Summary
In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.
Abstract
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind vielversprechende Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. Hier wird der AAV2-Vektor durch Kokultur von Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen mit Sf9-Zellen hergestellt, die mit Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutischem Gen) und BV-AAV2-rep-cap in serumfreier Suspensionskultur infiziert sind. Zellen werden in einem Kolben in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor kultiviert. Um die AAV-Partikel freizusetzen, werden die Produzentenzellen in einen reinigungsmittelhaltigen Puffer lysiert, der anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt wird. AAV-Partikel werden aus dem Zelllysat mit hilfe der AVB Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt, die AAV-Partikel bindet. Gebundene Partikel werden mit PBS gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und mit Natriumcitratpuffer bei pH 3,0 aus dem Harz eluiert. Das saure Eluat wird mit alkalischem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und mit tangentialer Strömungsfiltration (TFF) weiter konzentriert. Das Protokoll beschreibt die kleinmaßstäbliche präklinische Vektorproduktion, die mit der Scale-up- bis zur groß angelegten AAV-Herstellung in klinischer Qualität für humane Gentherapieanwendungen kompatibel ist.
Introduction
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind unbehüllte humane Parvoviren, die eine einzelsträngige DNA von 4,6 kb enthalten. AAV-Vektoren haben mehrere Vorteile gegenüber anderen viralen Vektoren für Gentherapieanwendungen1,2,3,4. AAVs sind von Natur aus replikationsinkompetent und benötigen daher einen Hilfsvirus und eine Host-Maschinerie für die Replikation. AAVs verursachen keine Krankheit und haben eine geringe Immunogenität im infizierten Wirt3,5. AAV kann sowohl ruhende als auch sich aktiv teilende Zellen infizieren und kann als Episom bestehen bleiben, ohne sich in das Genom der Wirtszellen zu integrieren (AAV integriert sich selten in das Wirtsgenom)1,3. Diese Eigenschaften haben AAV zu einem wünschenswerten Werkzeug für Gentherapieanwendungen gemacht.
Um einen AAV-Gentransfervektor zu erzeugen, wird die Transgenkassette einschließlich des therapeutischen Gens zwischen zwei internen terminalen Wiederholungen (ITRs) kloniert, die typischerweise vom AAV-Serotyp 2 abgeleitet sind. Die maximale Größe von 5' ITR bis 3' ITR, einschließlich der Transgensequenz, beträgt 4,6 kb6. Verschiedene Kapside können einen unterschiedlichen Zell- oder Gewebetropismus haben. Daher sollten Kapside basierend auf dem Gewebe oder Zelltyp ausgewählt werden, der mit demAAV-Vektor 7anvisiert werden soll.
Rekombinante AAV-Vektoren werden üblicherweise in Säugetierzelllinien wie humanen embryonalen Nierenzellen, HEK293 durch vorübergehende Transfektion des AAV-Gentransfervektors, AAV-Rep-Cap und Helfervirusplasmiden2,3produziert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die großflächige AAV-Produktion durch transiente Transfektion von adhärenten HEK293-Zellen. Zunächst wird eine große Anzahl von Zellstapeln oder Rollflaschen benötigt. Zweitens werden hochwertige Plasmid-DNA und Transfektionsreagenzien benötigt, was die Herstellungskosten erhöht. Schließlich wird bei der Verwendung von adhärenten HEK293-Zellen das Serum häufig für eine optimale Produktion benötigt, was die nachgelagerte Verarbeitungerschwert 1,2,3. Eine alternative Methode der AAV-Herstellung beinhaltet die Verwendung der Insektenzelllinie, Spodoptera frugiperda (Sf9) -Zellen und eines Insektenvirus namens rekombinantes Autographa californica Multicapsid-Kernpolyedrosevirus (AcMNPV oder Baculovirus)8,9,10. Sf9-Zellen werden in serumfreier Suspensionskultur gezüchtet, die leicht zu skalieren ist und mit der aktuellen cGMP-Produktion (Good Manufacturing Practice) in großem Maßstab kompatibel ist, die keine Plasmid- oder Transfektionsreagenzien erfordert. Darüber hinaus sind die Kosten für die AAV-Produktion unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Systems niedriger als die Kosten für die vorübergehende Transfektion von Plasmiden in HEK293-Zellen11.
Das ursprüngliche rAAV-Produktionssystem unter Verwendung von Baculovirus-Sf9-Zellen verwendete drei Baculoviren: eine Baculovirus-haltige Gentransferkassette, das zweite Baculovirus-haltiges Rep-Gen und das dritte Baculovirus, das Serotyp-spezifisches Kapsid-Gen12,13. Das Baculovirus-haltige Rep-Konstrukt war jedoch bei mehreren Passagengängen genetisch instabil, was eine Amplifikation des Baculovirus für die großflächige AAV-Produktion verhinderte. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neuartiges rAAV-Vektorsystem entwickelt, das zwei Baculoviren (TwoBac) enthielt: ein Baculovirus, das die AAV-Gentransferkassette enthielt, und ein anderes Baculovirus, das die AAV-Rep-Cap-Gene zusammen enthält, die genetisch stabiler sind als das ursprüngliche System und bequemer zu produzieren rAAV, da TwoBac anstelle von drei14verwendet wird. 15. Das OneBac-System verwendet die AAV-Gentransferkassette und die Rep-Cap-Gene in einem einzigen Baculovirus, das aufgrund der Verwendung eines Baculovirus anstelle von TwoBac oder ThreeBac 2,16 ,17bequemerist,um das rAAV herzustellen. In unserer Studie wurde das TwoBac-System zur Optimierung eingesetzt.
Das Baculovirus-System für die AAV-Produktion hat auch Einschränkungen: Baculovirus-Partikel sind instabil für die Langzeitlagerung in serumfreiem Medium11, und wenn der Baculovirus-Titer niedrig ist, wird eine große Menge an Baculovirus-Überstand benötigt, der für das Wachstum von Sf9-Zellen während der AAV-Produktion toxisch werden kann (persönliche Beobachtung). Die Verwendung von TITERLOSEN INFIZIERTEN ZELLKONSERVIERUNGS- UND SCALE-UP-ZELLEN (TIPS) oder Baculovirus-infizierten Insektenzellen (BIIC) bietet eine gute Option für die AAV-Produktion, bei der Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen vorbereitet, kryokonserviert und anschließend für die Infektion von frischen Sf9-Zellen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil ist die erhöhte Stabilität des Baculovirus (BV) in Sf9-Zellen nach Kryokonservierung10,11.
Zwei Arten von TIPS-Zellen werden erzeugt, um die AAV-Produktion zu ermöglichen: die erste durch Infektion von Sf9-Zellen mit dem BV-AAV2-GFP oder therapeutischen Gen und die zweite durch Infektion von Sf9-Zellen mit BV-AAV2-rep-cap. TIPS-Zellen werden in kleinen und gebrauchsfertigen Aliquots kryokonserviert. AAV-Vektoren werden in serumfreier Suspensionskultur in einem Kolben hergestellt, der in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor platziert wird, indem TIPS-Zellen, die Baculoviren und frische Sf9-Zellen produzieren, mitkulturiert werden. Sf9-Zellen sind mit Baculoviren infiziert, die den AAV2-GFP-Vektor und die Rep-Cap-Sequenzen tragen, um AAV zu erzeugen. Vier bis fünf Tage später, wenn die AAV-Ausbeute am höchsten ist, werden die Produzentenzellen mit Reinigungsmittel lysiert, um die AAV-Partikel freizusetzen. Das Zelllysat wird anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. AAV-Partikel werden durch AVB-Sepharose-Säulenchromatographie aus dem Lysat gereinigt. Schließlich werden AAV-Vektoren mit TFF konzentriert. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von AAV in kleinem Maßstab, nützlich für Forschung und präklinische Studien. Die Methoden sind jedoch skalierbar und kompatibel mit der Herstellung klinischer AAV-Vektoren für Gentherapieanwendungen.
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Protocol
In Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung, die das Protokoll zusammenfasst.
1. Erzeugung von Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen
- Tauen Sie eine Durchstechflasche mit Sf9-Zellen auf und säen Sie sie sofort in 50 ml Insektenzellkulturmedium. Es werden Sf9-Zellen in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 125 U/min und 28 °C in Rundkolben mit einer lose angebrachten Kappe zum Luftaustausch8,9 gezüchtet. Vermehren Sie die Zellen in einem 1-Liter-Kolben mit 200 ml Medium, um genügend Zellen für die Produktion von TIPS-Zellen zu erhalten.
- 50 ml Sf9-Zellen bei 2 x 10 6 Zellen/ml in zweiKolben geben: Infizieren Sie einen Kolben Sf9-Zellen mit 0,5 ml Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutisches Gen) und den anderen Zellkolben mit 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
HINWEIS: AAV-Vektorplasmide wurden großzügig von Dr. Robert M. Kotin (NIH) zur Verfügung gestellt. Die Baculovirus-Produktion aus Bacmid-DNA (Bac-to-Bac-System) wurde bisher beschrieben8,9. Die Baculovirus-Stabilität während der Passage ist ein kritisches Problem für die Scale-up-Produktion von rAAV. Es ist besser, eine niedrigere Passagenzahl des Baculovirus (bis zur Passage Nummer 4) zu verwenden. Bestimmen Sie das optimale Volumen des Baculovirus-Überstandes empirisch, indem Sie die Baculovirus-Infektionseffizienz mithilfe der Durchflusszytometrie (Abbildung 2) während der TIPS-Zellproduktion überprüfen. - Überwachen Sie die Baculovirus-Infektion 3-4 Tage nach der Infektion, indem Sie Baculovirus gp64 in infizierten Sf9-Zellen wie folgt färben.
- Färben Sie 2 x 105 Sf9-Zellen (sowohl nicht infizierte als auch Baculovirus-infizierte Zellen) mit 0,5 μg Maus-Anti-Baculovirus-gp64-Antikörper (1:200), der einen fluoreszierenden Farbstoff in 100 μL Blockierpuffer enthält, für 30 min bei Umgebungstemperatur.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS, um den Antikörper zu entfernen, und resuspendieren Sie die gefärbten Zellen in 300 μL PBS, die 0,5% Rinderserumalbumin enthalten.
- Analysieren Sie die Baculovirus gp64-Expression auf Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
HINWEIS: Bestimmen Sie die Gating-Strategie für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie empirisch. Insgesamt werden 10.000 einzelne lebende Zellen gewonnen. Die Baculovirus gp64-Expression auf Sf9-Zelloberflächen weist auf eine Baculovirus-Infektion hin. Nach 3-4 Tagen infizieren sich die meisten Sf9-Zellen mit dem Baculovirus, wie die Baculovirus gp64-Expression zeigt (Abbildung 2).
- Wenn die Zellen 80%-90% lebensfähig sind mit einer Erhöhung des Durchmessers(Abbildung 3),ernten sie die Zellen und kryokonservieren 1 x 107 Zellen in 1 ml Insektenkulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid in einem langsam gefrierenden Behälter bei -80 °C. Am nächsten Tag das Röhrchen mit TIPS-Zellen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank geben.
HINWEIS: Führen Sie die Zellkultur in einer Biosicherheitswerkbank nach der standardmäßigen aseptischen Labortechnik der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durch.
2. Herstellung des AAV-Vektors
- Tag 1: Co-Kultur von Sf9-Zellen mit den Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen
- Kultivieren und züchten Sie naive Sf9-Zellen bei 1 x10 6 Zellen/ml bei 28 °C in mehreren 2-Liter-Kolben mit 400 ml Insektenzellkulturmedium in einem Shaker-Inkubator, der für die AAV-Produktion benötigt wird. Nach 3-4 Tagen wird die Zelldichte auf 5 x 106 -6x 106 Zellen/ml erhöht.
HINWEIS: CO2 und Luftfeuchtigkeit sind keine wichtigen Faktoren für das Wachstum von Sf9-Zellen. - Säen Sie die Sf9-Zellen entweder in Schüttelkolben oder in einem Bioreaktor wie folgt aus.
- AAV-Produktion in Kolben in einem Orbital-Shaker-Inkubator: Verwenden Sie eine Pipette oder eine Peristaltikpumpe, um 400 ml Sf9-Kultur bei 2 x 106 Zellen / ml aseptisch in einen 2-Liter-Kolben zu säen. Richten Sie den Orbitalschüttler bei 125 U/min und 28 °C ein.
HINWEIS Verwenden Sie je nach Umfang der AAV-Produktion eine Peristaltikpumpe oder eine Standardpipette. - AAV-Produktion in einem Bioreaktor: Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um 1 L Sf9-Kultur bei 2 x 106 Zellen / ml aseptisch in einen 10 L Bioreaktorbeutel zu säen. Laden Sie den Beutel zur Kultivierung bei 28 °C auf die Bioreaktoreinheit. Fügen Sie dem Bioreaktorbeutel bei 0,1 psi 40% Sauerstoff hinzu. Stellen Sie die Bioreaktoreinheit in einem Winkel von 20° auf und schütteln Sie den Beutel mit 25 U / min.
- AAV-Produktion in Kolben in einem Orbital-Shaker-Inkubator: Verwenden Sie eine Pipette oder eine Peristaltikpumpe, um 400 ml Sf9-Kultur bei 2 x 106 Zellen / ml aseptisch in einen 2-Liter-Kolben zu säen. Richten Sie den Orbitalschüttler bei 125 U/min und 28 °C ein.
- Tauen Sie eine Durchstechflasche mit jedem BV-AAV2-GFP (oder therapeutischen Gen) und BV-AAV2-rep-cap TIPS-Zellen auf. Verdünnen Sie die Zellen mit 20 ml Insektenkulturmedium und führen Sie eine Lebensfähigkeitszählung der Zellen mit Trypanblau durch. Impfen Sie beide TIPS-Zellen in einem Verhältnis von 1:10.000 relativ zu den naiven Sf9-Zellen, die in einem Schüttlerkolben oder Bioreaktor kultiviert wurden.
HINWEIS: Das Überleben der TIPS-Zellen ist aufgrund der Kryokonservierung reduziert, und die Erholungsrate beträgt ungefähr 50%, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypanblaufärbung bestimmt wird. Führen Sie ein Pilotexperiment durch, um das Verhältnis von TIPS-Zellen und naiven Sf9-Zellen vor der groß angelegten rAAV-Produktion empirisch zu bestimmen.
- Kultivieren und züchten Sie naive Sf9-Zellen bei 1 x10 6 Zellen/ml bei 28 °C in mehreren 2-Liter-Kolben mit 400 ml Insektenzellkulturmedium in einem Shaker-Inkubator, der für die AAV-Produktion benötigt wird. Nach 3-4 Tagen wird die Zelldichte auf 5 x 106 -6x 106 Zellen/ml erhöht.
- Tag 2: Kulturmonitoring
- Ernte 1 ml Sf9-Kultur aseptisch. Färben Sie mit dem blauen Farbstoff Trypan, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie zu analysieren.
- Tag 3: Kulturüberwachung und Fütterung
- Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Überprüfen Sie den Status der Baculovirus-Infektion nach dem Färben der Sf9-Zellen wie in Schritt 1.3 beschrieben.
HINWEIS: Die Zunahme des Zelldurchmessers und die zytopathische Wirkung sind Hinweise auf eine Baculovirus-Infektion. Die Zunahme des Durchmessers geht einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit voraus, und diese Parameter werden verwendet, um die Zellerntezeit während der AAV-Produktion zu bestimmen. Ermitteln Sie den optimalen Zeitpunkt empirisch. - Füttern Sie die Sf9-Kultur mit frischem Insektenkulturmedium im Verhältnis 1:5 aseptisch.
- Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Überprüfen Sie den Status der Baculovirus-Infektion nach dem Färben der Sf9-Zellen wie in Schritt 1.3 beschrieben.
- Tag 4: Kulturmonitoring
- Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Trennen Sie die Sauerstoffzufuhr vom Bioreaktorbeutel.
- Tag 5: Kulturüberwachung und Ernte
- Ernten Sie 1 ml Sf9-Kultur und analysieren Sie die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie. Ernten Sie das Kulturmedium und die Zellen, wenn die Lebensfähigkeit der Sf9-Zellen auf etwa 50% gesunken ist (Abbildung 4).
- Die Zellsuspension bei 2100 x g für 15 min bei 4 °C drehen. Sammeln Sie den Überstand und das Zellpellet und lagern Sie sie bei -80 °C.
3. Lyse von Zellen und Freisetzung von AAV
- Tauen Sie das AAV-Erzeugerzellpellet auf. 100 ml Zelllysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid, 0,5 % Triton-X-100) in das Zellpellet geben, kräftig mischen und 30 min bei Umgebungstemperatur inkubieren, um die AAV-Partikel freizusetzen.
- Zentrifugiere bei 2100 × g für 30 min bei 4 °C und überführe das Zelllysat in einen neuen Behälter. Mischen Sie das Zelllysat und den Zellkulturüberstand nach dem Auftauen.
- Fügen Sie dem Zelllysat 20 U/ ml Nuklease und 10 mMMgCl2 hinzu, um die DNA und RNA zu verdauen. 2-4 h bei 37 °C inkubieren.
- Filtern Sie das Lysat durch ein 0,8 μm und 0,2 μmpolyethersulfon Dualfiltrationssystem mit einer Pumpe.
- Lagern Sie das geklärte Zelllysat über Nacht bei 4 °C oder reinigen Sie das AAV sofort.
4. Reinigung des AAV-Vektors mit Affinitätssäulenchromatographiesystem
- Bereiten Sie das Chromatographiegerät vor, indem Sie die Proben- und Pufferleitungen nacheinander mit sterilem Wasser, 1 N Natriumhydroxid, Wasser und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) bei einer Durchflussrate von 50 ml/min waschen.
- Montieren Sie die AVB Sepharose-Säule (10,0 ml) in das Chromatographiesystem und führen Sie 100 ml PBS mit einer Durchflussrate von 5 ml/min aus.
HINWEIS: Verwenden Sie je nach Umfang der AAV-Produktion ein geringeres oder höheres Volumen der AVB Sepharose-Säule und richten Sie die Durchflussrate wie vom Säulen- oder Harzhersteller vorgeschlagen ein (siehe Tabelle der Materialien). - Um die Fraktionen der Säulendurchlauflösung, des Waschpuffers und des Elutionspuffers, die AAV-Partikel enthalten, zu sammeln, führen Sie Röhrchen in die Fraktionskollektorschlitze des Chromatographiegeräts ein.
- Die Säule wird mit PBS bei einer Durchflussrate von 5,0 ml/min ausgeglichen.
- Laden Sie das gefilterte Zelllysat mit AAV-Partikeln mit der mit einer Probenpumpe ausgestatteten Chromatographiemaschine auf die Säule. Führen Sie die Probe mit einer Durchflussrate von 3,0 ml pro Minute aus.
- Führen Sie PBS mit einer Durchflussrate von 3,0 ml/min durch die AVB Sepharose-Säule, bis die UV-Absorptionskurve (280 nm) zur Grundlinie zurückkehrt und stabil wird.
- Eluieren Sie die AAV-Partikel aus der Säule mit 50 mM Natriumcitrat (pH 3,0) Puffer bei einer Durchflussrate von 3,0 ml/min (Abbildung 5).
HINWEIS: Während die AAV-Partikel vom Harz dissoziieren und den UV-Detektor passieren, ist auf dem Chromatogramm ein Elutionspeak des Proteins zu sehen. - Verdünnen Sie den AAV-Überstand sofort mit einem Fünftelvolumen von 500 mM Tris-HCl (pH 8,0), um den pH-Wert des AAV-haltigen Überstands auf etwa pH 5,5 zu erhöhen, um einen pH-vermittelten Abbau mit saurem Elutionspuffer zu verhindern. Verdünnen Sie den AAV-Überstand 10-fach mit PBS, um den pH-Wert vollständig zu neutralisieren.
HINWEIS: Der pH-Wert beträgt nach Neutralisation der rAAV-Lösung etwa 5,5. Nach der Neutralisation von AAV verdünnen Sie die rAAV-Lösung 10-fach mit PBS (pH 7,4), so dass sich AAV in einem physiologischen Puffer befindet. - Lagern Sie 1 ml jeder Säule, den Durchlaufproben, den Waschpuffer und 100 μL des eluierten AAV-Überstands, um das Vorhandensein von AAV durch Infektion der Zielzellen zu bewerten.
- Reinigen Sie die AVB Sepharose-Säule mit 100 mL 100 mM Zitronensäure (pH 2,1) und 100 mL PBS (pH7,4) bei einem Durchfluss von 5,0 mL/min. Spülen Sie die Säule mit 20% Ethanol bei einem Durchfluss von 5,0 ml/min ab und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Reinigen Sie die Rohrleitungen des Chromatographiegeräts mit der Offline-Position der Säule, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben. Zum Schluss spülen Sie das Chromatographiesystem mit 200 ml 20% Ethanol bei einer Durchflussrate von 50,0 ml/min und lagern Sie es in 20% Ethanol.
5. Konzentration und Diafiltration des AAV-Vektors mittels Tangentialflussfiltration (TFF)
- Richten Sie das TFF-System ein, das mit einer Polysulfon-Membrankartusche (100 kDa Molecular Weight Cut Off) ausgestattet ist, um den AAV zu konzentrieren.
- TFF-Modul mit 200 ml PBS für 10 min ausgleichen.
- Laden Sie die AAV-Probe, indem Sie den Durchfluss der Pumpe steuern, bis die Probe auf das gewünschte Volumen reduziert ist, während ein Transmembrandruck bei 2-3 psi aufrechterhalten wird.
- Diafiltrieren Sie das Retentat mit 100 ml PBS, wie in dieser Studie verwendet, oder definieren Sie empirisch einen alternativen Puffer, der die Langzeitstabilität von AAV unterstützt.
- Nachdem Sie die AAV-Probe auf das gewünschte Volumen konzentriert haben, sammeln Sie die AAV-Probe, filtern Sie sie durch einen 0,2 μm Polyethersulfonfilter, Aliquot, und lagern Sie sie dann bei -80 ° C.
6. Infektion von AAV-Proben in die Zielzellen, um das Vorhandensein von AAV in den Reinigungsschritten zu bewerten
- Impfen Sie 7 x 104 HT1080 Zellen / Well in einer 24-Well-Platte in 500 μL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 10% fetalem Rinderserum (FBS) am Tag vor der Infektion. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
- Zählen Sie die Zellen vor der Infektion. Fügen Sie die verdünnte ungereinigte AAV-Massenprobe vor dem Säulenlauf, die Säulendurchlaufproben, den Waschpuffer und die eluierte gereinigte AAV-Probe hinzu.
HINWEIS: Zählen Sie die blau gefärbten Trypan-Zellen mit einem Hämozytometer. Bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor und das Volumen (μL) der AAV-Proben empirisch. Je höher die AAV-Titer, desto mehr Verdünnung ist erforderlich. Stellen Sie sicher, dass die Baculoviruspartikel der ungereinigten Großprobe vor dem Säulenlauf, die Säulendurchlaufproben und der Waschpuffer bei 50 °C für 50 min hitzeinaktiviert werden, bevor die Zielzellen infiziert werden, um infektiöse Titer von AAV zu bestimmen. - Analysieren Sie zwei Tage nach der Infektion die Proteinexpression (z. B. GFP oder therapeutisches Gen) in den Zellen mit einem Durchflusszytometer.
- Berechnen Sie infektiöse Titer von AAV unter Verwendung der Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion, des Verdünnungsfaktors und des Prozentsatzes der GFP+-Zellen mit der Formel: (Gesamtzahl der Zellen x Prozentsätze GFP+-Zellen x Verdünnungsfaktor) / Volumen der AAV in Millilitern.
HINWEIS: Zum Beispiel ist die Anzahl der Zellen 1 x 105, der Prozentsatz der GFP + -Zellen beträgt 3,4%, der Verdünnungsfaktor beträgt 100 und das Volumen des hinzugefügten AAV beträgt 2 μL. Der Titer von AAV beträgt 1,7 x 108 infektiöse Einheit (IE) / ml. Die Gesamtmenge der gereinigten AAV-Partikel in 25 ml der eluierten Fraktion beträgt 4,3 x 109 infektiöse Einheiten (IE)/ml (Abbildung 6). Die Gesamtzahl der anfänglichen ungereinigten AAV-Partikel beträgt 1,09 x10 10 IE / ml und die gereinigten AAV-Partikel 4,3 x 109 IE / ml. Daher beträgt der Prozentsatz der Wiederherstellung 39,4%. Der Prozentsatz der GFP+-Zellen sollte zwischen 1% und 30% liegen, was einem linearen Bereich entspricht, wenn er zur Berechnung des infektiösen Titers von AAV verwendet wird. Wenn konzentriertere AAV-Vektorpartikel in die Zielzellen infiziert werden; Es besteht die Möglichkeit, dass mehrere Kopien der AAV-Partikel eine einzelne Zelle infizieren, die als einzelne Kopie des Vektors angezeigt wird. Verdünnen Sie daher den AAV-Vektorüberstand, um eine Vektorinfektion von 1% -30% in den Zielzellen zu erhalten. Wenn der AAV-Vektor kein Reportergen hat, färben Sie das Transgen oder das therapeutische Gen, das vom AAV-Vektor exprimiert wird, mit einem Antikörper, der einen Fluoreszenzfarbstoff enthält, der mit einem Durchflusszytometer nachgewiesen und quantifiziert werden kann. Nicht alle AAV-Serotypen können HT1080-Zellen effizient infizieren. Um den Infektiositätstest für andere AAV-Serotypen durchzuführen, verwenden Sie daher verschiedene Zelllinien. Titeren Sie die AAV2-GFP-Partikel vor der Reinigung und nach der Reinigung auf HT1080-Zellen und messen Sie die GFP-Expression durch Durchflusszytometrie. Berechnen Sie die Rückgewinnung (%) durch das Verhältnis der Anzahl der gereinigten AAV-Partikel und der Anzahl der AAV-Partikel vor der Reinigung multipliziert mit 100.
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Representative Results
Hier werden die repräsentativen Ergebnisse der Prozessentwicklung zur Herstellung und Aufreinigung von AAV-Vektoren unter Verwendung des Sf9-Insektenzellsystems gezeigt. Die Methode umfasst die Kokultur von Sf9-Zellen mit Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen, die Fütterung der Zellen mit Wachstumsmedium, die Ernte und Lyse der Produzentenzellen zur Freisetzung der AAV-Partikel, die Klärung des Zelllysats mit Nukleasebehandlung, Zentrifugation und Filtration, die Reinigung von AAV mittels AVB-Sepharose-Affinitätschromatographie und die Konzentration mit TFF (Abbildung 1).
TIPS-Zellen werden durch Infektion von BV-AAV2-GFP oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap in Sf9-Zellen separat erzeugt. Die meisten Sf9-Zellen infizieren sich innerhalb von 3-4 Tagen mit dem Baculovirus aufgrund der mehreren Infektionsrunden, die durch die Expression des Baculovirus-Glykoproteins gp64 in (Abbildung 2) nachgewiesen werden, und die Zellen zeigen eine Zunahme des Durchmessers (Abbildung 3). TIPS-Zellen werden 3-4 Tage nach der Infektion geerntet und kryokonserviert. Sf9-Zellen werden mit den TIPS-Zellen ko-kultiviert, die Baculovirus-Partikel im Kulturmedium sezernieren, die naive Sf9-Zellen infizieren. Baculovirus ist replikationskompetent; Daher steigt die Anzahl der infizierten Zellen durch mehrfache Rundeinfekte mit neu produzierten Baculoviruspartikeln, die in das Kulturmedium8, 9 sezerniertwerden,rapidean. Die Zellen zeigen eine Zunahme des Durchmessers, eine zytopathische Wirkung und etwa die Hälfte der Zellen stirbt 5 Tage nach der Infektion ab, was die Anzeichen für den Abschluss der AAV-Produktion sind (Abbildung 4).
Die AAV-Produzentenzellen werden durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geerntet und mit pufferhaltigem Reinigungsmittel versetzt, um das AAV in das Zelllysat freizusetzen. Diese wird dann mit Nuklease zum Aufschluss von DNA und RNA behandelt, um die Viskosität zu reduzieren, durch eine 0,8 μm und 0,2 μm Membran filtriert und anschließend gereinigt und konzentriert. Das Zelllysat wird mit einem Chromatographiesystem auf eine AVB Sepharose-Säule geladen. Das AVB Sepharose-Harz bindet AAV2-Partikel aufgrund seiner Affinität zu den Kapsidproteinen. Der Waschpuffer wird durch die AVB Sepharose-Säule geführt, um ungebundene und lose gebundene Materialien zu entfernen, bis die ultraviolette (UV) Absorptionskurve (280 nm) an der Basislinie stabil wird. Da AAV-Partikel AVB Sepharose stark binden, wird während des Waschens keine signifikante Anzahl von AAV2-Partikeln nachgewiesen. Die AAV-Partikel werden mit saurem Puffer (pH 3,0) eluiert, der die Wechselwirkung zwischen AAV-Partikeln und AVB Sepharose-Harz dissoziiert. Um den pH-vermittelten Abbau des AAV durch die saure Lösung zu verhindern, wird das Eluant mit einem alkalischen Puffer (pH 8,0) neutralisiert. Ein Peak des Proteins wird während der Elution mit saurem Puffer entsprechend der AAV-Fraktion beobachtet (Abbildung 5 und Abbildung 6). Gereinigtes AAV wird 10-fach mit PBS verdünnt, konzentriert und mit einem TFF-System ausgetauscht. In diesem Beispiel sind die gesamten AAV-Partikel in Zelllysat (560 ml) 1,1 x 1014 Vektorgenom (vg), nach AVB Sepharose Chromatographie-Reinigung (25 ml) sind 4,1 x 1013 vg, und nach Konzentration mit TFF (25 ml) sind 2,4 x 1013 vg. Die gereinigten AAV-Proben zeigen drei verschiedene Kapsidproteine, VP1, VP2 und VP3, nach SDS-PAGE und Silberfärbung(Abbildung 7).
Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm für die Herstellung und Reinigung von AAV Vector. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Durchflusszytometrische Analyse der Baculovirus gp64-Expression in Sf9-Zellen. Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen werden mit einem Maus-Anti-Baculovirus gp64-Antikörper gefärbt, der einen fluoreszierenden Farbstoff enthält, der durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. (A) Nicht infizierte Sf9-Zellen. (B) Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen zeigen in den meisten Zellen eine gp64-Expression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Morphologie der Baculovirus-infizierten Sf9 (TIPS) Zellen. Baculovirus wird in die Sf9-Zellen infiziert, um die TIPS-Zellen zu produzieren. (A) Nicht infizierte Sf9-Zellen. (B) Baculovirus infiziert Sf9 (TIPS) Zellen. Zellen werden mit 200-facher Vergrößerung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Morphologie der Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen während der AAV-Produktion. TIPS-Zellen sezernieren Baculoviren, die während der AAV-Produktion kokultivierte naive Sf9-Zellen infizieren. (A) Nicht infizierte Sf9-Zellen. (B) Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen zeigen eine Zunahme des Durchmessers. Fünf Tage nach der Infektion stirbt fast die Hälfte der Zellen ab (sichtbar unter einem Inversphasenmikroskop nach Trypanblaufärbung). Rote Pfeile zeigen lebende Zellen an, blaue Pfeile zeigen tote Zellen an. Zellen werden mit 200-facher Vergrößerung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: AAV-Reinigung mit AVB Sepharose Säulenchromatographie. Ein Chromatogramm zeigt die Absorption von Proteinproben bei 280 nm während der Probenbeladung auf Säule, Waschen und Elution. Das Chromatogramm wurde so modifiziert, dass es in die Abbildung passt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die Anzahl der infektiösen AAV-Partikel im Durchfluss während der Beladung auf die Säule, beim Waschen und bei der Elution. Insgesamt werden 560 ml AAV-Proben auf eine 10 mL AVB Sepharose-Säule geladen. Das Fraktionsvolumen für die Säulenbelastung beträgt 50 ml, die Säulenwäsche 50 ml und die Elution 25 ml. AAV-Titer werden nach der Infektion von HT1080-Zellen mit den Säulendurchlaufproben während der Beladung der Säule, waschen und Elution gemessen, um das Vorhandensein von AAV bei jedem Schritt der Reinigung zu untersuchen. Die gesamte gereinigte AAV-Ausbeute beträgt 4,3 x 109 infektiöse Einheiten. Jedes rautenförmige Symbol repräsentiert die infektiösen Einheiten (IE) von AAV in jeder Fraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. SDS-PAGE und Silberfärbung von reinem AAV-Vektor mit Kapsidproteinen. Die reduzierten AAV-Proben werden auf SDS-PAGE ausgeführt und die Silberfärbung durchgeführt. Drei verschiedene Bänder von AAV-Kapsidproteinen, VP1, VP2 und VP3, sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Parameter, die in diesem Protokoll für die Prozessentwicklung der Produktion, Reinigung und Konzentration von AAV-Vektoren verwendet werden, können sowohl auf die Herstellung von AAV-Vektoren im kleinen als auch auf den großen Maßstab für Gentherapieanwendungen angewendet werden. Der gesamte vor- und nachgelagerte Prozess kann in einem geschlossenen System durchgeführt werden, das mit den aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP) kompatibel ist. Die Hauptvorteile des Sf9-Baculovirus-Systems sind die Skalierbarkeit für die großflächige GMP-AAV-Produktion zu erschwinglichen Kosten. Das System benötigt keine teuren Plasmide und Transfektionsreagenzien, die für die Herstellung von AAV mit HEK293-Zellen benötigt werden. Es wurde berichtet, dass sowohl HEK293-Zellen als auch Sf9-Zellen AAV-Vektoren von ähnlicher Qualität liefern (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract # 100). Die größte Herausforderung besteht darin, dass dieses System die Erzeugung von Baculoviren und TIPS-Zellen erfordert, die viel Zeit und Mühe erfordern.
In diesem Protokoll wurden zwei Arten von TIPS-Zellen (TwoBac-System) verwendet: eine TIPS-Zelle, die Baculovirus mit AAV-Gentransferkassette enthielt, und eine weitere TIPS-Zelle, die AAV-Rep-Cap enthielt. Das OneBac-System 2,16,17 kann TIPS-Zellenerzeugen,die sowohl AAV-Gentransferkassetten- als auch Rep-Cap-Gene ineinemeinzigen Baculovirus enthalten. Das OneBac-System bietet einen alternativen Ansatz zur Herstellung des rAAV mit nur einem Satz von TIPS-Zellen anstelle von zwei, wie im TwoBac-System beschrieben, was das Protokoll weiter vereinfachen würde.
Dieses Protokoll beschreibt die AAV-Produktion in Sf9-Zellen. Es ist wichtig, das Verhältnis der Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen zu naiven Sf9-Zellen zu optimieren, um eine gute AAV-Ausbeute zu erzielen. Wenn dieses Verhältnis suboptimal ist, wird die Ausbeute des AAV um11reduziert. Wenn beispielsweise aufgrund des suboptimalen Verhältnisses von TIPS und Produzentenzellen mehr AAV-ITR-haltige Gentransfervektoren erzeugt werden als die Kapside in den Produzentenzellen, erhalten alle verfügbaren Gentransfervektoren nicht genügend Kapside, um vollständige AAV-Partikel zu produzieren. Auf der anderen Seite, wenn mehr Kapside erzeugt werden als die AAV-Gentransfervektoren in den Produzentenzellen, erhalten alle Kapside keine AAV ITR enthaltenden Gentransfervektoren, die zu leeren AAV-Partikeln führen.
Wenn sich die Zellen vermehren, werden die Nährstoffe des Kulturmediums erschöpft und Stoffwechselabfallprodukte sammeln sich an. Daher kann die Supplementierung von 20% frischem Wachstumsmedium in die Zellkultur 2 Tage nach der Kokultur von TIPS-Zellen und Sf9-Zellen die AAV-Titer signifikant erhöhen (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, persönliche Kommunikation).
Die Reinheit der AAV-Partikel ist ein kritischer Faktor für eine effektive Transduktion von Zielzellen ohne Zytotoxizität sowohl für in vitro als auch für in vivo Studien3,5. Daher ist es wichtig, einen Chromatographieschritt einzuschließen, der AAV-Partikel selektiv reinigen und Verunreinigungen wie Wirtszellproteine und -trümmer, genomische und baculovirale DNA sowie aggregierte und fragmentierte Vektoren eliminieren kann. Beim Laden von AAV-Überstand auf eine AVB Sepharose-Säule ist es wichtig, die Durchflussproben auf das Vorhandensein von AAV-Partikeln zu überprüfen, die die Säule passieren können, ohne an das Harz zu binden. Wenn dies der Fall ist, (1) ist eine niedrigere Laufgeschwindigkeit erforderlich, die zu einer längeren Verweilzeit führt, um die AAV-Partikel zu binden, (2) die Menge der geladenen Probe auf die Säule sollte reduziert werden, und / oder (3) das Volumen der AVB Sepharose sollte erhöht werden, so dass die Bindungskapazität der Säule niemals die Anzahl der AAV-Partikel überschreitet. Die Fähigkeit von AVB Sepharose-Harz, AAV-Partikel mit einer hohen Durchflussrate und mit hoher Affinität und Kapazität zu binden, ist wichtig, um die Reinigungszeit zu verkürzen. Die Haupteinschränkung von AVB Sepharose besteht darin, dass es das Kapsid der AAV-Serotypen 1, 2 und 5 bindet. Daher sollten verschiedene Chromatographieharze getestet und zur Reinigung anderer AAV-Serotypen verwendet werden18. Das hierin beschriebene nachgeschaltete Reinigungsprotokoll kann auch zur Reinigung von AAV verwendet werden, das in HEK 293-Zellen hergestellt wird.
Dieses Protokoll kann AAV von Zelllysat reinigen, aber keine leeren Partikel entfernen. Einige Artikel haben Methoden beschrieben, die leere vs. volle AAV-Partikel in gereinigten AAV-Beständen unterscheiden können19,20. Wir sind jedoch der Meinung, dass die AAV-Produktion auf vorgelagerter Prozessebene optimiert werden sollte, um die Erzeugung leerer Partikel zu minimieren. Wenn das Verhältnis von AAV-Gentransfervektor und Kapsidproduktion in Produzentenzellen nicht optimal ist, können mehr leere Partikel entstehen.
Zusätzlich zur Bindung von vollständigen AAV-Partikeln bindet AVB Sepharose Medium fragmentierte AAV-Partikel oder Kapsidproteine, die mit TFF entfernt werden können. Die meisten niedermolekularen Partikel werden aus AAV-Proben eliminiert, indem der TFF-Schritt nach der Säulenchromatographie einbezogen wird. Darüber hinaus wird TFF verwendet, um einen Pufferaustausch/Diafiltration durchzuführen und den AAV10,21zu konzentrieren.
Obwohl die Ultrazentrifugation des AAV-Lysat mit Cäsiumchlorid- oder Iodixanol-Gradient die bevorzugte Methode für die AAV-Reinigung in kleinem und präklinischem Bereich ist, ist diese Methode nicht skalierbar und weniger geeignet für die großflächige Reinigung von AAV21,22.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll für die Prozessentwicklung der Produktion und Reinigung von AAV für die kleinmaßstäbliche präklinische und großtechnische Herstellung von rekombinantem AAV für die Gentherapie erblicher genetischer Erkrankungen nützlich sein wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) für die großzügige Bereitstellung der AAV-Plasmide und Danielle Steele und Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch den Start-Up-Fonds der Cincinnati Children's Research Foundation an M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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