Summary
이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.
Abstract
호흡기는 외부 환경과 직접 접촉하며 환경 항원에 대한 원치 않는 반응을 억제하면서 보호를 제공하기 위해 정밀하게 조절된 면역 체계가 필요합니다. 폐는 면역 감시를 제공하지만 보호 면역 반응을 매개하는 선천적 및 적응 면역 세포의 여러 집단을 호스트합니다. 건강한 폐 면역 체계의 균형을 유지하는 이러한 세포는 천식, 감염, 자가면역 질환 및 암과 같은 여러 병리학 적 상태에도 참여합니다. 표면 및 세포내 단백질의 선택적 발현은 폐의 면역 세포에 독특한 면역표현형 특성을 제공한다. 결과적으로, 유세포 측정은 정상 상태 및 병리학 적 조건 동안 그러한 세포 집단의 확인에 중요한 역할을합니다. 이 논문은 정상 상태 조건 하에서 건강한 마우스의 폐에 상주하는 면역 세포를 확인하기위한 일관되고 재현 가능한 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 이 프로토콜은 또한 폐 면역 환경에서 질환 특이적 변화를 식별하는 것을 돕기 위해 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하는데 사용될 수 있다.
Introduction
뮤린 호흡기에는 병원균과 싸우고 면역 항상성을 유지하는 독특한 면역 체계가 포함되어 있습니다. 폐 면역 체계는 표현형, 기능, 기원 및 위치에서 상당한 이질성을 가진 세포 집단으로 구성됩니다. 상주 폐포 대식세포 (AMs)는 주로 태아 단핵구에서 유래하여 폐포 루멘1에 상주하며, 골수 유래 간질성 대식세포 (IMs)는 폐 실질2에 상주합니다. IMs는 CD206의 발현에 의해 추가로 하위분류될 수 있다. CD206+ IM은 기관지 주위 및 혈관주위 영역을 채우는 반면, CD206-IM은 폐포 간질3에 위치한다. IM의 몇 가지 하위 분류가 최근에 제안되었습니다 3,4,5,6. IM이 AM보다 덜 연구되었지만, 최근의 증거는 폐의 면역 체계 조절에 중요한 역할을지지합니다7. 또한, CD206은 또한 대안적으로 활성화된 AMs8에서 발현된다.
폐 수지상 세포 (DCs)는 폐 면역 세포의 또 다른 이종 그룹으로서 그들의 기능적 특성, 위치 및 기원과 관련하여 존재한다. DC의 네 가지 하위 범주가 폐에 기술되었다: 통상적인 CD103+ DCs(cDC1로도 알려짐), 통상적인 CD11b+ DCs(cDC2로도 알려짐), 단핵구 유래 DCs(MoDCs), 및 혈장세포성 DCs9,10,11,12,13. 처음 세 개의 서브클래스는 주조직 적합성 복합체(MHC) II+CD11c+9,10,14,15로 정의될 수 있다. 플라스마사이토이드 DC는 MHC II를 발현하고 CD11c에 대해 중간 양성이지만 높은 수준의 B220 및 PDCA-19,13,16을 발현한다. 순진한 뮤린 폐에서 CD103 DC와 CD11b DC는 기도 간질에 위치하는 반면, 혈장 세포질 DC는 폐포 간질에 위치합니다17.
단핵구의 두 가지 주요 집단은 정상 상태 동안 폐에 거주합니다 : 고전적인 단핵구와 비 고전적 단핵구. 고전적 단핵구는 Ly6C+이며 초기 염증 반응에 매우 중요합니다. 대조적으로, 비고전적 단핵구는 Ly6C-항염증 세포3,16,18로서 널리 간주되어 왔다. 최근에, CD64+CD16.2+ 단핵구의 추가 집단이 기술되었고, 이는 Ly6C-단핵구로부터 기원하고 CD206+ IMs3를 야기한다.
호산구는 주로 기생충 감염이나 알레르기 상태 동안 폐에 나타납니다. 그러나, 정상 상태 동안 폐 실질에는 소수의 호산구가 존재하며, 이는 상주 호산구로 알려져 있다. 상주 호산구와는 달리, 염증성 호산구는 폐 간질염 및 기관지 폐포 세척 (BAL)에서 발견됩니다. 집먼지 진드기 (HDM)의 마우스 모델에서, 염증성 호산구는 항원 매개 자극 후 폐로 모집된다. 상주 호산구는 HDM19에 대한 T 헬퍼 2 (Th2) 감작을 억제함으로써 알레르기에 대한 조절 역할을 할 수 있다고 제안되었습니다.
나머지 폐 골수성 세포와는 달리, 호중구는 CD68이 아닌 Ly6G를 발현하며 CD68-Ly6G+ 면역표현형16,20,21의 시그니처를 특징으로 한다. 시각화 연구는 정상 상태 동안, 폐는 혈관내 구획에 호중구 풀을 보유하고, 상당한 수의 혈관외 호중구를 숙주로 한다는 것을 보여주었다22. 호산구와 유사하게, 호중구는 정상 상태에서 BAL에서 발견되지 않는다; 그러나 LPS 챌 린지, 천식 또는 폐렴과 같은 여러 형태의 면역 자극은 호중구를 폐포 내강으로 유도하여 BAL21,22,23에 존재하게됩니다.
폐의 상당한 수의 CD45+ 세포는 자연 살해 (NK), T 세포, 및 B 세포를 나타내며, 대부분의 골수성 마커24에 대해 음성이다. 순진한 마우스의 폐에서, 이들 세 가지 세포 유형은 CD11b 및 MHC II18의 발현에 기초하여 확인될 수 있다. 폐 CD45+ 세포의 약 25%는 B 세포인 반면, NK 세포의 비율은 다른 림프성 및 비림프성 조직보다 폐에서 더 높다24,25,26. 폐 T 세포 중에서, 상당한 분획은 CD4-CD8-호흡기 감염26에서 중요한 역할을 한다.
폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하고 있기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되어 16,18,20,27보고되었습니다. 본원에 기재된 게이팅 전략은 9개의 마커를 사용하여 최대 12개의 상이한 폐 골수성 및 비골수성 면역 집단을 확인하기 위한 포괄적이고 재현가능한 방법을 제공한다. 결과의 유효성을 검사하기 위해 추가 마커가 사용되었습니다. 또한, 세포 사멸을 최소화하고 폐의 면역 세포 구획의 가장 완전한 프로파일의 확인을 허용하는 단일 세포 현탁액의 제조를 위한 상세한 방법이 제공된다. 상피 세포 (CD45-CD326+CD31-), 내피 세포 (CD45-CD326-CD31+), 및 섬유아세포와 같은 폐의 비면역 세포의 동정은 상이한 접근법을 필요로 한다는 점에 유의해야 한다28,29. 이러한 집단의 확인은 여기에 설명된 프로토콜 및 방법에 포함되지 않는다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 연구 및 실험은 Beth Israel Deaconess Medical Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 지침에 따라 수행되었습니다. 6 내지 10주령의 C57BL/6 생쥐 중 어느 한쪽 성별이 이 프로토콜을 개발하는데 사용되었다.
1. 외과 적 절제 및 조직 준비
- 1 mL의 트리브로모에탄올을 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킨다 (표준 프로토콜에 따라 제조됨; 자료의 표).
참고 : CO2 질식은 폐 손상을 유발하고 폐 면역 세포의 특징과 특성을 변화시킬 수 있으므로 폐 연구에서 피해야합니다. 자궁 경부 탈구는 폐의 기계적 손상을 일으킬 수 있으므로 피해야합니다. - 외과 수술을 위해 마우스를 깨끗하고 전용 영역으로 옮깁니다.
- 네 사지에 바늘이나 테이프를 사용하여 마우스 등쪽을 아래로 안정시킵니다. 복부 부위의 피부를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오.
- 목에서 복부까지 피부를 절개하십시오. 흉부 부위에서 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
- 흉골과 갈비뼈를 조심스럽게 제거하십시오.
- 폐가 완전히 흰색이 될 때까지 18-21 G 바늘을 사용하여 차가운 PBS 10 mL를 우심실에 직접 주사하여 폐를 플러시하십시오.
- 폐를 만지지 않고 흉선과 심장을 조심스럽게 제거하십시오.
- 폐를 주변 조직으로부터 부드럽게 분리하고 차가운 BSA 완충액이 있는 튜브로 옮깁니다(표 1).
참고 : 단일 세포 현탁액을 더 준비하기 전에 폐에서 인접한 모든 지방을 제거하기위한 노력이 이루어져야합니다.이 측정은 판독 값을 편향시킬 수 있습니다.
2. 단세포 현탁액의 제조
- 폐를 빈 페트리 접시로 옮기고 두 개의 미세한 메스로 다듬어 라. 다진 폐의 모든 조각을 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 5 mL의 소화 완충액을 사용하여 플레이트를 세척하고 다진 폐가 들어있는 50 mL 튜브에 첨가한다 (표 1).
참고: 소화 완충액은 사용 직전에 준비해야 합니다. 5 mg/mL의 콜라게나제28을 사용하십시오. 1 또는 5 mg의 콜라게나제를 BSA 완충액 또는 단백질이 없는 PBS와 조합하는 것은 결과를 개선하지 않았다(보충 도 S1). - 튜브의 뚜껑을 고정시키고 37°C에서 150 rpm의 속도로 오비탈 진탕기 상에서 30분 동안 폐를 소화시켰다. 차가운 BSA 완충액 10 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨다.
- 소화 후 18G 바늘을 사용하여 폐 조각을 혼합하고 용해시킵니다. 70 μm 필터 스트레이너를 새로운 50 mL 코니컬 튜브의 상단에 놓습니다.
참고: 더 작은 미크론 필터를 사용하면 주요 골수성 집단이 손실될 수 있습니다. - 소화 된 폐 혼합물을 스트레이너에 직접 천천히 옮깁니다. 10mL 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터의 나머지 폐 조각을 부수십시오. 필터에서 처리 된 재료를 BSA 버퍼로 씻으십시오.
- 단일 세포 현탁액을 4°C에서 8분 동안 350 × g 에서 원심분리한다.
- 조심스럽게 상청액을 버리고 세포를 ACK 용해 완충액 1 mL에 재현탁시킨다. 1 mL 피펫을 사용하여 잘 혼합하고, 실온에서 90 s 동안 인큐베이션한다.
- 차가운 BSA 버퍼 10 mL를 첨가하여 반응을 중지시키고 350 × g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 버리고 펠렛을 염색 완충액에 재현탁시켜 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수한다.
- 세포를 5 × 106 cells/mL의 농도로 재현탁하고 표면 염색에 사용하십시오 (섹션 3 참조).
참고: 이 목적을 위해, 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이트화한 다음, 항체 염색 및 세척을 실시한다. 플레이트 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 플레이트 대신 플로우 튜브를 사용하십시오. 이 프로토콜을 사용하면 폐 당 106 개× 15-20 세포를 평균 크기의 6-10 주령 C57BL / 6 마우스로부터 얻을 수 있습니다.
3. 표면 항체 염색
- 1 × 106 세포를 웰 당 200 μL의 96-웰 플레이트로 옮긴다. 플레이트를 350 × g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리한다. 그 동안, 항-16/32 항체 (1:100)를 염색 완충액으로 희석하여 Fc-block 용액을 제조하였다 (표 1).
- 세포를 미리 제조된 Fc-블로킹 용액 (표 물질)의 50 μL에 재현탁시키고, 4°C 또는 얼음 상에서 15-20분 동안 인큐베이션한다.
- 150 μL의 염색 완충액을 첨가하고, 플레이트를 4°C에서 5분 동안 350 × g 에서 원심분리한다. 한편, 표면 항체 칵테일을 희석하여 표면 항체 칵테일을 준비하십시오 (1:100; 표 2) 염색 완충액에서.
참고: (i) Fc-차단을 위한 항-16/32 항체는 동일한 혼합물의 표면 항체와 함께 사용될 수 있다. (ii) 고정 가능한 생존력 염료가 사용되는 경우, 1:1,000의 희석으로 표면 항체 칵테일에 첨가한다. - 세포를 미리 제조된 표면 항체 칵테일의 50 μL에 재현탁시키고, 어둠 속에서 4°C에서 30-40분 동안 인큐베이션한다. 염색 완충액으로 세포를 두 번 세척하십시오.
참고: 세포내 염색이 필요하지 않은 경우, 세포를 200μL의 염색 완충액에 재현탁시키고 유세포 분석기에 대한 데이터 수집을 직접 진행하십시오. 대안적으로, 세포는 고정되고 추후 획득을 위해 4°C에서 저장될 수 있다. 우리는 24 시간 이내에 유세포 측정을 위해 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 세포 고정 및 세포 내 염색
- FoxP3/전사 인자 염색 버퍼 세트의 고정/투과 농축액 3부와 고정/투과 희석제 1부를 혼합하여 고정/투과 완충액(Fix/Perm Buffer)을 준비합니다(표 1).
- 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 미리 준비된 픽스/퍼름 버퍼 중 50 μL에 재현탁시키고, 여기서 세포를 섹션 3에 기재된 바와 같이 플레이팅하고, 어둠 속에서 4°C에서 20-25분 동안 인큐베이션한다.
- 10x 투과화 완충액을 정제된 탈이온수에 1:10으로 희석하여 1x 투과 완충액을 제조하였다.
- 세포를 1x 투과화 완충액으로 한 번 세척한다. 한편, 세포내 항체 (1:100)를 투과 완충액 1 mL에 희석하여 세포내 항체 칵테일을 준비한다.
- 96-웰 플레이트의 세포당 미리 제조된 표면 항체 칵테일 50 μL를 사용하여 세포를 재현탁시키고, 어둠 속에서 4°C에서 40분 동안 인큐베이션한다.
- 투과 완충액으로 한 번, 염색 완충액으로 한 번 세포를 씻으십시오. 최종 세척 후, 세포를 200 μL의 염색 완충액에 재현탁시킨다.
참고: 플레이트 판독기가 있는 유세포 분석기를 사용할 수 없는 경우, 세포를 유세포 분석기 튜브로 옮기십시오. - 유세포 분석기 상에서 샘플 당 최소 1.5 × 106 세포를 획득한다.
참고 : 단일 색상 및 염색되지 않은 대조군 샘플의 경우 샘플 당 0.5-1 × 106 세포로 충분합니다. 최적의 염색을 달성하고 비용을 줄이기 위해 사용되는 개별 항체를 역가하는 것이 좋습니다. 본 프로토콜은 FoxP3 염색 버퍼 세트를 사용하여 제조된 픽스/펄 버퍼를 사용하여 최적화되었다. CD68은 핵마커가 아닌 세포질이기 때문에, 저농도의 파라포름알데히드 또는 다양한 벤더로부터의 세포고정/사이토퍼름 키트와 같은 다른 투과화 용액으로 충분할 수 있다.
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Representative Results
게이팅 전략
게이팅 전략의 첫 번째 단계는 파편과 더블릿을 배제하는 것입니다(그림 1A). 위양성 집단을 피하기 위해 더블릿을 신중하게 배제하는 것이 중요합니다 (보충 그림 S2). 이어서, 면역 세포는 조혈 세포에 대한 마커인 CD45+를 사용하여 확인된다(도 1B). 살아있는 죽은 얼룩은 죽은 세포를 배제하기 위해 추가 될 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜은 CD45+ 세포의 <5%의 사멸을 초래하는 반면(도 1C), 더 많은 CD45- 세포는 죽은 것으로 확인된다(보충 도 S3).
단핵구와 호중구를 확인하기 위해, 이들 집단 각각에 대해 특이적인 항체를 사용했던 이전의 연구들16,18과는 달리, 우리는 Ly6C+ 및 Ly6G+ 세포 모두를 식별하는 항-GR-1 항체를 사용하는 것을 선호한다. 항-GR-1 항체를 항-CD68과 함께 사용하면 폐 면역 세포를 CD68-GR-1+, CD68+(GR-1+ 또는 GR-1-로 추가로 확인할 수 있음) 및 CD68-GR-1-/int(도 1D)의 세 군집으로 분리할 수 있습니다. CD68은 세포내에서 우세하게 검출되는 마커이다. 표면 CD68은 프로브되었지만 고정/투과 없이는 검출될 수 없었다(보충 그림 S4).
다형핵 세포(호중구)는 CD45+CD68-GR-1+CD11b+로 확인되었다(도 1E). 이러한 결과는 다형핵 호중구에 대한 독특한 마커인 Ly6G에 특이적인 항체와 함께 GR1을 사용하여 검증하였다(도 216,18,27). CD45+CD68-GR-1-/int 집단 내에서 약 10-20%는 MHCII- 및 CD11bblow이며 NK 세포를 나타낸다(도 1F). NK 세포에 대한 독특한 마커인 NK1.1을 사용하여 이를 확인하였다(도 3)25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b-집단은 MHCII-T 세포 및 MHCII+ B 세포로 구성된다(도 1F). T 세포 및 B 세포-CD3 및 B220을 각각 검증하기 위해 두 개의 추가 항체를 사용하였다(도 3).
정상 상태 조건 하의 건강한 마우스에서, BAL에서 검출된 CD45+ 세포의 대부분은 기도의 주요 거주자인 AMs이다. 따라서, BAL은 AMs20,31을 특성화하는 마커를 평가하기 위해 수행되었다. 이들 세포는 CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+이지만 다른 골수성 세포와 달리 높은 수준의 CD11b를 발현하지 않는다(도 4). 면역 마커의 동일한 조합은 또한 전체 폐의 균질물에서 AM을 식별합니다 (그림 1G, H). AMs 이외에, CD45+CD68+Sigle-F+ 게이트(도 1G)에서, CD11b에 대해 양성이지만 CD11c에는 양성이 아닌 뚜렷한 세포 집단이 있다. 이러한 CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c-백혈구 집단은 호산구를 나타낸다(도 1G)19,32.
CD45+CD68+SiglecF-세포가 있는 게이트에서(도 1G), 폐 DC를 나타내는 CD11c+MHC+ 집단이 존재한다(도 1I). 몇몇 조사관은 폐 DC를 CD11c + MHCII + CD24 + 16,18로 확인합니다. CD24 발현은 이러한 집단의 동일성을 확인하기 위해 평가되었다 (도 5A). 폐 DC의 대부분은 CD103+CD11b- 또는 CD103-CD11b+이다(도 1J). CD103+CD11b-DC는 CD103+ 기존 DC를 나타내며 CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-로 식별된다. 대조적으로, CD103-CD11b+ DC는 CD64 발현에 기초한 종래의 DC와 MoDC로 나뉘어진다(도 1K). 따라서 기존의 CD11b+ DC는 CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64-로 확인되는 반면, MoDC는 CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+로 식별됩니다. . 종래의 DC와는 달리, MoDC는 DC 마커 CD24에 대해 저양성이고 F4/80, CD64 및 MERTK를 포함하는 범대식세포 마커에 대해 양성이다(도 5A)9,10,11,13,33,34.
IM 및 고전적 및 비고전적 단핵구는 CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ 게이트(도 1L)에 있으며 CD64 및 GR-1 발현에 기초하여 구별된다(도 1M). 범-대식세포 마커인 CD64는 주로 IMs 및 AMs뿐만 아니라 DCs의 서브세트에 의해 발현된다. 고전적 단핵구는 Ly6C+ 단핵구로도 알려져 있고, 비고전적 단핵구는 Ly6C-단핵구로도 알려져 있다. 단핵구와 IM 모두 Ly6G에 대해 음성입니다. 그러나, 고전적 단핵구는 Ly6C를 발현하므로 GR-1에 대해 양성이다. 대조적으로, 간질성 대식세포 및 비고전적 단핵구 둘 모두는 GR-1 및 Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36에 대해 음성이다. 또한, 비고전적 단핵구는 CD11cint인 반면, 고전적 단핵구는 CD11c-이다. CD11c 발현의 이러한 차이는 기준선에서 두 종류의 단핵구를 구별하는 데 일반적으로 중요하지 않지만, 고전적 단핵구가 축적되는 병리학적 상태에 중요할 수 있다. 상기 내용을 바탕으로, 간질성 대식세포는 CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-와 같은 고전적 단핵구, CD45+CD68+CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64-와 같은 비고전적 단핵구로 정의된다. . AMs 및 IM 둘 다 CD68, CD64, F4/80 및 MERTK 원발암 유전자를 포함하는 모든 대식세포 마커에 대해 양성이다. 그러나, IM들과는 달리, AMs는 CX3CR1-이고, IMs와는 대조적으로, 이는 두 종류의 폐 대식세포의 기원의 차이에 의해 설명될 수 있다4,37,38,39 (도 5B).
그림 1: 뮤린 폐에 존재하는 면역 세포의 게이팅 전략. 파편, 더블릿, 죽은 세포, 및 비면역세포(CD45-)(A-C)를 조심스럽게 배제한 후, CD45+ 세포를 CD68 및 GR-1(D)의 발현에 기초하여 3개의 주요 클러스터로 분리하였다. 호중구는 CD68-GR-1+ 집단(E)에 속하고, CD68-GR-1-/int 집단은 NK 세포, B 세포 및 T 세포(F)로 구성된다. CD68+ 세포는 AMs 및 호산구 (H)인 Siglec F+ 세포 (G) 및 단핵구, IM 및 DC (I-M)로 구성되는 Siglec F-세포 (G)로 더 나눌 수 있다. 약어: SSC-A = 측면 산란광의 피크 영역; FSC-A = 전방 산란광의 피크 영역; SSC-H = 측면 산란광의 피크 높이; L/D = 라이브/데드 염색; MHC = 주조직 적합성 복합체; SF = 시글렉 F; GR-1 = GPI 결합 골수성 분화 마커 (Ly-6G); NK = 자연 살인범; IMs = 간질성 대식세포; DCs = 수지상 세포; AMs = 폐포 대식세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐에서 Ly6G는 다형핵 호중구로 확인된 CD45+CD68-GR-1+CD11b+ 세포에 의해서만 발현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 게이팅 전략에 의한 NK 세포, T 세포 및 B 세포의 동정 검증. NK 1.1, CD3 및 B220에 특이적인 마커를 사용하여 NK 세포, T 세포 및 B 세포의 동정을 각각 확인하였다. NKT 세포가 존재하는 경우, NK 세포 게이트 내의 CD3+ 세포 집단에 속할 수 있으며, NK와 NKT 세포의 오염을 피하기 위해서는 주의가 필요하다. 약어 : NK = 자연 살인범; MHC = 주조직 적합성 복합체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 순진한 마우스에서 기관지 폐포 세척에 의해 수득된 면역 세포의 대부분은 폐포 대식세포이다. 약어: AMs = 폐포 대식세포; DCs = 수지상 세포; IM = 간질성 대식세포; SSC-A = 측면 산란광의 피크 영역; FSC-A = 전방 산란광의 피크 영역; SSC-H = 측면 산란광의 피크 높이; SF = 시글렉 F; GR-1 = GPI 결합 골수성 분화 마커 (Ly-6G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 면역세포에서 상이한 마커의 발현의 비교. (A) 폐 DCs에서의 CD24, CD64, MERTK, F4/80 및 CD103 발현의 비교. (B) 폐 대식세포 및 단핵구에서의 CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b 및 CX3CR1의 비교. 약어: DCs = 수지상 세포; MoDCs = 단핵구 유래 DCs; AMs = 폐포 대식세포; IMs = 간질성 대식세포; SF = 시글렉 F; MERTK = 미엘로이드-상피-생식 티로신 키나아제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| BSA 버퍼 | PBS + 0.5% 소 혈청 알부민 | ||
| 소화 완충액 | 예열 (37 °C) BSA 버퍼 + 5 mg / mL 콜라게나제 유형 1 + 0.2 mg / mL DNase I | ||
| 염색 완충액 | PBS + 2.5% FBS | ||
| 수정/페름 버퍼 | Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트의 고정/투과 희석제 3부 및 고정/투과 희석제 1부 | ||
| 투과화 완충액 | 정제된 탈이온수에 10배 희석된 Foxp3/전사인자 염색 완충액 세트로부터의 10x 투과화 완충액 | ||
표 1: 버퍼.
| 항원 | 클론 | 플루오로크롬 | 희석 | 표면/세포 내 |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | 표면 |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | 표면 |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | 세포내 |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | 표면 |
| 시글렉 F | S17007L | 핏 | 1:100 | 표면 |
| CD11c | N418 | BV650 또는 BV510 | 1:100 | 표면 |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/대즐 594 | 1:100 | 표면 |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | 표면 |
| CD103 | 2.00E + 07 | 체육 / FITC | 1:100 | 표면 |
| 라이브/데드 픽서블 파 읽기 데드 셀 얼룩 키트 | 파레드(APC) 또는 아쿠아(BV510) | 1:1000 | 표면 | |
| CD3 | 17A2 | 체육 | 1:100 | 표면 |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | 표면 |
| NK1.1 | PK136 | 핏 | 1:100 | 표면 |
| CD24 | 30-F1 | 체육 | 1:100 | 표면 |
| 메르트크 | 2B10C42 | 체육 | 1:100 | 표면 |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | 표면 |
| CX3CR1 | SA011F11 | 체육 | 1:100 | 표면 |
| fc블록 (CD16/32) | 93 | 1:100 | 표면 |
표 2: 모노클로날 항체의 용도.
보충 그림 S1: 최상의 세포 해리는 예열 PBS + 0.5% BSA에서 5mg/mL의 콜라게나제 1에 의해 달성된다. 모든 상이한 조건에서, 0.2 mg의 DNAse I이 또한 포함되었다. 약어: BSA = 소 혈청 알부민; FSC-A = 전방 산란광의 피크 영역; L/D = 라이브/데드 염색; SF = Siglec F. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 더블릿을 포함하면 위양성 모집단이 발생할 수 있습니다. 약어: FP = 가양성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: CD45+보다 더 많은 CD45-가 죽은 세포와 일치하는 특징을 가지고 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S4: CD68에 대한 표면 염색은 폐의 개별 면역 세포 집단을 적절하게 구별하기에 적절하지 않다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
폐 면역 세포의 확인은 폐에 상주하는 여러 면역 세포 유형과 다른 조직에 거주하는 상대편에 비해 독특한 면역 표현형 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 병리학 적 조건에서 뚜렷한 표현형 특징을 가진 세포가 폐에 나타납니다. 예를 들어, 블레오마이신-유도된 폐 손상은 폐포 공간에서 순환하는 단핵구 유래 대식세포의 모집을 초래하며, 여기서 이들은 일년 동안 남아있을 수 있고 심지어 블레오마이신-유도된 섬유증 이후에도 지속될 수 있다. 조직-상주 AMs와는 달리, 순환 단핵구 유래 대식세포는 Siglec FlowCD11b+이다. 단핵구 유래 대식세포의 표적화된 고갈은 블레오마이신 매개 폐 섬유증16,40의 개선을 초래한다. 유사한 특징을 가진 세포는 인플루엔자 감염 동안 폐로 모집되고 연쇄상 구균 폐렴에 대한 장기간의 보호를 제공합니다15.
CD11c 및 MHC II 발현에 기초하여, IM은 IM1, IM2 및 IM3으로 추가로 서브분류되었다. IM1은 CD11c-MHC II-로서 정의된 면역표현형적이며; IM2는 CD11c-MHC II+로 정의되고; IM3은 MHC II+CD11c+로 정의된다. IM1, IM2 및 IM3은 별개의 대식세포 범주가 아닌 단핵구에서 대식세포 전이의 생리적 단계를 나타내며, IM3은 단핵구 구획41을 나타낸다고 제안되었다. 상기 언급된 바와 같이, MoDCs는 DC 마커 CD24에 대해 저양성이고 F4/80, CD64, 및 MERTK9,10,11,13,33,34를 포함하는 범대식세포 마커에 대해 양성이다. 그러나, 몇몇 연구는 CD64+MERKT+ 세포를 폐 대식세포로 확인4,10. IM3 및 MoDC는 모두 CD64+MERKT+MHCII+CD11C+로 정의되었으며, 이는 이들 두 집단이 동일한 세포 유형을 나타낼 가능성이 가장 높다는 것을 시사한다. 이 가설과 일치하게, 여기에 제시된 게이팅 전략은 MoDC 이외에 IM3 세포를 나타내는 별개의 집단을 식별하지 않습니다.
여기에 기술된 프로토콜의 중요한 단계는 다음을 포함한다: 1) 단일 세포 현탁액을 제조하기 전에 폐로부터 모든 인접한 지방의 제거, 이것이 판독물을 편향시킬 수 있기 때문에; 2) 투과화 전에 항-CD68 항체로 염색한다. 본 프로토콜의 한계는 상피 세포 (CD45-CD326+CD31-), 내피 세포 (CD45-CD326-CD31+) 및 섬유아세포와 같은 폐의 비면역 세포를 확인할 수 없다는 것이다. 그러한 집단의 식별은 다른 접근법을 필요로 한다28,29. 또한, 프로토콜은 세포내 마커인 CD68에 대한 염색을 필요로 하는데, 이는 조사자가 세포내 염색을 경험하지 않은 경우에 제한을 가할 수 있다. 기존 방법과 관련하여 본 프로토콜 및 게이팅 전략의 중요성은이 전략이 폐의 모든 면역 집단의 재현 가능한 식별을 허용하면서 더 적은 수의 마커를 사용하는 간소화 된 접근법을 제공한다는 것입니다.
또한, 세포 사멸을 최소화하고 폐의 면역 세포 구획의 완전한 프로파일의 확인을 허용하는 단일 세포 현탁액의 제조를 위한 상세한 방법이 제공된다. 여기에 요약된 프로토콜은 정상 상태 조건 하에서 폐 면역 집단의 특성화 및 식별을 기술하지만, 향후 적용은 폐 면역 환경에서 질병 특이적 변화를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 다양한 질병 모델에서 이러한 집단의 평가를 포함할 수 있다. 결론적으로,이 기사는 폐 단일 세포 제제를위한 간단하고 재현 가능한 프로토콜과 12 개의 다른 면역 세포 집단의 확인을위한 9 색 기반 유세포 분석 패널을 제시합니다.
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Disclosures
V.A.B.는 Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis 및 Dako가 허가한 PD-1 경로에 대한 특허를 보유하고 있습니다. 저자들은 다른 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 R01CA238263 및 R01CA229784 (VAB)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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