Summary
В этом исследовании мы представляем эффективный и воспроизводимый протокол для изоляции иммунных популяций дыхательной системы мышей. Мы также предоставляем метод идентификации всех врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей, с помощью 9-цветной панели проточной цитометрии.
Abstract
Дыхательные пути находятся в непосредственном контакте с внешней средой и требуют точно регулируемой иммунной системы для обеспечения защиты при подавлении нежелательных реакций на антигены окружающей среды. Легкие содержат несколько популяций врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые обеспечивают иммунный надзор, но также опосредуют защитные иммунные реакции. Эти клетки, которые поддерживают здоровую легочную иммунную систему в равновесии, также участвуют в нескольких патологических состояниях, таких как астма, инфекции, аутоиммунные заболевания и рак. Селективная экспрессия поверхностных и внутриклеточных белков обеспечивает уникальные иммунофенотипические свойства иммунным клеткам легкого. Следовательно, проточная цитометрия играет важную роль в идентификации таких клеточных популяций во время стационарных и патологических состояний. В этой статье представлен протокол, который описывает последовательный и воспроизводимый метод идентификации иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей в стационарных условиях. Тем не менее, этот протокол также может быть использован для выявления изменений в этих клеточных популяциях в различных моделях заболеваний, чтобы помочь идентифицировать специфические для заболевания изменения в иммунном ландшафте легких.
Introduction
Мышиные дыхательные пути содержат уникальную иммунную систему, отвечающую за борьбу с патогенами и поддержание иммунного гомеостаза. Легочная иммунная система состоит из клеточных популяций со значительной гетерогенностью по фенотипу, функции, происхождению и расположению. Резидентные альвеолярные макрофаги (АМ), происходящие в основном из моноцитов плода, находятся в альвеолярном просвете1, в то время как интерстициальные макрофаги (ИМ), полученные из костного мозга, находятся в паренхиме легких2. IM могут быть дополнительно подклассифицированы выражением CD206. CD206+ IM заполняют перибронхиальную и периваскулярную область, в то время как CD206-IM расположены в альвеолярном интерстиции3. Недавно было предложено несколько подклассификаций ИМ3,4,5,6. Хотя ИМ менее изучены, чем АМ, последние данные подтверждают их решающую роль в регуляции иммунной системы легких7. Кроме того, CD206 также выражается в альтернативно активированных AMs8.
Легочные дендритные клетки (ДК) являются еще одной гетерогенной группой иммунных клеток легких в отношении их функциональных свойств, местоположения и происхождения. В легких были описаны четыре подкатегории ДК: обычные CD103+ DC (также известные как cDC1), обычные CD11b+ DC (также известные как cDC2), моноцитарные ДК (MoDC) и плазмоцитоидные DC9,10,11,12,13. Первые три подкласса можно определить как основной комплекс гистосовместимости (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Плазмоцитоидные ДК экспрессируют MHC II и являются промежуточными положительными для CD11c, но экспрессируют высокие уровни B220 и PDCA-19,13,16. В наивных мышиных легких CD103 DC и CD11b DC расположены в интерстиции дыхательных путей, тогда как плазмоцитоидные ДК расположены в альвеолярном интерстиции17.
Две основные популяции моноцитов находятся в легких во время устойчивого состояния: классические моноциты и неклассические моноциты. Классические моноциты являются Ly6C+ и имеют решающее значение для первоначальной воспалительной реакции. Напротив, неклассические моноциты являются Ly6C- и широко рассматриваются как противовоспалительные клетки3,16,18. Недавно была описана дополнительная популяция моноцитов CD64 +CD16.2+, которые происходят из Ly6C-моноцитов и дают начало CD206+ IMs3.
Эозинофилы в основном появляются в легких во время гельминтной инфекции или аллергических состояний. Тем не менее, существует небольшое количество эозинофилов в легочной паренхиме во время устойчивого состояния, известных как резидентные эозинофилы. В отличие от резидентных эозинофилов, воспалительные эозинофилы обнаруживаются в интерстиции легких и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ). В мышиных моделях клеща домашней пыли (HDM) воспалительные эозинофилы набираются в легкие после антиген-опосредованной стимуляции. Было высказано предположение, что резидентные эозинофилы могут играть регулирующую роль в аллергии, ингибируя сенсибилизацию Т-хелпера 2 (Th2) к HDM19.
В отличие от остальных легочных миелоидных клеток, нейтрофилы экспрессируют Ly6G, но не CD68, и характеризуются сигнатурой иммунофенотипа CD68-Ly6G+16,20,21. Исследования визуализации показали, что в установившемся состоянии легкое резервирует пул нейтрофилов во внутрисосудистом компартменте и содержит значительное количество внесосудистых нейтрофилов22. Подобно эозинофилам, нейтрофилы не обнаруживаются в БАЛ в установившемся состоянии; однако несколько форм иммунной стимуляции, таких как вызов ЛПС, астма или пневмония, загоняют нейтрофилы в альвеолярный просвет, что приводит к их присутствию в BAL21,22,23.
Значительное количество CD45+ клеток легких представляют собой естественный киллер (NK), Т-клетки и В-клетки и являются отрицательными для большинства миелоидных маркеров24. В легких наивных мышей эти три типа клеток могут быть идентифицированы на основе экспрессии CD11b и MHC II18. Около 25% легочных CD45+ клеток являются В-клетками, тогда как процент NK-клеток выше в легких, чем в других лимфоидных и нелимфоидных тканях24,25,26. Среди легочных Т-клеток значительную долю составляет CD4-CD8- и играет важную роль при респираторных инфекциях26.
Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано несколько стратегий идентификации иммунных клеток легких16,18,20,27. Стратегия гатинга, описанная в настоящем описании, обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием 9 маркеров. Для проверки результатов использовались дополнительные маркеры. Кроме того, предусмотрен подробный способ получения одноклеточной суспензии, которая минимизирует гибель клеток и позволяет идентифицировать наиболее полный профиль иммунно-клеточного компартмента легкого. Следует отметить, что идентификация неиммунных клеток легких, таких как эпителиальные клетки (CD45-CD326+CD31-), эндотелиальные клетки (CD45-CD326-CD31+) и фибробласты, требует иного подхода28,29. Идентификация таких популяций не включена в протокол и метод, описанные здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования и эксперименты, описанные в этом протоколе, были проведены в соответствии с руководящими принципами в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Бет Исраэль Диаконисс. Для разработки этого протокола использовались мыши C57BL/6 любого пола в возрасте от шести до десяти недель.
1. Хирургическое иссечение и подготовка тканей
- Эвтаназить мышь путем внутрибрюшинного введения 1 мл трибромэтанола (приготовленного по стандартному протоколу; Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать асфиксии CO2 в исследованиях легких, поскольку она может вызвать повреждение легких и изменить особенности и свойства иммунных клеток легких. Следует также избегать вывиха шейки матки, так как он может привести к механическому повреждению легкого. - Перенесите мышь в чистую и выделенную область для хирургической операции.
- Стабилизируйте спинную сторону мыши вниз с помощью игл или ленты на четырех конечностях. Используйте 70% этанол для дезинфекции кожи вентральной области.
- Выполните разрез на коже, от шеи до живота. Аккуратно удалите кожу с грудного отдела.
- Осторожно удалите грудину и ребра.
- Промывайте легкие, вводя 10 мл холодного PBS непосредственно в правый желудочек, используя иглу 18-21 G, пока легкие не станут полностью белыми.
- Осторожно удалите тимус и сердце, не касаясь легких.
- Осторожно отделяют легкие от окружающих тканей и переносят их в трубку с холодным буфером BSA (табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует приложить усилия, чтобы удалить весь соседний жир из легких перед дальнейшим приготовлением одноклеточной суспензии, так как это может привести к смещению показаний.
2. Приготовление одноклеточной суспензии
- Переложите легкие в пустую чашку Петри и измельчите их двумя тонкими скальпелями. Переложите все кусочки измельченного легкого в новую коническую трубку объемом 50 мл. Используйте 5 мл буфера пищеварения, чтобы промыть пластину и добавить ее в 50 мл пробирку, содержащую измельченное легкое (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер пищеварения должен быть приготовлен непосредственно перед использованием. Используйте 5 мг/мл коллагеназы28. Сочетание 1 или 5 мг коллагеназы с буфером BSA или безбелковым PBS не улучшило результаты (дополнительный рисунок S1). - Закрепите крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 мин на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин при 37 °C. Остановите реакцию, добавив 10 мл холодного буфера BSA.
- После пищеварения используйте иглу 18 г, чтобы смешать и растворить кусочки легких. Поместите фильтрующий фильтр 70 мкм в верхнюю часть новой конической трубки объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование меньшего микронного фильтра может привести к потере основных миелоидных популяций. - Медленно перенесите переваренную легочную смесь непосредственно на ситечко. Используйте резиновую сторону плунжера шприца объемом 10 мл, чтобы разбить оставшиеся легкие куски на фильтре. Промывайте обработанный материал на фильтре с буфером BSA.
- Центрифугируют одноэлементную суспензию при 350 × г в течение 8 мин при 4 °С.
- Осторожно отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера лизиса ACK. Хорошо перемешать, используя пипетку объемом 1 мл, и инкубировать в течение 90 с при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мл холодного буфера BSA, чтобы остановить реакцию, и центрифугу при 350 × г в течение 7 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в буфер окрашивания для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
- Повторно суспендируют клетки в концентрации 5 × 106 клеток/мл и используют их для окрашивания поверхности (см. раздел 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого поместите клетки в 96-луночную пластину с круглым дном с последующим окрашиванием антителами и промывкой. Если пластинчатая центрифуга недоступна, используйте проточные трубки вместо пластин. С помощью этого протокола ~ 15-20 × 106 клеток на легкое может быть получено от 6-10-недельной мыши C57BL/6 среднего размера.
3. Окрашивание поверхности антителами
- Перенесите 1 × 106 ячеек по 200 мкл на скважину в 96-луночную пластину. Центрифугировать пластину при 350 × г в течение 7 мин при 4 °C. Тем временем готовят раствор Fc-блока путем разбавления антитела анти-16/32 (1:100) в буфере окрашивания (таблица 1).
- Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно приготовленного Fc-блокирующего раствора (Таблица материалов) и инкубируют в течение 15-20 мин при 4 °С или на льду.
- Добавьте 150 мкл окрашивающего буфера и центрифугируйте пластину при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C. Тем временем готовят коктейль поверхностных антител путем разбавления поверхностных антител (1:100; Таблица 2) в буфере окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Антитело анти-16/32 для Fc-блокировки может быть использовано с поверхностными антителами в той же смеси. ii) Если используется краситель для поправимой жизнеспособности, добавьте его в коктейль поверхностных антител в разведении 1:1000. - Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно приготовленного поверхностного коктейля антител и инкубируют в течение 30-40 мин при 4 °С в темноте. Дважды промыть клетки с помощью окрашивающего буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если внутриклеточное окрашивание не требуется, повторно суспендируют клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и приступают непосредственно к сбору данных о проточном цитометре. Альтернативно, ячейки могут быть зафиксированы и сохранены при 4 °C для последующего приобретения. Мы рекомендуем использовать клетки для проточной цитометрии в течение 24 ч.
4. Клеточная фиксация и внутриклеточное окрашивание
- Подготовьте буфер фиксации/пермеабилизации (Fix/Perm Buffer) путем смешивания трех частей концентрата фиксации/пермеабилизации и 1 части разбавителя фиксации/пермеабилизации набора буферов окрашивания FoxP3/транскрипционного фактора (таблица 1).
- Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно подготовленного буфера Fix/Perm на скважину 96-луночной пластины, где клетки были покрыты, как описано в разделе 3, и инкубируют их в течение 20-25 мин при 4 °C в темноте.
- Разбавьте 10-кратный буфер пермеабилизации как 1:10 в очищенной деионизированной воде для приготовления 1x буфера пермеабилизации.
- Вымойте ячейки один раз с помощью 1x буфера пермеабилизации. Тем временем готовят коктейль внутриклеточных антител путем разбавления внутриклеточных антител (1:100) в 1 мл буфера пермеабилизации.
- Повторно суспендируют клетки, используя 50 мкл предварительно подготовленного коктейля поверхностных антител на клетку 96-луночной пластины, и инкубируют в течение 40 мин при 4 °C в темноте.
- Промыть клетки один раз с буфером пермеабилизации и один раз с буфером окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если проточный цитометр с пластинчатым считывателем отсутствует, перенесите клетки в проточные цитометрические трубки. - Приобретите минимум 1,5 × 106 клеток на образец на проточном цитометре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одиночных цветов и неиспорченных контрольных образцов будет достаточно 0,5-1 × 106 ячеек на образец. Рекомендуется титровать отдельные антитела, используемые для достижения оптимального окрашивания и снижения затрат. Данный протокол оптимизирован с использованием Fix/Perm Buffer, подготовленного с использованием набора буферов окрашивания FoxP3. Поскольку CD68 является цитоплазматическим, а не ядерным маркером, могут быть достаточными другие растворы для пермеабилизации, такие как низкая концентрация параформальдегида или наборы цитофикса / цитоперма от различных поставщиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стратегия гейтинга
Первым шагом нашей стратегии гаширования является исключение мусора и дублетов (рисунок 1А). Тщательное исключение дублетов имеет решающее значение для предотвращения ложноположительных популяций (дополнительный рисунок S2). Затем иммунные клетки идентифицируются с использованием CD45+, маркера для кроветворных клеток (рисунок 1B). Живое мертвое пятно может быть добавлено, чтобы исключить мертвые клетки. Однако этот протокол приводит к гибели <5% клеток CD45+ (рисунок 1C), тогда как больше CD45-клеток идентифицируются как мертвые (дополнительный рисунок S3).
Для идентификации моноцитов и нейтрофилов, в отличие от предыдущих исследований, в которых использовались специфические антитела для каждой из этих популяций16,18, мы предпочитаем использовать антитело против GR-1, которое идентифицирует как клетки Ly6C+, так и Ly6G+. Использование антитела против GR-1 вместе с анти-CD68 позволяет разделить иммунные клетки легких на три кластера: CD68-GR-1+, CD68+ (которые могут быть дополнительно идентифицированы как GR-1+ или GR-1-) и CD68-GR-1-/int (рисунок 1D). CD68 является маркером, который преимущественно обнаруживается внутриклеточным путем. Поверхностный CD68 был прощупан, но не мог быть обнаружен без фиксации/пермеабилизации (дополнительный рисунок S4).
Полиморфноядерные клетки (нейтрофилы) были идентифицированы как CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (рисунок 1E). Эти результаты были проверены с использованием GR1 вместе с антителом, специфичным для Ly6G (рисунок 2), уникальным маркером полиморфноядерных нейтрофилов16,18,27. В популяции CD45+CD68-GR-1-/int приблизительно 10-20% составляют MHCII- и CD11blow и представляют собой NK-клетки (рисунок 1F). NK1.1, уникальный маркер для NK-клеток, был использован для подтверждения этого (рисунок 3)25,30. Популяция CD45+CD68-GR1-/intCD11b- состоит из MHCII-Т-клеток и MHCII+ В-клеток (рисунок 1F). Два дополнительных антитела были использованы для проверки Т-клеток и В-клеток - CD3 и B220 соответственно (рисунок 3).
У здоровых мышей в стационарных условиях большинство клеток CD45+, обнаруженных в BAL, являются AM, основными жителями дыхательных путей. Следовательно, BAL был выполнен для оценки маркеров, которые характеризуют AMs20,31. Эти клетки являются CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c +, но, в отличие от других миелоидных клеток, не экспрессируют высокие уровни CD11b (рисунок 4). Такая же комбинация иммунных маркеров также идентифицирует АМ в гомогенатах общих легких (рисунок 1G,H). В дополнение к AM, в затворе CD45 + CD68 + Sigle-F + (рисунок 1G) существует отдельная клеточная популяция, которая положительна для CD11b, но не для CD11c. Эта CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- популяция лейкоцитов представляет собой эозинофилы (рисунок 1G)19,32.
В затворе с CD45+CD68+SiglecF-клетками (рисунок 1G) находится популяция CD11c+MHC+, представляющая легочные ДК (рисунок 1I). Несколько исследователей идентифицируют легочные ДК как CD11c+MHCII+CD24+16,18. Экспрессия CD24 оценивалась для подтверждения идентичности этой популяции (рисунок 5A). Большинство ДК легких представляют собой либо CD103+CD11b-, либо CD103-CD11b+ (рисунок 1J). CD103+CD11b-DC представляют собой CD103+ обычные DC и идентифицируются как CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. Напротив, CD103-CD11b+ DC делятся на обычные DC и MoDC на основе выражения CD64 (рисунок 1K). Таким образом, обычные CD11b+ DC идентифицируются как CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64- в то время как MoDC идентифицируются как CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 + . В отличие от обычных DC, MoDC являются низкоположительными для маркера постоянного тока CD24 и положительными для маркеров пан-макрофагов, включая F4/80, CD64 и MERTK (рисунок 5A)9,10,11,13,33,34.
ИМ и классические и неклассические моноциты находятся в затворе CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ (рисунок 1L) и различаются на основе экспрессии CD64 и GR-1 (рисунок 1M). CD64, маркер пан-макрофагов, в основном экспрессируется IM и AM, а также подмножеством DC. Классические моноциты также известны как моноциты Ly6C+, а неклассические моноциты как Ly6C-моноциты. Как моноциты, так и ИМ отрицательны для Ly6G; однако классические моноциты экспрессируют Ly6C и, следовательно, положительны для GR-1. Напротив, как интерстициальные макрофаги, так и неклассические моноциты отрицательны для GR-1 и Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Кроме того, неклассические моноциты являются CD11cint, в то время как классические моноциты являются CD11c-. Хотя эта разница в экспрессии CD11c, как правило, незначительна для различения двух типов моноцитов на исходном уровне, она может иметь решающее значение для патологических состояний, когда накапливаются классические моноциты. Исходя из вышесказанного, интерстициальные макрофаги определяются как CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, классические моноциты как CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, а неклассические моноциты как CD45+CD68+CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64- . Как АМ, так и ИМ положительны для всех маркеров макрофагов, включая протоонкоген CD68, CD64, F4/80 и MERTK. Однако, в отличие от IM, AM являются CX3CR1-, в отличие от IM, что может быть объяснено разницей в происхождении двух типов макрофагов легких4,37,38,39 (рисунок 5B).
Рисунок 1: Стратегия захвата иммунных клеток, присутствующих в мышином легком. После тщательного исключения мусора, дублетов, мертвых клеток и неиммунных клеток (CD45-) (A-C) клетки CD45+ были разделены на 3 основных кластера на основе экспрессии CD68 и GR-1 (D). Нейтрофилы принадлежат к популяции CD68-GR-1+ (E), в то время как популяция CD68-GR-1-/int состоит из NK-клеток, В-клеток и Т-клеток (F). Клетки CD68+ могут быть дополнительно разделены на клетки Siglec F+ (G), которые являются AMs и эозинофилами (H), и Siglec F-клетки (G), которые состоят из моноцитов, IM и DC (I-M). Сокращения: SSC-A = пиковая площадь бокового рассеянного света; FSC-A = пиковая площадь прямого рассеяния света; SSC-H = пиковая высота бокового рассеянного света; L/D = живое/мертвое окрашивание; MHC = основной комплекс гистосовместимости; SF = Сиглек F; GR-1 = GPI-связанный маркер дифференцировки миелоидов (Ly-6G); NK = природный убийца; IM = интерстициальные макрофаги; DC = дендритные клетки; AMs = альвеолярные макрофаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ly6G в легких экспрессируется только клетками CD45+CD68-GR-1+CD11b+, идентифицированными как полиморфноядерные нейтрофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проверка идентификации NK-клеток, Т-клеток и В-клеток с помощью стратегии гатинга. Маркеры, специфичные для NK 1.1, CD3 и B220, использовались для проверки идентификации NK-клеток, Т-клеток и В-клеток соответственно. Следует отметить, что NKT-клетки, если они присутствуют, могут попасть в популяцию клеток CD3+ в пределах NK-клеточного затвора, и требуется осторожность, чтобы избежать загрязнения NK-клетками NKT. Сокращения: NK = природный убийца; MHC = основной комплекс гистосовместимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Большинство иммунных клеток, полученных бронхоальвеолярным лаважем у наивных мышей, являются альвеолярными макрофагами. Сокращения: АМ = альвеолярные макрофаги; DC = дендритные клетки; IM = интерстициальный макрофаг; SSC-A = пиковая площадь бокового рассеянного света; FSC-A = пиковая площадь прямого рассеяния света; SSC-H = пиковая высота бокового рассеянного света; SF = Сиглек F; GR-1 = GPI-связанный маркер дифференцировки миелоидов (Ly-6G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение экспрессии различных маркеров в иммунных клетках. (A) Сравнение экспрессии CD24, CD64, MERTK, F4/80 и CD103 в легочных ДК. (B) Сравнение CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b и CX3CR1 в легочных макрофагах и моноцитах. Сокращения: DC = дендритные клетки; MoDC = ДК, полученные из моноцитов; AMs = альвеолярные макрофаги; IM = интерстициальные макрофаги; SF = Сиглек F; МЕРТК = миелоидно-эпителиально-репродуктивная тирозинкиназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Буфер BSA | PBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина | ||
| Буфер пищеварения | Предварительно расплавленный (37 °C) буфер BSA + 5 мг/мл коллагеназы типа 1 + 0,2 мг/мл ДНКазы I | ||
| Буфер окрашивания | PBS + 2.5% FBS | ||
| Фикс/Пермский буфер | Три части разбавителя фиксации/пермеабилизации и 1 часть разбавителя фиксации/пермеабилизации буферного набора Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ||
| Буфер пермеабилизации | 10-кратный буфер пермеабилизации из буфера окрашивания Foxp3/Transcription Factor, разбавленный в 10 раз в очищенной деионизированной воде | ||
Таблица 1: Буферов.
| Антиген | Клон | Фторхром | Разбавление | Поверхностный/внутриклеточный |
| СД45 | 30-Ф11 | БТР/CY7 | 1:100 | поверхность |
| Гр-1 | РБ6-8С5 | БВ421 | 1:100 | поверхность |
| СД68 | ФА-11 | ПерПЦСи5.5 | 1:100 | внутриклеточный |
| СД11б | М1/70 | PECy7 | 1:100 | поверхность |
| Сиглек Ф | С17007Л | ФИТК | 1:100 | поверхность |
| CD11c | Н418 | BV650 или BV510 | 1:100 | поверхность |
| СД64 | Х54-5/7.1 | ПЭ/Ослепление 594 | 1:100 | поверхность |
| МХК-II | М5/114.15.2 | АФ700 | 1:100 | поверхность |
| СД103 | 2.00Е+07 | PE / FITC | 1:100 | поверхность |
| Живой / мертвый поправимый набор для пятен для мертвых клеток | ФарРед (БТР) или Аква (BV510) | 1:1000 | поверхность | |
| СД3 | 17А2 | ЧП | 1:100 | поверхность |
| В220 | РА3-6Б2 | АФ488 | 1:100 | поверхность |
| НК1.1 | ПК136 | ФИТК | 1:100 | поверхность |
| СД24 | 30-Ф1 | ЧП | 1:100 | поверхность |
| МЕРТК | 2Б10С42 | ЧП | 1:100 | поверхность |
| Ф4/80 | БМ8 | БВ605 | 1:100 | поверхность |
| CX3CR1 | СА011Ф11 | ЧП | 1:100 | поверхность |
| ФкБлок (CD16/32) | 93 | 1:100 | поверхность |
Таблица 2: Применение моноклональных антител.
Дополнительный рисунок S1: Наилучшая клеточная диссоциация достигается 5 мг/мл коллагеназы 1 в предварительном PBS + 0,5% BSA. Во всех различных условиях также было включено 0,2 мг DNAse I. Сокращения: BSA = бычий сывороточный альбумин; FSC-A = пиковая площадь прямого рассеяния света; L/D = живое/мертвое окрашивание; SF = Siglec F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Включение дублетов может привести к ложноположительным популяциям. Аббревиатура: FP = ложное срабатывание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Больше CD45- , чем CD45+, имеют функции, совместимые с мертвыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Поверхностное окрашивание для CD68 недостаточно для правильного различения отдельных популяций иммунных клеток легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Идентификация легочных иммунных клеток может быть сложной задачей из-за нескольких типов иммунных клеток, находящихся в легких, и их уникальных иммунофенотипических характеристик по сравнению с их аналогами, находящимися в других тканях. При некоторых патологических состояниях клетки с отчетливыми фенотипическими особенностями появляются в легких. Например, повреждение легких, вызванное блеомицином, приводит к набору циркулирующих макрофагов, полученных из моноцитов, в альвеолярном пространстве, где они могут оставаться в течение одного года и даже сохраняться после блеомицин-индуцированного фиброза. В отличие от ткане-резидентных АМ, циркулирующими макрофагами, полученными из моноцитов, являются Siglec FlowCD11b+. Целенаправленное истощение моноцитарных макрофагов приводит к улучшению блеомицин-опосредованного легочного фиброза16,40. Клетки со схожими признаками зачисляются в легкие при гриппозной инфекции и обеспечивают длительную защиту от стрептококковой пневмонии15.
Основываясь на выражениях CD11c и MHC II, мгновенные сообщения были дополнительно подразделены на IM1, IM2 и IM3. IM1 иммунофенотипически определяются как CD11c-MHC II-; IM2 определяются как CD11c-MHC II+; и IM3 определяются как MHC II+CD11c+. Было высказано предположение, что IM1, IM2 и IM3 представляют физиологические стадии перехода моноцитов в макрофаги, а не отдельные категории макрофагов, причем IM3 представляет моноцитарный компартмент41. Как упоминалось выше, MoDC являются низкоположительными для маркера постоянного тока CD24 и положительными для маркеров пан-макрофагов, включая F4/80, CD64 и MERTK9,10,11,13,33,34. Тем не менее, несколько исследований идентифицируют cd64 + MERKT + клетки как легочные макрофаги4,10. Как IM3, так и MoDC были определены как CD64 + MERKT + MHCII + CD11C +, предполагая, что эти две популяции, скорее всего, представляют один и тот же тип клеток. В соответствии с этой гипотезой, стратегия измерения, представленная здесь, не идентифицирует отдельную популяцию, представляющую клетки IM3, в дополнение к MoDC.
Критические этапы протокола, описанные здесь, включают: 1) удаление всего соседнего жира из легких перед приготовлением одноклеточной суспензии, так как это может привести к смещению показаний; 2) пермеабилизация перед окрашиванием антителом анти-CD68. Ограничением настоящего протокола является то, что он не может идентифицировать неиммунные клетки легких, такие как эпителиальные (CD45-CD326 + CD31-), эндотелиальные клетки (CD45-CD326-CD31 +) и фибробласты. Идентификация таких групп населения требует иного подхода28,29. Кроме того, протокол требует окрашивания для CD68, внутриклеточного маркера, который может представлять ограничение, если исследователь не испытывает опыта внутриклеточного окрашивания. Значение настоящего протокола и стратегии гатинга по отношению к существующим методам заключается в том, что эта стратегия обеспечивает упрощенный подход, который использует меньшее количество маркеров, обеспечивая при этом воспроизводимую идентификацию всех иммунных популяций легких.
Кроме того, предусмотрен подробный способ приготовления одноклеточной суспензии, которая минимизирует гибель клеток и позволяет идентифицировать полный профиль иммунного клеточного компартмента легкого. Хотя протокол, изложенный здесь, описывает характеристику и идентификацию иммунных популяций легких в стационарных условиях, будущие приложения могут включать оценку этих популяций в различных моделях заболеваний, где это может помочь выявить специфические для заболевания изменения в иммунном ландшафте легких. В заключение, в этой статье представлен простой и воспроизводимый протокол для одноклеточной подготовки легких и 9-цветная панель проточной цитометрии для идентификации 12 различных популяций иммунных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B. имеет патенты на путь PD-1, лицензированные Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis и Dako. Авторы не заявляют о каких-либо других конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH R01CA238263 и R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
