Summary
I denna studie presenterar vi ett effektivt och reproducerbart protokoll för att isolera immunpopulationerna i murin andningsorganen. Vi tillhandahåller också en metod för identifiering av alla medfödda och adaptiva immunceller som finns i lungorna hos friska möss, med hjälp av en 9-färgbaserad flödescytometripanel.
Abstract
Luftvägarna är i direkt kontakt med omvärlden och kräver ett exakt reglerat immunsystem för att ge skydd samtidigt som oönskade reaktioner på miljöantigener undertrycks. Lungor är värd för flera populationer av medfödda och adaptiva immunceller som ger immunövervakning men också förmedlar skyddande immunsvar. Dessa celler, som håller det friska lungimmunsystemet i balans, deltar också i flera patologiska tillstånd som astma, infektioner, autoimmuna sjukdomar och cancer. Selektivt uttryck av ytan och intracellulära proteiner ger unika immunophenotypic egenskaper till immuncellerna i lungan. Följaktligen har flöde cytometri en avgörande roll i identifieringen av sådana cellpopulationer under steady-state och patologiska villkor. Detta dokument presenterar ett protokoll som beskriver en konsekvent och reproducerbar metod för att identifiera immunceller som finns i lungorna hos friska möss under steady-state förhållanden. Detta protokoll kan dock också användas för att identifiera förändringar i dessa cellpopulationer i olika sjukdomsmodeller för att identifiera sjukdomsspecifika förändringar i lungens immunlandskap.
Introduction
Murin luftvägarna innehåller ett unikt immunsystem som ansvarar för att bekämpa patogener och upprätthålla immun homeostas. Lungimmunsystemet består av cellulära populationer med betydande heterogenitet i deras fenotyp, funktion, ursprung och plats. Resident alveolar makrofager (AMs), härrör främst från fetala monocyter, bor i alveolar lumen1, medan benmärg-härledda interstitial makrofager (IMs) bor i lung parenchyma2. IM kan ytterligare underklassificeras genom uttrycket av CD206. CD206+ IMs fyller peribronchial- och perivascular-området, medan CD206-IMs finns vid alveolar interstitium3. Några underklassificeringar av IM har föreslagits nyligen3,4,5,6. Även om IM är mindre studerade än AMs, stöder nya bevis deras avgörande roll i regleringen av immunsystemet i lung7. Dessutom uttrycks CD206 också i alternativt aktiverade AMs8.
Lung dendritiska celler (DCs) är en annan heterogen grupp av lung immunceller med avseende på deras funktionella egenskaper, plats och ursprung. Fyra underkategorier av DCs har beskrivits i lungan: konventionella CD103 + DCs (även känd som cDC1), konventionella CD11b + DCs (även känd som cDC2), monocyt-härledda DCs (MoDC) och plasmacytoid DCs9,10,11,12,13. De tre första underklasserna kan definieras som större histokompatibilitetskomplex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrycker MHC II och är mellanliggande positiva för CD11c men uttrycker höga nivåer av B220 och PDCA-19,13,16. I naiva murin lungor, CD103 DCs och CD11b DCs finns i luftvägarna interstitium, medan plasmacytoid DCs finns i alveolar interstitium17.
Två stora populationer av monocyter bor i lungan under steady state: klassiska monocyter och icke-klassiska monocyter. Klassiska monocyter är Ly6C+ och är kritiska för det första inflammatoriska svaret. Däremot är icke-klassiska monocyter Ly6C- och har allmänt setts som antiinflammatoriska celler3,16,18. Nyligen beskrevs en ytterligare population av CD64 + CD16.2 + monocyter, som härstammar från Ly6C- monocyter och ger upphov till CD206 + IMs3.
Eosinofiler förekommer främst i lungorna under helminthinfektion eller allergiska tillstånd. Det finns dock ett litet antal eosinofiler i lungparenkym under steady state, känd som bosatta eosinofiler. I motsats till de bosatta eosinofilerna finns inflammatoriska eosinofiler i lunginterstitium och bronchoalveolar lavage (BAL). I musmodeller av husdammmyt (HDM) rekryteras inflammatoriska eosinofiler i lungan efter antigenmedierad stimulering. Det har föreslagits att bosatta eosinofiler kan ha en regulatorisk roll i allergi genom att hämma T helper 2 (Th2) sensibilisering till HDM19.
I motsats till resten av lung myeloiska celler uttrycker neutrofiler Ly6G men inte CD68 och kännetecknas av en signatur av CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har visat att under steady state reserverar lungan en pool av neutrofiler i det intravaskulära utrymmet och är värd för ett stort antal extravaskulära neutrofiler22. I likhet med eosinofiler finns neutrofiler inte i BAL i stabilt tillstånd; emellertid, flera former av immunstimulering, såsom LPS utmaning, astma eller lunginflammation, driva neutrofiler i alveolar lumen, vilket resulterar i deras närvaro i BAL21,22,23.
Ett betydande antal CD45 + celler i lungan representerar naturliga mördare (NK), T-celler och B celler och är negativa för de flesta myeloiska markörer24. I lungorna hos naiva möss kan dessa tre celltyper identifieras baserat på uttrycket av CD11b och MHC II18. Omkring 25% av lung-CD45+-cellerna är B-celler, medan andelen NK-celler är högre i lungan än andra lymfoida och icke-lymfoida vävnader24,25,26. Bland lung-T-celler är en betydande fraktion CD4-CD8- och spelar en viktig roll vid luftvägsinfektioner26.
Eftersom lungan är värd för ett mycket komplext och unikt immunsystem har flera gating strategier för identifiering av lung immunceller utvecklats och rapporterats16,18,20,27. Gating strategi beskrivs häri ger ett omfattande och reproducerbart sätt att identifiera upp till 12 olika pulmonell myeloiska och icke-myeloiska immunpopulationer med 9 markörer. Ytterligare markörer har använts för att validera resultaten. Dessutom tillhandahålls en detaljerad metod för beredning av en encellssuspension som minimerar celldöd och gör det möjligt att identifiera den mest kompletta profilen av lungens immuncellsfack. Det bör noteras att identifiering av icke-immuna celler i lungan, såsom epitelceller (CD45-CD326+CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) och fibroblaster kräver ett annat tillvägagångssätt28,29. Identifiering av sådana populationer ingår inte i det protokoll och den metod som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier och experiment som beskrivs i detta protokoll utfördes enligt riktlinjer enligt Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Beth Israel Deaconess Medical Center. Sex till tio veckor gamla C57BL/6 möss av båda könen användes för att utveckla detta protokoll.
1. Kirurgisk excision och vävnadsberedning
- Avliva musen genom att intraperitoneally injicera 1 ml tribromoetanol (beredd enligt standardprotokoll; Tabell över material).
OBS: CO2 kvävning bör undvikas i lungstudier eftersom det kan orsaka lungskada och ändra funktionerna och egenskaperna hos lung immunceller. Livmoderhalscancer förskjutning bör också undvikas eftersom det kan orsaka mekanisk skada i lungan. - Överför musen till ett rent och dedikerat område för kirurgisk operation.
- Stabilisera musens dorsala sida nedåt med hjälp av nålar eller tejp på de fyra extremiteterna. Använd 70% etanol för att sanera huden i ventralområdet.
- Utför ett snitt i huden, från nacken till buken. Ta försiktigt bort huden från bröstområdet.
- Ta försiktigt bort bröstbenet och revbenen.
- Spola lungorna genom att injicera 10 ml kall PBS direkt i höger kammare, med en 18-21 G nål, tills lungorna blir helt vita.
- Ta försiktigt bort tymus och hjärta utan att röra lungorna.
- Lossa försiktigt lungorna från de omgivande vävnaderna och överför dem till ett rör med kall BSA-buffert (tabell 1).
OBS: Ansträngningar bör göras för att ta bort allt angränsande fett från lungorna innan ytterligare förbereda encellsupphängningen, eftersom detta kan snedvrida avläsningarna.
2. Beredning av encellsfjädring
- Överför lungorna till en tom Petri-maträtt och hacka dem med två fina skalpeller. Överför alla bitar av den malda lungan till ett nytt koniskt rör på 50 ml. Använd 5 ml rötningsbuffert för att tvätta plattan och tillsätt den i 50 ml-röret som innehåller den malda lungan (tabell 1).
OBS: Digestionsbufferten bör beredas omedelbart före användning. Använd 5 mg/ml kollagenas28. Kombinationen av 1 eller 5 mg kollagenas med BSA-buffert eller proteinfri PBS förbättrade inte resultaten (kompletterande figur S1). - Fäst locket på röret och smält lungan i 30 minuter på en orbital shaker med en hastighet av 150 rpm vid 37 °C. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ml kall BSA-buffert.
- Efter matsmältningen, använd en 18 G nål för att blanda och lösa upp lungbitarna. Placera en 70 μm filtersil högst upp på ett nytt koniskt rör på 50 ml.
OBS: Användning av ett mindre mikronfilter kan leda till förlust av större myeloiska populationer. - Överför långsamt den smälta lungblandningen direkt på silen. Använd gummisidan på en 10 ml sprutkolv för att krossa de återstående lungbitarna på filtret. Tvätta det bearbetade materialet på filtret med BSA-buffert.
- Centrifugera encellsfjädringen vid 350 × g i 8 min vid 4 °C.
- Kassera försiktigt supernatanten och återanvänd cellerna i 1 ml ACK lysbuffert. Blanda väl med en 1 mL pipet och inkubera i 90 s vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 ml kall BSA-buffert för att stoppa reaktionen och centrifugera vid 350 × g i 7 min vid 4 °C. Kassera försiktigt supernatanten och återanslut pelleten i färgningsbufferten för att räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Återanvänd cellerna i en koncentration av 5 × 106 celler/ml och använd dem för ytfärgning (se avsnitt 3).
OBS: För detta ändamål, plätera cellerna i en 96-väl rundbottenplatta följt av antikroppsfärgning och tvättar. Om en plattcentrifuger inte finns tillgänglig, använd flödesrör istället för plattor. Med detta protokoll kan ~15-20 × 106 celler per lunga erhållas från en 6-10 veckor gammal C57BL/6 mus av genomsnittlig storlek.
3. Färgning av ytantikropp
- Överför 1 × 106 celler i 200 μL per brunn i en 96-välplatta. Centrifugera plattan vid 350 × g i 7 min vid 4 °C. Under tiden bereder du Fc-blocklösningen genom att späda ut anti-16/32-antikroppen (1:100) i färgbuffert (tabell 1).
- Återutnyttja cellerna i 50 μL av den förberedda Fc-blockerande lösningen (Materialtabell) och inkubera i 15-20 min vid 4 °C eller på is.
- Tillsätt 150 μL färgbuffert och centrifugera plattan vid 350 × g i 5 min vid 4 °C. Förbered under tiden ytantikroppscocktailen genom att späda ytantikroppar (1:100; Tabell 2) i färgningsbuffert.
OBS: i) Anti-16/32 antikropp för Fc-blockering kan användas med ytantikropparna i samma blandning. ii) Om fixerbart bärkraftsfärgämne används, tillsätt det till ytan antikroppscocktail vid en utspädning av 1:1,000. - Återutnyttja cellerna i 50 μL av den förberedda antikroppscocktailen på ytan och inkubera i 30-40 min vid 4 °C i mörker. Tvätta cellerna med färgbuffert två gånger.
OBS: Om ingen intracellulär färgning krävs, återanvänd cellerna i 200 μL färgbuffert och fortsätt direkt till förvärvet av data på flödescytometern. Alternativt kan celler fixeras och lagras vid 4 °C för förvärv senare. Vi rekommenderar att du använder cellerna för flödescytometri inom 24 timmar.
4. Cellfixering och intracellulär färgning
- Förbered fixerings-/permeabiliseringsbufferten (Fix/Perm Buffer) genom att blanda tre delar av fixerings-/permeabiliseringskoncentratet och 1 del av fixerings-/permeabiliseringsdunens spädning av FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (tabell 1).
- Återutnyttja cellerna i 50 μL av den förberedda Fix/Perm Buffer per brunn på 96-brunnsplattan, där cellerna pläterades enligt beskrivningen i avsnitt 3, och inkubera dem i 20-25 min vid 4 °C i mörker.
- Späd 10x permeabiliseringsbufferten som 1: 10 i renat avjoniserat vatten för att förbereda 1x permeabiliseringsbuffert.
- Tvätta cellerna en gång med 1x permeabiliseringsbuffert. Under tiden, förbereda den intracellulära antikropp cocktailen genom att späda intracellulära antikroppar (1:100) i 1 ml permeabilisering buffert.
- Resuspend cellerna med 50 μL av den förberedda ytantikroppscocktailen per cell på 96-brunnsplattan och inkubera i 40 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna en gång med permeabiliseringsbuffert och en gång med färgbuffert. Efter den slutliga tvätten återanvänder du cellerna i 200 μL färgbuffert.
OBS: Om det inte finns någon flödescytometer med plattläsare, överför cellerna till flödescytometrirör. - Skaffa minst 1,5 × 106 celler per prov på flödescytometern.
OBS: För enstaka färger och ouppfyllda kontrollprover räcker det med 0,5-1 × 106 celler per prov. Det rekommenderas att titera de enskilda antikropparna som används för att uppnå optimal färgning och minska kostnaderna. Det nuvarande protokollet har optimerats med Fix/Perm Buffer som beretts med FoxP3-färgbuffertuppsättningen. Eftersom CD68 är en cytoplasma och inte en kärnmarkör, kan andra permeabiliseringslösningar som en låg koncentration av paraformaldehyd eller cytofix / cytopermsatser från olika leverantörer vara tillräckliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating-strategi
Det första steget i vår gitterstrategi är uteslutandet av skräp och dubbletter (figur 1A). Noggrann uteslutning av dubbletter är avgörande för att undvika falskt positiva populationer (kompletterande figur S2). Sedan identifieras immunceller med HJÄLP AV CD45+, en markör för hematopoetiska celler (figur 1B). Den levande döda fläcken kan läggas till för att utesluta döda celler. Detta protokoll resulterar dock i att <5% av CD45+ cellerna (figur 1C) dör, medan fler CD45- celler identifieras som döda (kompletterande figur S3).
För att identifiera monocyter och neutrofiler, i motsats till tidigare studier som använde specifika antikroppar för var och en av dessa populationer16,18, föredrar vi att använda en anti-GR-1-antikropp som identifierar både Ly6C+ och Ly6G+-celler. Genom att använda anti-GR-1-antikroppen tillsammans med anti-CD68 kan lung immuncellerna separeras i tre kluster: CD68-GR-1+, CD68+(som ytterligare kan identifieras som GR-1+ eller GR-1-) och CD68-GR-1-/int (figur 1D). CD68 är en markör som främst detekteras intracellulärt. Surface CD68 undersöktes men kunde inte upptäckas utan fixering/permeabilization (Kompletterande figur S4).
Polymorphonuclear celler (neutrophils) identifierades som CD45 +CD68-GR-1+CD11b+ (figur 1E). Dessa resultat verifierades med GR1 tillsammans med en antikropp specifik för Ly6G (figur 2), en unik markör för polymorfonukleära neutrofiler16,18,27. Inom CD45+CD68-GR-1-/int populationen är cirka 10-20% MHCII- och CD11blow och representerar NK-cellerna (figur 1F). NK1.1, en unik markör för NK-celler, användes för att bekräfta detta (figur 3)25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b- populationen består av MHCII- T-celler och MHCII+ B-celler (figur 1F). Ytterligare två antikroppar användes för att verifiera T-celler och B-celler-CD3 respektive B220 (figur 3).
Hos friska möss under steady-state-förhållanden är majoriteten av CD45 + celler som detekteras i BAL AMs, de viktigaste invånarna i luftvägarna. Därför utfördes BAL för att bedöma de markörer som kännetecknar AMs20,31. Dessa celler är CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+ men uttrycker, till skillnad från andra myeloiska celler, inte höga nivåer av CD11b (figur 4). Samma kombination av immunmarkörer identifierar också AMs i homogenater av totala lungor (figur 1G, H). Förutom AMs, i CD45 + CD68 + Sigle-F + gate (figur 1G), finns det en distinkt cellpopulation som är positiv för CD11b men inte för CD11c. Denna CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- population av leukocyter representerar eosinofiler (figur 1G)19,32.
I porten med CD45+CD68+SiglecF-cellerna (figur 1G) finns en CD11c+MHC+-population som representerar lung-DCs (figur 1I). Flera prövare identifierar lung-DCs som CD11c +MHCII+CD24+16,18. CD24-uttrycket bedömdes bekräfta denna populations identitet (figur 5A). Majoriteten av lung-DCs är antingen CD103 +CD11b- eller CD103-CD11b+ (figur 1J). CD103+CD11b- DCs representerar CD103+ konventionella DCs och identifieras som CD45 +CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. CD103-CD11b+ DCs är däremot indelade i konventionella DCs och MoDC baserade på CD64-uttryck (figur 1K). Därför identifieras konventionella CD11b+ DCs som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64 - medan MoDC:erna identifieras som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . Till skillnad från konventionella DC är moDC:er lågpositiva för DC-markören CD24 och positiva för pan-makrofagmarkörer, inklusive F4/80, CD64 och MERTK (figur 5A)9,10,11,13,33,34.
IMs och klassiska och icke-klassiska monocyter finns i CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ grinden (figur 1L) och utmärks baserat på CD64- och GR-1-uttryck (figur 1M). CD64, en pan-makrofagmarkör, uttrycks främst av IMs och AMs, liksom en delmängd av DCs. Klassiska monocyter är också kända som Ly6C + monocyter och icke-klassiska monocyter som Ly6C- monocyter. Både monocyter och IM är negativa för Ly6G; klassiska monocyter uttrycker dock Ly6C och är därför positiva för GR-1. Däremot är både interstitiella makrofager och icke-klassiska monocyter negativa för GR-1 och Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Dessutom är icke-klassiska monocyter CD11cint, medan klassiska monocyter är CD11c-. Även om denna skillnad i CD11c uttryck är i allmänhet obetydlig för att skilja de två typerna av monocyter vid baslinjen, kan det vara avgörande för patologiska villkor när klassiska monocyter ackumuleras. Baserat på ovanstående definieras interstitiella makrofager som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, klassiska monocyter som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD11c-CD11c+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD11c-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD68+CD11c-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD11c-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD11c-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, och icke-klassiska monocyter som CD45+CD68+CD68+CD11c-CD11c-CD11b . Både AMs och IM är positiva för alla makrofag markörer, inklusive CD68, CD64, F4/80 och MERTK proto-oncogene. Till skillnad från IM är dock AMs CX3CR1-, till skillnad från IM, vilket kan förklaras av skillnaden i ursprunget för de två typerna av lungmakrofager4,37,38,39 (figur 5B).
Figur 1: Gating strategi för immunceller som finns i murin lungan. Efter noggrann uteslutning av skräp, dubbletter, döda celler och icke-immunceller (CD45-) (A-C), CD45 + celler separerades i 3 huvud kluster baserat på uttrycket av CD68 och GR-1 (D). Neutrofiler tillhör CD68-GR-1+ populationen (E) medan CD68-GR-1-/int populationen består av NK-celler, B-celler och T-celler (F). CD68+ celler kan delas in ytterligare i Siglec F+ celler (G), som är AMs och eosinophils (H), och Siglec F- cells (G), som består av monocyter, IMs och DCs (I-M). Förkortningar: SSC-A = toppområde för sidostrött ljus; FSC-A = toppområde för framåtspritt ljus; SSC-H = topphöjd för sidost utspritt ljus; L/D = levande/död färgning; MHC = stort histokompatibilitetskomplex; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-länkad myeloisk differentieringsmarkör (Ly-6G); NK = naturlig mördare; IMs = interstitiella makrofager; DCs = dendritiska celler; AMs = alveolar makrofager. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Ly6G i lungan uttrycks endast av CD45+CD68-GR-1+CD11b+-celler som identifierats som polymorfonukleära neutrofiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Verifiering av identifiering av NK-celler, T-celler och B-celler genom gatingstrategin. Markörer som är specifika för NK 1.1, CD3 och B220 användes för att verifiera identifieringen av NK-celler, T-celler respektive B-celler. Det bör noteras att NKT-celler, om de finns, kan falla i CD3 + cellpopulationen inom NK-cellporten, och försiktighet krävs för att undvika kontaminering av NK med NKT-celler. Förkortningar: NK = natural killer; MHC = stort histokompatibilitetskomplex. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Majoriteten av de immunceller som erhålls genom bronchoalveolar lavage hos naiva möss är alveolar makrofager. Förkortningar: AMs = alveolar makrofager; DCs = dendritiska celler; IM = interstitiell makrofag; SSC-A = toppområde för sidost utspritt ljus; FSC-A = toppområde för framåtspritt ljus; SSC-H = topphöjd för sidost utspritt ljus; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-länkad myeloisk differentieringsmarkör (Ly-6G). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Jämförelse av uttryck av olika markörer i immunceller. (A) Jämförelse av CD24, CD64, MERTK, F4/80 och CD103 uttryck i pulmonella DCs. (B) Jämförelse av CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b och CX3CR1 i pulmonell makrofager och monocyter. Förkortningar: DCs = dendritiska celler; MoDC = monocyt-härledda DCs; AMs = alveolar makrofager; IMs = interstitiella makrofager; SF = Siglec F; MERTK = myeloisk-epitelial-reproduktiv tyrosinkinas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| BSA-buffert | PBS + 0.5% Bovin serumalbumin | ||
| Buffert för matsmältning | Förvarnad (37 °C) BSA-buffert + 5 mg/ml kollagenas typ 1 + 0,2 mg/ml DNase I | ||
| Färgningsbuffert | PBS + 2.5% FBS | ||
| Fix/perm-buffert | Tre delar av fixering/permeabiliseringsdunent och 1 del av fixering/permeabiliseringsdunent av Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ||
| Permeabiliseringsbuffert | 10x permeabiliseringsbuffert från Foxp3/TranskriptionsfaktorfärgningsbuffertEn Utspädd 10 gånger i renat avjoniserat vatten | ||
Tabell 1: Buffertar.
| Antigen | Klon | Fluorokrom | Utspädning | Yta/intracellulär |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | yta |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | yta |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intracellulär |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | yta |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | yta |
| CD11c | N418 | BV650 eller BV510 | 1:100 | yta |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Blända 594 | 1:100 | yta |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | yta |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | yta |
| Live/Dead Fixable Långläst Död Cell Stain Kit | FarRed (APC) eller Aqua (BV510) | 1:1000 | yta | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | yta |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | yta |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | yta |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | yta |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | yta |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | yta |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | yta |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | yta |
Tabell 2: Användning av monoklonala antikroppar.
Kompletterande figur S1: Den bästa cellulära dissociationen uppnås genom 5 mg/ml kollagenas 1 i förvarnad PBS + 0,5% BSA. Under alla olika förhållanden inkluderades också 0, 2 mg DNAse I. Förkortningar: BSA = bovin serumalbumin; FSC-A = toppområde för framåtspritt ljus; L/D = levande/död färgning; SF = Siglec F. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Införande av dubblingar kan leda till falskt positiva populationer. Förkortning: FP = falskt positivt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Mer CD45- än CD45 + har funktioner som överensstämmer med döda celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Ytfärgning för CD68 är inte tillräcklig för att korrekt skilja de enskilda immuncellpopulationerna i lungan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiering av lung immunceller kan vara utmanande på grund av de flera immun celltyper som finns i lungan och deras unika immunophenotypic egenskaper jämfört med deras motsvarigheter som bor i andra vävnader. I flera patologiska förhållanden uppträder celler med distinkta fenotypiska funktioner i lungorna. Till exempel resulterar bleomycin-inducerad lungskada i rekrytering av cirkulerande monocyt-härledda makrofager i alveolar utrymmet, där de kan förbli så länge som ett år och även kvarstå efter bleomycin-inducerad fibros. Till skillnad från vävnads-bosattA AMs, de cirkulerande monocyt-härledda makrofagerna är Siglec FlowCD11b +. Riktad utarmning av monocyt-härledda makrofager resulterar i förbättring av bleomycin-medierad pulmonell fibros16,40. Celler med liknande egenskaper rekryteras till lungorna under influensainfektion och ger långvarigt skydd mot streptokockpneumoni15.
Baserat på CD11c- och MHC II-uttryck har IMs vidare underkategoriserats till IM1, IM2 och IM3. IM1 definieras immunophenotypically som CD11c-MHC II-; IM2 definieras som CD11c-MHC II+; och IM3 definieras som MHC II+CD11c+. det har föreslagits att IM1, IM2 och IM3 representerar de fysiologiska stadierna av monocyte till makrofag övergång, snarare än distinkta makrofager kategorier, med IM3 representerar det monocytiska facket41. Som nämnts ovan är MoDC-positiva för DC-markören CD24 och positiva för pan-makrofagmarkörer, inklusive F4/80, CD64 och MERTK9,10,11,13,33,34. Flera studier identifierar dock CD64+MERKT+-celler som lungmakrofager4,10. Både IM3 och MoDC har definierats som CD64+MERKT+MHCII+CD11C+, vilket tyder på att dessa två populationer sannolikt representerar samma celltyp. I enlighet med denna hypotes identifierar gating-strategin som presenteras här inte en distinkt population som representerar IM3-celler, förutom MoDC.
Kritiska steg i protokollet som beskrivs här inkluderar: 1) avlägsnande av allt intilliggande fett från lungorna innan du förbereder encellsupphängningen, eftersom detta kan snedvrida avläsningarna; 2) permeabilisering före färgning med anti-CD68-antikroppen. En begränsning av det nuvarande protokollet är att det inte kan identifiera icke-immuna celler i lungan, såsom epitelial (CD45-CD326+CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) och fibroblaster. Identifiering av sådana populationer kräver ett annat tillvägagångssätt28,29. Dessutom kräver protokollet färgning för CD68, en intracellulär markör, som kan utgöra en begränsning om prövaren inte har erfarenhet av intracellulär färgning. Betydelsen av detta protokoll och gating strategi med avseende på befintliga metoder är att denna strategi ger en strömlinjeformad strategi som använder ett lägre antal markörer samtidigt som det möjliggör reproducerbar identifiering av alla immunpopulationer i lungan.
Dessutom tillhandahålls en detaljerad metod för beredning av en encellssuspension som minimerar celldöd och gör det möjligt att identifiera en fullständig profil av lungens immuncellsutrymme. Även om protokollet beskrivs här beskriver karakterisering och identifiering av lung immunpopulationer under steady-state villkor, framtida tillämpningar kan inkludera bedömning av dessa populationer i olika sjukdomsmodeller där det kan hjälpa till att identifiera sjukdom-specifika förändringar i lung immun landskapet. Sammanfattningsvis presenterar denna artikel ett enkelt och reproducerbart protokoll för lung encelliga preparat och en 9-färg-baserade flöde cytometri panel för identifiering av 12 olika immun cell populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B. har patent på PD-1-vägen licensierad av Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis och Dako. Författarna förklarar inga andra konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01CA238263 och R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
