Summary
Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Solunum yolu dış çevre ile doğrudan temas halindedir ve çevresel antijenlere karşı istenmeyen reaksiyonları bastırırken koruma sağlamak için hassas bir şekilde düzenlenmiş bir bağışıklık sistemi gerektirir. Akciğerler, immün sürveyans sağlayan, aynı zamanda koruyucu immün yanıtlara aracılık eden doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin çeşitli popülasyonlarına ev sahipliği yapar. Sağlıklı pulmoner bağışıklık sistemini dengede tutan bu hücreler, astım, enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlara da katılırlar. Yüzey ve hücre içi proteinlerin seçici ekspresyonu, akciğerin bağışıklık hücrelerine benzersiz immünofenotipik özellikler sağlar. Sonuç olarak, akış sitometrisi, kararlı durum ve patolojik durumlar sırasında bu tür hücre popülasyonlarının tanımlanmasında etkili bir role sahiptir. Bu makale, kararlı durum koşulları altında sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerini tanımlamak için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, akciğer bağışıklık manzarasındaki hastalığa özgü değişiklikleri tanımlamaya yardımcı olmak için çeşitli hastalık modellerinde bu hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için de kullanılabilir.
Introduction
Murin solunum yolu, patojenlerle savaşmaktan ve bağışıklık homeostazını korumaktan sorumlu benzersiz bir bağışıklık sistemi içerir. Pulmoner immün sistem, fenotipleri, fonksiyonları, kökenleri ve lokalizasyonlarında önemli heterojenliğe sahip hücresel popülasyonlardan oluşur. Esas olarak fetal monositlerden köken alan yerleşik alveoler makrofajlar (AM'ler) alveoler lümende1 bulunurken, kemik iliği kaynaklı interstisyel makrofajlar (IM'ler) akciğer parankiminde bulunur2. IM'ler CD206 ifadesiyle daha da alt sınıflara ayrılabilir. CD206+ IM'ler peribronşiyal ve perivasküler bölgeyi doldururken, CD206- IM'ler alveoler interstisyumda3 bulunur. Son zamanlarda IM'lerin birkaç alt sınıflandırması önerilmiştir3,4,5,6. IM'ler AM'lerden daha az çalışılmasına rağmen, son kanıtlar akciğerin bağışıklık sisteminin düzenlenmesindeki önemli rollerini desteklemektedir7. Ek olarak, CD206 alternatif olarak aktive edilmiş AMs8 ile de ifade edilir.
Pulmoner dendritik hücreler (DC'ler), fonksiyonel özellikleri, yerleri ve kökenleri bakımından akciğer immün hücrelerinin bir başka heterojen grubudur. Akciğerde DC'lerin dört alt kategorisi tanımlanmıştır: geleneksel CD103 + DC'ler (cDC1 olarak da bilinir), geleneksel CD11b + DC'ler (cDC2 olarak da bilinir), monosit kaynaklı DC'ler (MoDC'ler) ve plazmasitoid DC'ler9,10,11,12,13. İlk üç alt sınıf majör histouyumluluk kompleksi (MHC) II+CD11c+9,10,14,15 olarak tanımlanabilir. Plazmasitoid DC'ler MHC II'yi eksprese eder ve CD11c için orta derecede pozitiftir, ancak yüksek B220 ve PDCA-19,13,16 seviyelerini eksprese eder. Naif murin akciğerlerinde, CD103 DC'ler ve CD11b DC'ler hava yolu interstisyumunda bulunurken, plazmasitoid DC'ler alveoler interstisyumda bulunur17.
İki ana monosit popülasyonu, kararlı durum sırasında akciğerde bulunur: klasik monositler ve klasik olmayan monositler. Klasik monositler Ly6C + 'dır ve başlangıçtaki enflamatuar yanıt için kritiktir. Buna karşılık, klasik olmayan monositler Ly6C'dir ve yaygın olarak anti-enflamatuar hücreler olarak görülmüştür3,16,18. Son zamanlarda, Ly6C- monositlerinden kaynaklanan ve CD206 + IMs3'e yol açan CD64 + CD16.2 + monositlerin ek bir popülasyonu tanımlanmıştır.
Eozinofiller esas olarak helmint enfeksiyonu veya alerjik durumlar sırasında akciğerlerde görülür. Bununla birlikte, yerleşik eozinofiller olarak bilinen, kararlı durum sırasında pulmoner parankimde az sayıda eozinofil vardır. Yerleşik eozinofillerin aksine, akciğer interstisyumunda ve bronkoalveoler lavajda (BAL) inflamatuar eozinofiller bulunur. Ev tozu akarı (HDM) fare modellerinde, enflamatuar eozinofiller, antijen aracılı stimülasyondan sonra akciğere alınır. Yerleşik eozinofillerin, HDM19'a T helper 2 (Th2) duyarlılığını inhibe ederek alerjide düzenleyici bir role sahip olabileceği öne sürülmüştür.
Pulmoner miyeloid hücrelerin geri kalanının aksine, nötrofiller CD68'i değil Ly6G'yi eksprese eder ve CD68-Ly6G + immünofenotip16,20,21'in bir imzası ile karakterize edilir. Görselleştirme çalışmaları, kararlı durum sırasında akciğerin intravasküler kompartmanda bir nötrofil havuzu ayırdığını ve önemli sayıda ekstravasküler nötrofil barındırdığını göstermiştir22. Eozinofillere benzer şekilde, nötrofiller BAL'da kararlı durumda bulunmaz; Bununla birlikte, LPS meydan okuması, astım veya zatürre gibi çeşitli bağışıklık stimülasyon biçimleri, nötrofilleri alveoler lümene sürer ve BAL21,22,23'te bulunmalarına neden olur.
Akciğerin CD45+ hücrelerinin önemli bir kısmı doğal öldürücü (NK), T hücreleri ve B hücrelerini temsil eder ve çoğu miyeloid belirteç için negatiftir24. Naif farelerin akciğerlerinde, bu üç hücre tipi CD11b ve MHC II18 ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir. Pulmoner CD45+ hücrelerinin yaklaşık %25'i B hücreleridir, oysa NK hücrelerinin yüzdesi akciğerde diğer lenfoid ve lenfoid olmayan dokulardan daha yüksektir24,25,26. Pulmoner T hücreleri arasında önemli bir kısmı CD4-CD8- dir ve solunum yolu enfeksiyonlarında önemli bir rol oynar26.
Akciğer, çok karmaşık ve benzersiz bir bağışıklık sistemine ev sahipliği yaptığı için, akciğer bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için çeşitli geçit stratejileri geliştirilmiş ve bildirilmiştir16,18,20,27. Burada açıklanan geçit stratejisi, 9 belirteç kullanarak 12 farklı pulmoner miyeloid ve miyeloid olmayan immün popülasyonu tanımlamak için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Sonuçları doğrulamak için ek belirteçler kullanılmıştır. Ayrıca, hücre ölümünü en aza indiren ve akciğerin bağışıklık hücresi bölmesinin en eksiksiz profilinin belirlenmesini sağlayan tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır. Epitel hücreleri (CD45-CD326+CD31-), endotel hücreleri (CD45-CD326-CD31+) ve fibroblastlar gibi akciğerin immün olmayan hücrelerinin tanımlanmasının farklı bir yaklaşım gerektirdiği unutulmamalıdır28,29. Bu tür popülasyonların tanımlanması, burada açıklanan protokol ve yönteme dahil değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm çalışmalar ve deneyler, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) göre kılavuzlar altında yürütülmüştür. Bu protokolü geliştirmek için her iki cinsiyetten altı ila on haftalık C57BL / 6 fareleri kullanıldı.
1. Cerrahi eksizyon ve doku hazırlığı
- İntraperitoneal olarak 1 mL tribromoetanol enjekte ederek fareyi ötenazi yapın (standart protokole göre hazırlanır; Malzeme Tablosu).
NOT: CO2 boğulması, akciğer çalışmalarında, akciğer hasarına neden olabileceğinden ve akciğer bağışıklık hücrelerinin özelliklerini ve özelliklerini değiştirebileceğinden kaçınılmalıdır. Servikal çıkıktan, akciğerin mekanik yaralanmasına neden olabileceğinden de kaçınılmalıdır. - Fareyi cerrahi işlem için temiz ve özel bir alana aktarın.
- Dört ekstremitede iğneler veya bant kullanarak fare sırtını yan yana doğru stabilize edin. Ventral bölgenin cildini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.
- Boyundan karnına kadar ciltte bir kesi yapın. Cildi torasik bölgeden dikkatlice çıkarın.
- Sternum ve kaburgaları dikkatlice çıkarın.
- Akciğerler tamamen beyaz olana kadar 18-21 G'lik bir iğne kullanarak 10 mL soğuk PBS'yi doğrudan sağ ventriküle enjekte ederek akciğerleri yıkayın.
- Akciğerlere dokunmadan timus ve kalbi dikkatlice çıkarın.
- Akciğerleri çevreleyen dokulardan nazikçe ayırın ve soğuk BSA tamponlu bir tüpe aktarın (Tablo 1).
NOT: Tek hücreli süspansiyonu daha fazla hazırlamadan önce tüm bitişik yağları akciğerlerden çıkarmak için çaba gösterilmelidir, çünkü bu, okumaları önyargılı hale getirebilir.
2. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
- Akciğerleri boş bir Petri kabına aktarın ve iki ince neşterle doğrayın. Kıyılmış akciğerin tüm parçalarını yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Plakayı yıkamak için 5 mL sindirim tamponu kullanın ve kıyılmış akciğeri içeren 50 mL'lik tüpe ekleyin (Tablo 1).
NOT: Sindirim tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. 5 mg/mL kollajenaz28 kullanın. 1 veya 5 mg kollajenazın BSA tamponu veya proteinsiz PBS ile birleştirilmesi sonuçları iyileştirmedi (Ek Şekil S1). - Tüpün kapağını sabitleyin ve akciğeri 37 ° C'de 150 rpm hızında yörüngesel bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca sindirin. 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Sindirimden sonra, akciğer parçalarını karıştırmak ve çözmek için 18 G'lik bir iğne kullanın. Yeni bir 50 mL konik tüpün üstüne 70 μm'lik bir filtre süzgeci yerleştirin.
NOT: Daha küçük bir mikron filtrenin kullanılması, majör miyeloid popülasyonlarının kaybına neden olabilir. - Sindirilmiş akciğer karışımını yavaşça doğrudan süzgeç üzerine aktarın. Filtredeki kalan akciğer parçalarını parçalamak için 10 mL'lik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanın. Filtre üzerindeki işlenmiş malzemeyi BSA tamponu ile yıkayın.
- Tek hücreli süspansiyonu 350 × g'da 4 °C'de 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı dikkatlice atın ve hücreleri 1 mL ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 90 sn kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyonu durdurmak için 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 7 dakika boyunca 350 × g'da santrifüj yapın.Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için süpernatantı dikkatlice atın ve peleti Boyama Tamponunda yeniden askıya alın.
- Hücreleri 5 × 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın ve yüzey boyama için kullanın (bkz. bölüm 3).
NOT: Bu amaçla, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya yerleştirin, ardından antikor boyama ve yıkayın. Bir plaka santrifüjü mevcut değilse, plakalar yerine akış tüpleri kullanın. Bu protokolle, ortalama büyüklükte 6-10 haftalık bir C57BL / 6 fareden akciğer başına ~ 15-20 × 106 hücre elde edilebilir.
3. Yüzey antikor boyama
- 96 delikli bir plakada kuyu başına 200 μL'de 1 × 106 hücre aktarın. Plakayı 4 °C'de 7 dakika boyunca 350 × g'de santrifüj yapın. Bu arada, anti-16/32 antikoru (1:100) boyama tamponunda seyrelterek Fc-blok çözeltisini hazırlayın (Tablo 1).
- Hücreleri önceden hazırlanmış Fc bloke edici çözeltinin (Malzeme Tablosu) 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve 4 ° C'de veya buz üzerinde 15-20 dakika inkübe edin.
- 150 μL boyama tamponu ekleyin ve plakayı 4 °C'de 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüj yapın. Bu arada, yüzey antikorlarını seyrelterek yüzey antikoru kokteylini hazırlayın (1:100; Tablo 2) boyama tamponunda.
NOT: (i) Fc blokajı için anti-16/32 antikoru, aynı karışımdaki yüzey antikorları ile birlikte kullanılabilir. (ii) Sabitlenebilir canlılık boyası kullanılıyorsa, 1:1.000 seyreltmede yüzey antikor kokteyline ekleyin. - Hücreleri önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 30-40 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
NOT: Hücre içi boyama gerekmiyorsa, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın ve doğrudan akış sitometresinde veri toplamaya devam edin. Alternatif olarak, hücreler daha sonra elde edilmek üzere 4 ° C'de sabitlenebilir ve saklanabilir. Hücreleri 24 saat içinde akış sitometrisi için kullanmanızı öneririz.
4. Hücre fiksasyonu ve hücre içi boyama
- FoxP3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti'nin üç parça fiksasyon/permeabilizasyon konsantresi ve 1 kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisini karıştırarak fiksasyon/permeabilizasyon tamponunu (Fix/Perm Buffer) hazırlayın (Tablo 1).
- Hücreleri, bölüm 3'te açıklandığı gibi kaplandığı 96 delikli plakanın kuyucuğu başına önceden hazırlanmış Fix/Perm Buffer'ın 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 20-25 dakika boyunca inkübe edin.
- 1x permeabilizasyon tamponu hazırlamak için 10x permeabilizasyon tamponunu arıtılmış deiyonize suda 1: 10 olarak seyreltin.
- Hücreleri 1x geçirgenlik tamponu ile bir kez yıkayın. Bu arada, hücre içi antikorları (1:100) 1 mL geçirgenlik tamponunda seyrelterek hücre içi antikor kokteylini hazırlayın.
- 96 delikli plakanın hücresi başına önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteylinin 50 μL'sini kullanarak hücreleri yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücreleri bir kez geçirgenlik tamponu ve bir kez boyama tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın.
NOT: Plaka okuyuculu bir akış sitometresi yoksa, hücreleri akış sitometri tüplerine aktarın. - Akış sitometresinde numune başına en az 1,5 × 106 hücre elde edin.
NOT: Tek renkli ve lekesiz kontrol numuneleri için numune başına 0,5-1 × 106 hücre yeterli olacaktır. Optimal boyama elde etmek ve maliyetleri azaltmak için kullanılan bireysel antikorların titreleştirilmesi önerilir. Mevcut protokol, FoxP3 boyama arabelleği seti kullanılarak hazırlanan Fix/Perm Arabelleği kullanılarak optimize edilmiştir. CD68 nükleer bir belirteç değil sitoplazmik olduğundan, çeşitli satıcılardan düşük konsantrasyonda paraformaldehit veya sitofiks / sitoperm kitleri gibi diğer geçirgenlik çözümleri yeterli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geçit stratejisi
Geçit stratejimizin ilk adımı, enkaz ve çiftlerin dışlanmasıdır (Şekil 1A). Çiftlerin dikkatli bir şekilde dışlanması, yanlış pozitif popülasyonlardan kaçınmak için kritik öneme sahiptir (Ek Şekil S2). Daha sonra, hematopoetik hücreler için bir belirteç olan CD45 + kullanılarak bağışıklık hücreleri tanımlanır (Şekil 1B). Ölü hücreleri dışlamak için canlı-ölü lekesi eklenebilir. Bununla birlikte, bu protokol CD45 + hücrelerinin% <5'inin ölümüyle sonuçlanır (Şekil 1C), oysa daha fazla CD45 hücresi ölü olarak tanımlanır (Ek Şekil S3).
Monositleri ve nötrofilleri tanımlamak için, bu popülasyonların her biri için spesifik antikorlar kullanan önceki çalışmaların aksine16,18, hem Ly6C + hem de Ly6G + hücrelerini tanımlayan bir anti-GR-1 antikoru kullanmayı tercih ediyoruz. Anti-GR-1 antikorunun anti-CD68 ile birlikte kullanılması, akciğer immün hücrelerinin üç kümeye ayrılmasını sağlar: CD68-GR-1+, CD68+(GR-1+ veya GR-1- olarak daha fazla tanımlanabilir) ve CD68-GR-1-/int (Şekil 1D). CD68, ağırlıklı olarak hücre içi olarak tespit edilen bir belirteçtir. Yüzey CD68 incelendi ancak fiksasyon/geçirgenlik sağlanmadan tespit edilemedi (Ek Şekil S4).
Polimorfonükleer hücreler (nötrofiller) CD45+CD68-GR-1+CD11b+ olarak tanımlandı (Şekil 1E). Bu sonuçlar, GR1 ile birlikte, polimorfonükleer nötrofiller için benzersiz bir belirteç olan Ly6G için spesifik bir antikor kullanılarak doğrulandı (Şekil 216,18,27). CD45+CD68-GR-1-/int popülasyonunda yaklaşık %10-20'si MHCII- ve CD11blow'dur ve NK hücrelerini temsil eder (Şekil 1F). NK hücreleri için benzersiz bir belirteç olan NK1.1, bunu doğrulamak için kullanıldı (Şekil 3)25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b- popülasyonu MHCII-T hücreleri ve MHCII+B hücrelerinden oluşur (Şekil 1F). Sırasıyla T hücrelerini ve B hücreleri-CD3 ve B220'yi doğrulamak için iki ek antikor kullanıldı (Şekil 3).
Kararlı durum koşulları altındaki sağlıklı farelerde, BAL'da tespit edilen CD45 + hücrelerinin çoğunluğu, hava yollarının ana sakinleri olan AM'lerdir. Bu nedenle, AMs20,31'i karakterize eden belirteçleri değerlendirmek için BAL yapıldı. Bu hücreler CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c + 'dır, ancak diğer miyeloid hücrelerin aksine, yüksek CD11b seviyelerini eksprese etmezler (Şekil 4). Aynı immün belirteçler kombinasyonu, toplam akciğerlerin homojenatlarındaki AM'leri de tanımlar (Şekil 1G, H). AM'lere ek olarak, CD45 + CD68 + Sigle-F + kapısında (Şekil 1G), CD11b için pozitif olan ancak CD11c için pozitif olmayan farklı bir hücre popülasyonu vardır. Bu CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- lökosit popülasyonu eozinofilleri temsil eder (Şekil 1G)19,32.
CD45+CD68+SiglecF- hücrelerinin bulunduğu kapıda (Şekil 1G), pulmoner DC'leri temsil eden CD11c+MHC+ popülasyonu bulunmaktadır (Şekil 1I). Birçok araştırmacı pulmoner DC'leri CD11c + MHCII + CD24 + 16,18 olarak tanımlamaktadır. CD24 ekspresyonu bu popülasyonun kimliğini doğrulamak için değerlendirildi (Şekil 5A). Akciğer DC'lerinin çoğunluğu CD103+CD11b- veya CD103-CD11b+'dır (Şekil 1J). CD103 + CD11b- DC'ler CD103 + geleneksel DC'leri temsil eder ve CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103 + CD11b- olarak tanımlanır. Buna karşılık, CD103-CD11b + DC'ler, CD64 ekspresyonuna göre geleneksel DC'lere ve MoDC'lere ayrılır (Şekil 1K). Bu nedenle, geleneksel CD11b + DC'ler CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64- olarak tanımlanırken, MoDC'ler CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 + olarak tanımlanır. . Geleneksel DC'lerin aksine, MoDC'ler DC markörü CD24 için düşük pozitiftir ve F4/80, CD64 ve MERTK dahil olmak üzere pan-makrofaj belirteçleri için pozitiftir (Şekil 5A)9,10,11,13,33,34.
IM'ler ve klasik ve klasik olmayan monositler CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ kapısında (Şekil 1L) bulunur ve CD64 ve GR-1 ekspresyonuna göre ayırt edilir (Şekil 1M). Bir pan-makrofaj belirteci olan CD64, esas olarak IM'ler ve AM'lerin yanı sıra DC'lerin bir alt kümesi ile ifade edilir. Klasik monositler ayrıca Ly6C + monositler ve klasik olmayan monositler Ly6C monositleri olarak da bilinir. Hem monositler hem de IM'ler Ly6G için negatiftir; Bununla birlikte, klasik monositler Ly6C'yi eksprese eder ve bu nedenle GR-1 için pozitiftir. Buna karşılık, hem interstisyel makrofajlar hem de klasik olmayan monositler GR-1 ve Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36 için negatiftir. Ek olarak, klasik olmayan monositler CD11cint, klasik monositler CD11c- 'dir. CD11c ekspresyonundaki bu fark, başlangıçta iki tip monositi ayırt etmek için genellikle önemsiz olsa da, klasik monositlerin biriktiği patolojik durumlar için kritik olabilir. Yukarıdakilere dayanarak, interstisyel makrofajlar CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64 + , klasik monositler CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64- ve klasik olmayan monositler CD45 + CD68 + CD11c - / intCD11b + GR-1-CD64- olarak tanımlanır. . Hem AM'ler hem de IM'ler, CD68, CD64, F4/80 ve MERTK proto-onkogen dahil olmak üzere tüm makrofaj belirteçleri için pozitiftir. Bununla birlikte, IM'lerin aksine, AM'ler CX3CR1'dir, IM'lerin aksine, iki tip akciğer makrofajının kökenindeki farkla açıklanabilir4,37,38,39 (Şekil 5B).
Şekil 1: Murin akciğerinde bulunan immün hücrelerin geçiş stratejisi. Enkaz, çiftler, ölü hücreler ve immün olmayan hücrelerin (CD45-) (A-C) dikkatli bir şekilde dışlanmasından sonra, CD45 + hücreleri CD68 ve GR-1 (D) ekspresyonuna dayanarak 3 ana kümeye ayrıldı. Nötrofiller CD68-GR-1+ popülasyonuna (E) aitken, CD68-GR-1-/int popülasyonu NK hücreleri, B hücreleri ve T hücrelerinden (F) oluşur. CD68 + hücreleri ayrıca AM'ler ve eozinofiller (H) olan Siglec F + hücrelerine (G) ve monositler, IM'ler ve DC'lerden (I-M) oluşan Siglec F hücrelerine (G) ayrılabilir. Kısaltmalar: SSC-A = yandan dağınık ışığın tepe alanı; FSC-A = ileri saçılan ışığın tepe alanı; SSC-H = yandan dağınık ışığın tepe yüksekliği; L/D = canlı/ölü boyama; MHC = majör histouyumluluk kompleksi; SF = Siglec F; GR-1 = GPI'ya bağlı miyeloid farklılaşma belirteci (Ly-6G); NK = doğal katil; IM'ler = interstisyel makrofajlar; DC'ler = dendritik hücreler; AM'ler = alveoler makrofajlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akciğerdeki Ly6G sadece polimorfonükleer nötrofiller olarak tanımlanan CD45+CD68-GR-1+CD11b+ hücreleri ile eksprese edilir.
Şekil 3: NK hücrelerinin, T hücrelerinin ve B hücrelerinin tanımlanmasının geçit stratejisi ile doğrulanması. NK 1.1, CD3 ve B220'ye özgü belirteçler, sırasıyla NK hücrelerinin, T hücrelerinin ve B hücrelerinin tanımlanmasını doğrulamak için kullanıldı. NKT hücrelerinin, eğer varsa, NK hücre kapısı içindeki CD3 + hücre popülasyonuna düşebileceği ve NK'nin NKT hücreleri ile kontaminasyonunu önlemek için dikkatli olunması gerektiği belirtilmelidir. Kısaltmalar: NK = doğal katil; MHC = majör histouyumluluk kompleksi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Naif farelerde bronkoalveoler lavaj ile elde edilen immün hücrelerin çoğunluğu alveoler makrofajlardır. Kısaltmalar: AMs = alveolar makrofajlar; DC'ler = dendritik hücreler; IM = interstisyel makrofaj; SSC-A = yandan dağınık ışığın tepe alanı; FSC-A = ileri saçılan ışığın tepe alanı; SSC-H = yandan dağınık ışığın tepe yüksekliği; SF = Siglec F; GR-1 = GPI'ya bağlı miyeloid farklılaşma belirteci (Ly-6G). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İmmün hücrelerdeki farklı belirteçlerin ekspresyonunun karşılaştırılması. (A) Pulmoner DC'lerde CD24, CD64, MERTK, F4/80 ve CD103 ekspresyonlarının karşılaştırılması. (B) Pulmoner makrofajlarda ve monositlerde CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b ve CX3CR1'in karşılaştırılması. Kısaltmalar: DC'ler = dendritik hücreler; MoDC'ler = monosit türevi DC'ler; AM'ler = alveoler makrofajlar; IM'ler = interstisyel makrofajlar; SF = Siglec F; MERTK = miyeloid-epitelyal-üreme tirozin kinaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| BSA tamponu | PBS + %0.5 Sığır serum albümini | ||
| Sindirim tamponu | Önceden ısıtılmış (37 °C) BSA tamponu + 5 mg/mL kollajenaz tip 1 + 0.2 mg/mL DNaz I | ||
| Boyama tamponu | PBS + %2,5 FBS | ||
| Sabit/Perm Arabelleği | Foxp3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti'nin üç kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisi ve 1 kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisi | ||
| Geçirgenlik tamponu | Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tamponu Seti'nden 10x geçirgenleştirme tamponu, arıtılmış deiyonize suda 10 kez seyreltilmiş | ||
Tablo 1: Arabellek.
| Antijen | Klon | Florokrom | Seyreltme | Yüzey/hücre içi |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | yüzey |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 Serisi | 1:100 | yüzey |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | hücre içi |
| CD11b | M1/70 Serisi | PECy7 | 1:100 | yüzey |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | yüzey |
| CD11c | N418 Serisi | BV650 veya BV510 | 1:100 | yüzey |
| CD64 | X54-5/7,1 | PE/Göz Kamaştırıcı 594 | 1:100 | yüzey |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 Serisi | 1:100 | yüzey |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | yüzey |
| Canlı / Ölü Düzeltilebilir Uzak Okuma Ölü Hücre Leke Kiti | FarRed (APC) veya Aqua (BV510) | 1:1000 | yüzey | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | yüzey |
| B220 Serisi | RA3-6B2 Serisi | AF488 Serisi | 1:100 | yüzey |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | yüzey |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | yüzey |
| cesaret | 2B10C42 | PE | 1:100 | yüzey |
| F4/80 | BM8 Serisi | BV605 Serisi | 1:100 | yüzey |
| CX3CR1 Serisi | SA011F11 Serisi | PE | 1:100 | yüzey |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | yüzey |
Tablo 2: Monoklonal antikorların kullanımı.
Ek Şekil S1: En iyi hücresel ayrışma, önceden ısıtılmış PBS +% 0.5 BSA'da 5 mg / mL kollajenaz 1 ile elde edilir. Tüm farklı koşullarda, 0.2 mg DNAse I de dahil edildi. Kısaltmalar: BSA = sığır serum albümini; FSC-A = ileri saçılan ışığın tepe alanı; L/D = canlı/ölü boyama; SF = Siglec F. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Çiftlerin dahil edilmesi yanlış pozitif popülasyonlara neden olabilir. Kısaltma: FP = yanlış pozitif. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: CD45'ten daha fazla CD45- ölü hücrelerle tutarlı özelliklere sahiptir.
Ek Şekil S4: CD68 için yüzey boyaması, akciğerin bireysel bağışıklık hücresi popülasyonlarını doğru bir şekilde ayırt etmek için yeterli değildir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pulmoner immün hücrelerin tanımlanması, akciğerde bulunan çoklu immün hücre tipleri ve diğer dokularda bulunan muadillerine kıyasla benzersiz immünofenotipik özellikleri nedeniyle zor olabilir. Çeşitli patolojik durumlarda, akciğerlerde farklı fenotipik özelliklere sahip hücreler ortaya çıkar. Örneğin, bleomisin kaynaklı akciğer hasarı, alveolar boşlukta dolaşımdaki monosit kaynaklı makrofajların işe alınmasıyla sonuçlanır, burada bir yıl kadar kalabilirler ve hatta bleomisin kaynaklı fibrozdan sonra bile devam edebilirler. Dokuda yerleşik AM'lerin aksine, dolaşımdaki monosit kaynaklı makrofajlar Siglec FlowCD11b +'dır. Monosit kaynaklı makrofajların hedefe yönelik tükenmesi, bleomisin aracılı pulmoner fibrozisin iyileştirilmesi ile sonuçlanır16,40. Benzer özelliklere sahip hücreler influenza enfeksiyonu sırasında akciğerlere alınır ve streptokok pnömonisine karşı uzun süreli koruma sağlar15.
CD11c ve MHC II ifadesine dayanarak, IM'ler IM1, IM2 ve IM3 olarak daha da alt kategorilere ayrılmıştır. IM1, immünofenotipik olarak CD11c-MHC II- olarak tanımlanır; IM2, CD11c-MHC II+ olarak tanımlanır; ve IM3 MHC II+CD11c+ olarak tanımlanır. IM1, IM2 ve IM3'ün, farklı makrofaj kategorilerinden ziyade, monositin makrofaja geçişinin fizyolojik aşamalarını temsil ettiği ve IM3'ün monositik bölmeyi temsil ettiği öne sürülmüştür41. Yukarıda belirtildiği gibi, MoDC'ler DC markörü CD24 için düşük pozitiftir ve F4/80, CD64 ve MERTK9,10,11,13,33,34 dahil olmak üzere pan-makrofaj belirteçleri için pozitiftir. Bununla birlikte, birçok çalışma CD64 + MERKT + hücrelerini pulmoner makrofajlar olarak tanımlamaktadır4,10. Hem IM3 hem de MoDC'ler CD64 + MERKT + MHCII + CD11C + olarak tanımlanmıştır, bu da bu iki popülasyonun büyük olasılıkla aynı hücre tipini temsil ettiğini düşündürmektedir. Bu hipotezle tutarlı olarak, burada sunulan geçit stratejisi, MoDC'lere ek olarak IM3 hücrelerini temsil eden ayrı bir popülasyon tanımlamamaktadır.
Burada açıklanan protokolün kritik adımları şunları içerir: 1) tek hücreli süspansiyonu hazırlamadan önce tüm bitişik yağların akciğerlerden uzaklaştırılması, çünkü bu, okumaları önyargılı hale getirebilir; 2) anti-CD68 antikoru ile boyanmadan önce geçirgenlik. Mevcut protokolün bir sınırlaması, epitel (CD45-CD326 + CD31-), endotel hücreleri (CD45-CD326-CD31 +) ve fibroblastlar gibi akciğerin immün olmayan hücrelerini tanımlayamamasıdır. Bu tür popülasyonların tanımlanması farklı bir yaklaşım gerektirir28,29. Ek olarak, protokol, hücre içi bir belirteç olan CD68 için boyama gerektirir; bu, araştırmacının hücre içi boyamada deneyimli olmaması durumunda bir sınırlama oluşturabilir. Mevcut protokolün ve geçit stratejisinin mevcut yöntemlere göre önemi, bu stratejinin akciğerin tüm immün popülasyonlarının tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanmasına izin verirken daha az sayıda belirteç kullanan akıcı bir yaklaşım sağlamasıdır.
Ayrıca, hücre ölümünü en aza indiren ve akciğerin bağışıklık hücresi bölmesinin tam bir profilinin tanımlanmasına izin veren tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır. Burada özetlenen protokol, kararlı durum koşulları altında akciğer immün popülasyonlarının karakterizasyonunu ve tanımlanmasını tanımlasa da, gelecekteki uygulamalar, bu popülasyonların, akciğer bağışıklık manzarasındaki hastalığa özgü değişikliklerin tanımlanmasına yardımcı olabileceği çeşitli hastalık modellerinde değerlendirilmesini içerebilir. Sonuç olarak, bu makalede akciğer tek hücreli preparasyon için basit ve tekrarlanabilir bir protokol ve 12 farklı immün hücre popülasyonunun tanımlanması için 9 renk tabanlı akış sitometri paneli sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B., Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis ve Dako tarafından lisanslanan PD-1 yolu üzerinde patentlere sahiptir. Yazarlar başka hiçbir rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibeleri R01CA238263 ve R01CA229784 (VAB) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
