos han descrito métodos que pueden distinguir partículas AAV vacías vs. llenas en existencias de AAV purificadas19,20. Sin embargo, creemos que la producción de AAV debe optimizarse a nivel de proceso aguas arriba para minimizar la generación de partículas vacías. Si la proporción del vector de transferencia de genes AAV y la producción de cápside en las células productoras no son óptimas, se pueden generar más partículas vacías.

Además de unirse a partículas AAV completas, el medio AVB Sepharose se une a partículas AAV fragmentadas o proteínas de la cápside que se pueden eliminar usando TFF. La mayoría de las partículas de bajo peso molecular se eliminan de las muestras de AAV al incluir el paso TFF aguas abajo de la cromatografía de columna. Además, TFF se utiliza para realizar un intercambio tampón / diafiltración y para concentrar el AAV10,21.

Aunque la ultracentrifugación del lisado AAV con cloruro de cesio o gradiente de iodixanol es el método preferido para la purificación de AAV a pequeña escala y de grado preclínico, este método no es escalable y menos adecuado para la purificación a gran escala de AAV21,22.

En conclusión, este protocolo para el desarrollo del proceso de producción y purificación de AAV será útil para la fabricación preclínica a pequeña escala y a gran escala de AAV recombinante para la terapia génica de enfermedades genéticas hereditarias.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Dr. Robert M. Kotin (Instituto Nacional del Corazón, la Sangre y los Pulmones, NIH) por proporcionarnos generosamente los plásmidos AAV y a Danielle Steele y Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) por su asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por el fondo Start-Up de Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
2 L flasks ThermoFisher Scientific 431281 Flask for suspension culture
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of supernatants
24-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Adherent cell culture plate
250 mL flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software Cytiva 28976337 Chromatography system
AVB Sepharose High Performance Cytiva 28411210 Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP In-house non-catalog AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap In-house non-catalog AAV packaging vector
Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer Santa Cruz Biotechnologies 516214 Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer In-house Non-catalog item 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L Cytiva 28937662 Bioreactor bag
Cleaning buffer In-house Non-catalog item 100 mM citric acid (pH 2.1) 
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For cryopreservation
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Elution buffer In-house Non-catalog item 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit  Pall Corporation 12941 Membrane filter
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media Cytiva SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump Pall Corporation Non-catalog item TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
Microscope Nikon Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody Santa Cruz Biotechnologies 65498 PE Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank Praxair Non-catalog item 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS ThermoFisher Scientific 20012027 Wash buffer
Silver Staining kit ThermoFisher Scientific LC6100 Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Steile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge Pall Corporation OA100C12 TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0 ThermoFisher 15568025 Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50 Cytiva 28-9378-00 Bioreactor

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References

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

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Biología Número 179 AAV baculovirus células Sf9 biorreactor cromatografía purificación filtración de flujo tangencial
Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto
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Nasimuzzaman, M., Villaveces, S., van der Loo, J. C. M., Alla, S. Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System. J. Vis. Exp. (179), e62829, doi:10.3791/62829 (2022).

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