Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo efficace e riproducibile per isolare le popolazioni immunitarie del sistema respiratorio murino. Forniamo anche un metodo per l'identificazione di tutte le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni di topi sani, utilizzando un pannello di citometria a flusso a 9 colori.
Abstract
Il tratto respiratorio è in contatto diretto con l'ambiente esterno e richiede un sistema immunitario regolato con precisione per fornire protezione sopprimendo le reazioni indesiderate agli antigeni ambientali. I polmoni ospitano diverse popolazioni di cellule immunitarie innate e adattative che forniscono sorveglianza immunitaria ma mediano anche le risposte immunitarie protettive. Queste cellule, che mantengono in equilibrio il sistema immunitario polmonare sano, partecipano anche a diverse condizioni patologiche come asma, infezioni, malattie autoimmuni e cancro. L'espressione selettiva delle proteine di superficie e intracellulari fornisce proprietà immunofenotipiche uniche alle cellule immunitarie del polmone. Di conseguenza, la citometria a flusso ha un ruolo strumentale nell'identificazione di tali popolazioni cellulari durante lo stato stazionario e le condizioni patologiche. Questo documento presenta un protocollo che descrive un metodo coerente e riproducibile per identificare le cellule immunitarie che risiedono nei polmoni di topi sani in condizioni di stato stazionario. Tuttavia, questo protocollo può anche essere utilizzato per identificare i cambiamenti in queste popolazioni cellulari in vari modelli di malattia per aiutare a identificare i cambiamenti specifici della malattia nel panorama immunitario polmonare.
Introduction
Il tratto respiratorio murino contiene un sistema immunitario unico responsabile della lotta contro gli agenti patogeni e del mantenimento dell'omeostasi immunitaria. Il sistema immunitario polmonare è costituito da popolazioni cellulari con significativa eterogeneità nel loro fenotipo, funzione, origine e posizione. I macrofagi alveolari residenti (AM), originati principalmente da monociti fetali, risiedono nel lume alveolare1, mentre i macrofagi interstiziali derivati dal midollo osseo (IM) risiedono nel parenchima polmonare2. I MESSAGGI possono essere ulteriormente sottoclassificati dall'espressione di CD206. I DM CD206+ popolano l'area peribronchiale e perivascolare, mentre i DM CD206- si trovano all'interstizio alveolare3. Recentemente sono state proposte alcune sottoclassificazioni di IM3,4,5,6. Sebbene gli IM siano meno studiati degli AM, prove recenti supportano il loro ruolo cruciale nella regolazione del sistema immunitario del polmone7. Inoltre, CD206 è espresso anche in AM8 attivati alternativamente.
Le cellule dendritiche polmonari (DC) sono un altro gruppo eterogeneo di cellule immunitarie polmonari per quanto riguarda le loro proprietà funzionali, posizione e origine. Quattro sottocategorie di DC sono state descritte nel polmone: DC CD103+ convenzionali (note anche come cDC1), DC CD11b+ convenzionali (note anche come cDC2), DC derivate da monociti (MoDC) e DC plasmacitoidi9,10,11,12,13. Le prime tre sottoclassi possono essere definite come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. I DC plasmacitoidi esprimono MHC II e sono intermediamente positivi per CD11c ma esprimono alti livelli di B220 e PDCA-19,13,16. Nei polmoni murini naïve, le DC CD103 e le DC CD11b si trovano nell'interstizio delle vie aeree, mentre le DC plasmacitoidi si trovano nell'interstizio alveolare17.
Due principali popolazioni di monociti risiedono nel polmone durante lo stato stazionario: monociti classici e monociti non classici. I monociti classici sono Ly6C+ e sono fondamentali per la risposta infiammatoria iniziale. Al contrario, i monociti non classici sono Ly6C- e sono stati ampiamente visti come cellule antinfiammatorie3,16,18. Recentemente, è stata descritta un'ulteriore popolazione di monociti CD64+CD16.2+, che provengono da monociti Ly6C- e danno origine a CD206+ IM3.
Gli eosinofili compaiono principalmente nei polmoni durante l'infezione da elminti o condizioni allergiche. Tuttavia, c'è un piccolo numero di eosinofili nel parenchima polmonare durante lo stato stazionario, noto come eosinofili residenti. In contrasto con gli eosinofili residenti, gli eosinofili infiammatori si trovano nell'interstizio polmonare e nel lavaggio broncoalveolare (BAL). Nei modelli murini di acaro della polvere domestica (HDM), gli eosinofili infiammatori vengono reclutati nel polmone dopo la stimolazione mediata dall'antigene. È stato proposto che gli eosinofili residenti potrebbero avere un ruolo regolatore nell'allergia inibendo la sensibilizzazione T helper 2 (Th2) a HDM19.
A differenza del resto delle cellule mieloidi polmonari, i neutrofili esprimono Ly6G ma non CD68 e sono caratterizzati da una firma dell'immunofenotipo CD68-Ly6G+16,20,21. Studi di visualizzazione hanno dimostrato che durante lo stato stazionario, il polmone riserva un pool di neutrofili nel compartimento intravascolare e ospita un numero considerevole di neutrofili extravascolari22. Simile agli eosinofili, i neutrofili non si trovano in BAL allo stato stazionario; tuttavia, diverse forme di stimolazione immunitaria, come la sfida LPS, l'asma o la polmonite, spingono i neutrofili nel lume alveolare, con conseguente presenza in BAL21,22,23.
Un numero considerevole di cellule CD45+ del polmone rappresentano cellule natural killer (NK), T e B e sono negative per la maggior parte dei marcatori mieloidi24. Nei polmoni di topi naïve, questi tre tipi di cellule possono essere identificati in base all'espressione di CD11b e MHC II18. Circa il 25% delle cellule CD45+ polmonari sono cellule B, mentre la percentuale di cellule NK è più alta nel polmone rispetto ad altri tessuti linfoidi e non linfoidi24,25,26. Tra le cellule T polmonari, una frazione considerevole è CD4-CD8- e svolge un ruolo importante nelle infezioni respiratorie26.
Poiché il polmone ospita un sistema immunitario molto complesso e unico, sono state sviluppate e riportate diverse strategie di gating per l'identificazione delle cellule immunitarie polmonari16,18,20,27. La strategia di gating qui descritta fornisce un modo completo e riproducibile per identificare fino a 12 diverse popolazioni immunitarie mieloidi polmonari e non mieloidi utilizzando 9 marcatori. Ulteriori marcatori sono stati utilizzati per convalidare i risultati. Inoltre, viene fornito un metodo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare che minimizza la morte cellulare e consente l'identificazione del profilo più completo del compartimento cellulare immunitario del polmone. Va notato che l'identificazione delle cellule non immunitarie del polmone, come le cellule epiteliali (CD45-CD326+CD31-), le cellule endoteliali (CD45-CD326-CD31+) e i fibroblasti richiede un approccio diverso28,29. L'identificazione di tali popolazioni non è inclusa nel protocollo e nel metodo qui descritti.
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Protocol
Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati condotti secondo le linee guida secondo l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center. Sei a dieci settimane di topi C57BL / 6 di entrambi i sessi sono stati utilizzati per sviluppare questo protocollo.
1. Escissione chirurgica e preparazione dei tessuti
- Eutanasia del topo iniettando per via intraperitoneale 1 mL di tribromoetanolo (preparato secondo il protocollo standard; Tabella dei materiali).
NOTA: L'asfissia da CO2 deve essere evitata negli studi polmonari in quanto potrebbe causare lesioni polmonari e alterare le caratteristiche e le proprietà delle cellule immunitarie polmonari. Anche la lussazione cervicale dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe causare lesioni meccaniche del polmone. - Trasferire il mouse in un'area pulita e dedicata per l'operazione chirurgica.
- Stabilizzare il lato dorsale del topo verso il basso usando aghi o nastro adesivo sulle quattro estremità. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare la pelle dell'area ventrale.
- Eseguire un'incisione nella pelle, dal collo all'addome. Rimuovere con cura la pelle dalla zona toracica.
- Rimuovere con attenzione lo sterno e le costole.
- Lavare i polmoni iniettando 10 ml di PBS freddo direttamente nel ventricolo destro, usando un ago da 18-21 G, fino a quando i polmoni diventano completamente bianchi.
- Rimuovere con cura il timo e il cuore senza toccare i polmoni.
- Staccare delicatamente i polmoni dai tessuti circostanti e trasferirli in un tubo con tampone BSA freddo (Tabella 1).
NOTA: Si dovrebbe fare uno sforzo per rimuovere tutto il grasso adiacente dai polmoni prima di preparare ulteriormente la sospensione unicellulare, in quanto ciò potrebbe influenzare le letture.
2. Preparazione della sospensione monocellulare
- Trasferire i polmoni in una capsula di Petri vuota e tritarli con due bisturi fini. Trasferire tutti i pezzi del polmone tritato in un nuovo tubo conico da 50 ml. Utilizzare 5 mL di tampone digestivo per lavare la piastra e aggiungerla al tubo da 50 mL contenente il polmone tritato (Tabella 1).
NOTA: il tampone di digestione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso. Utilizzare 5 mg/mL di collagenasi28. La combinazione di 1 o 5 mg di collagenasi con tampone BSA o PBS privo di proteine non ha migliorato i risultati (Figura supplementare S1). - Fissare il coperchio del tubo e digerire il polmone per 30 minuti su uno shaker orbitale ad una velocità di 150 giri/min a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml di tampone BSA freddo.
- Dopo la digestione, utilizzare un ago da 18 G per mescolare e sciogliere i pezzi polmonari. Posizionare un filtro da 70 μm nella parte superiore di un nuovo tubo conico da 50 ml.
NOTA: l'uso di un filtro micron più piccolo potrebbe comportare la perdita delle principali popolazioni mieloidi. - Trasferire lentamente la miscela polmonare digerita direttamente sul colino. Utilizzare il lato in gomma di uno stantuffo a siringa da 10 mL per distruggere i restanti pezzi polmonari sul filtro. Lavare il materiale lavorato sul filtro con tampone BSA.
- Centrifugare la sospensione monocellulare a 350 × g per 8 min a 4 °C.
- Scartare con attenzione il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene usando un pipetto da 1 mL e incubare per 90 s a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 ml di tampone BSA freddo per fermare la reazione e centrifugare a 350 × g per 7 minuti a 4 °C.Scartare con cautela il surnatante e risospesciare il pellet in Staining Buffer per contare le cellule usando un emocitometro.
- Risospese le cellule ad una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL e utilizzarle per la colorazione superficiale (vedere paragrafo 3).
NOTA: A tale scopo, placcare le cellule in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti seguita da colorazione anticorpale e lavaggi. Se non è disponibile una centrifuga a piastre, utilizzare tubi di flusso anziché piastre. Con questo protocollo, ~ 15-20 × 106 cellule per polmone possono essere ottenute da un topo C57BL / 6 di 6-10 settimane di dimensioni medie.
3. Colorazione degli anticorpi superficiali
- Trasferire 1 × 106 celle in 200 μL per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 350 × g per 7 min a 4 °C. Nel frattempo, preparare la soluzione fc-block diluendo l'anticorpo anti-16/32 (1:100) nel tampone di colorazione (Tabella 1).
- Risospescere le cellule in 50 μL della soluzione pre-preparata di Blocco Fc (Tabella dei Materiali) e incubare per 15-20 min a 4 °C o su ghiaccio.
- Aggiungere 150 μL di tampone colorante e centrifugare la piastra a 350 × g per 5 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi di superficie diluendo gli anticorpi di superficie (1:100; Tabella 2) nel tampone di colorazione.
NOTA: (i) L'anticorpo anti-16/32 per il blocco della Fc può essere utilizzato con gli anticorpi di superficie nella stessa miscela. (ii) Se si utilizza un colorante di vitalità fissabile, aggiungerlo al cocktail di anticorpi superficiali ad una diluizione di 1:1.000. - Risospesere le cellule in 50 μL del cocktail anticorpale di superficie pre-preparato e incubare per 30-40 minuti a 4 °C al buio. Lavare le cellule con tampone colorante due volte.
NOTA: Se non è richiesta alcuna colorazione intracellulare, risospesare le cellule in 200 μL di tampone colorante e procedere direttamente all'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. In alternativa, le celle potrebbero essere fissate e conservate a 4 °C per l'acquisizione successiva. Si consiglia di utilizzare le cellule per la citometria a flusso entro 24 ore.
4. Fissazione cellulare e colorazione intracellulare
- Preparare il tampone di fissazione/permeabilizzazione (Fix/Perm Buffer) mescolando tre parti di concentrato di fissazione/permeabilizzazione e 1 parte di diluente di fissazione/permeabilizzazione del set di buffer di colorazione FoxP3/Transcription Factor (Tabella 1).
- Risospesare le cellule in 50 μL del Fix/Perm Buffer pre-preparato per pozzetto della piastra a 96 pozzetti, dove le cellule sono state placcate come descritto nella sezione 3, e incubarle per 20-25 min a 4 °C al buio.
- Diluire il tampone di permeabilizzazione 10x come 1: 10 in acqua deionizzata purificata per preparare 1x tampone di permeabilizzazione.
- Lavare le cellule una volta con 1x tampone di permeabilizzazione. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi intracellulari diluendo gli anticorpi intracellulari (1:100) in 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
- Risospese le cellule utilizzando 50 μL del cocktail di anticorpi di superficie pre-preparato per cellula della piastra a 96 pozzetti e incubare per 40 minuti a 4 °C al buio.
- Lavare le cellule una volta con tampone di permeabilizzazione e una volta con tampone di colorazione. Dopo il lavaggio finale, risospesere le cellule in 200 μL di tampone colorante.
NOTA: Se non è disponibile alcun citometro a flusso con lettore di piastre, trasferire le cellule in provette citometriche a flusso. - Acquisire un minimo di 1,5 × 106 cellule per campione sul citometro a flusso.
NOTA: per i campioni di controllo a colori singoli e non macchiati, saranno sufficienti 0,5-1 × 106 celle per campione. Si raccomanda di titolare i singoli anticorpi utilizzati per ottenere una colorazione ottimale e ridurre i costi. Il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando Fix/Perm Buffer preparato utilizzando il set di buffer di colorazione FoxP3. Poiché CD68 è un marcatore citoplasmatico e non nucleare, potrebbero essere sufficienti altre soluzioni di permeabilizzazione come una bassa concentrazione di paraformaldeide o kit di citofisso / citoperma di vari fornitori.
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Representative Results
Strategia di Gating
Il primo passo della nostra strategia di gating è l'esclusione dei detriti e dei doppietti (Figura 1A). Un'attenta esclusione dei doppietti è fondamentale per evitare popolazioni di falsi positivi (Figura supplementare S2). Quindi, le cellule immunitarie vengono identificate utilizzando CD45+, un marcatore per le cellule ematopoietiche (Figura 1B). La macchia morta può essere aggiunta per escludere le cellule morte. Tuttavia, questo protocollo provoca la morte di <5% delle cellule CD45+ (Figura 1C), mentre più cellule CD45- sono identificate come morte (Figura supplementare S3).
Per identificare monociti e neutrofili, a differenza di studi precedenti che utilizzavano anticorpi specifici per ciascuna di queste popolazioni16,18, preferiamo utilizzare un anticorpo anti-GR-1 che identifica sia le cellule Ly6C+ che Ly6G+. L'uso dell'anticorpo anti-GR-1 insieme all'anti-CD68 consente la separazione delle cellule immunitarie polmonari in tre cluster: CD68-GR-1+, CD68+(che può essere ulteriormente identificato come GR-1+ o GR-1-), e CD68-GR-1-/int (Figura 1D). CD68 è un marcatore che viene rilevato prevalentemente intracellulare. Surface CD68 è stato sondato ma non è stato possibile rilevarlo senza fissazione/permeabilizzazione (Figura supplementare S4).
Le cellule polimorfonucleate (neutrofili) sono state identificate come CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (Figura 1E). Questi risultati sono stati verificati utilizzando GR1 insieme a un anticorpo specifico per Ly6G (Figura 2), un marcatore unico per i neutrofili polimorfonucleati16,18,27. All'interno della popolazione CD45+CD68-GR-1-/int, circa il 10-20% sono MHCII- e CD11blow e rappresentano le cellule NK (Figura 1F). NK1.1, un marcatore unico per le cellule NK, è stato utilizzato per confermarlo (Figura 3)25,30. La popolazione CD45+CD68-GR1-/intCD11b- è costituita da cellule MHCII-T e cellule MHCII+ B (Figura 1F). Due anticorpi aggiuntivi sono stati utilizzati per verificare le cellule T e le cellule B, rispettivamente CD3 e B220 (Figura 3).
Nei topi sani in condizioni di stato stazionario, la maggior parte delle cellule CD45+ rilevate in BAL sono AM, i principali residenti delle vie aeree. Quindi, BAL è stato eseguito per valutare i marcatori che caratterizzano AMs20,31. Queste cellule sono CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+ ma, a differenza di altre cellule mieloidi, non esprimono alti livelli di CD11b (Figura 4). La stessa combinazione di marcatori immunitari identifica anche gli AM negli omogeneizzati dei polmoni totali (Figura 1G,H). Oltre agli AM, nel gate CD45+CD68+Sigle-F+ (Figura 1G), esiste una popolazione cellulare distinta che è positiva per CD11b ma non per CD11c. Questa popolazione CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- di leucociti rappresenta gli eosinofili (Figura 1G)19,32.
Nel gate con le cellule CD45+CD68+SiglecF- (Figura 1G), c'è una popolazione CD11c+MHC+ che rappresenta le DC polmonari (Figura 1I). Diversi ricercatori identificano le DC polmonari come CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. L'espressione di CD24 è stata valutata per confermare l'identità di questa popolazione (Figura 5A). La maggior parte delle DC polmonari sono CD103+CD11b- o CD103-CD11b+ (Figura 1J). I DC CD103+CD11b- rappresentano i DC convenzionali CD103+ e sono identificati come CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. Al contrario, i DC CD103-CD11b+ sono suddivisi in DC convenzionali e MoDC basati sull'espressione CD64 (Figura 1K). Pertanto, i DC CD11b+ convenzionali sono identificati come CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64- mentre i MoDC sono identificati come CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . A differenza dei DC convenzionali, i MoDC sono poco positivi per il marcatore DC CD24 e positivi per i marcatori pan-macrofagi, tra cui F4/80, CD64 e MERTK (Figura 5A)9,10,11,13,33,34.
IMS e i monociti classici e non classici si trovano nel gate CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ (Figura 1L) e si distinguono in base all'espressione CD64 e GR-1 (Figura 1M). CD64, un marcatore pan-macrofagico, è espresso principalmente da IM e AM, nonché da un sottoinsieme di DC. I monociti classici sono anche noti come monociti Ly6C + e monociti non classici come monociti Ly6C-. Sia i monociti che i MESSAGGI sono negativi per Ly6G; tuttavia, i monociti classici esprimono Ly6C e sono quindi positivi per GR-1. Al contrario, sia i macrofagi interstiziali che i monociti non classici sono negativi per GR-1 e Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Inoltre, i monociti non classici sono CD11cint, mentre i monociti classici sono CD11c-. Sebbene questa differenza nell'espressione di CD11c sia generalmente insignificante per distinguere i due tipi di monociti al basale, potrebbe essere fondamentale per le condizioni patologiche quando i monociti classici si accumulano. Sulla base di quanto sopra, i macrofagi interstiziali sono definiti come CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/ intCD11b + GR-1-CD64 +, i monociti classici come CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64- e i monociti non classici come CD45 + CD68 + CD11c - / intCD11b + GR-1-CD64- . Sia gli AM che gli IM sono positivi per tutti i marcatori macrofagici, inclusi CD68, CD64, F4/80 e meRTK proto-oncogene. Tuttavia, a differenza degli IM, gli AM sono CX3CR1-, a differenza degli IM, che potrebbero essere spiegati dalla differenza nell'origine dei due tipi di macrofagi polmonari4,37,38,39 (Figura 5B).
Figura 1: Strategia di Gating delle cellule immunitarie presenti nel polmone murino. Dopo un'attenta esclusione di detriti, doppietti, cellule morte e cellule non immunitarie (CD45-) (A-C), le cellule CD45+ sono state separate in 3 cluster principali in base all'espressione di CD68 e GR-1 (D). I neutrofili appartengono alla popolazione CD68-GR-1+ (E) mentre la popolazione CD68-GR-1-/int è costituita da cellule NK, cellule B e cellule T (F). Le cellule CD68+ possono essere ulteriormente suddivise in cellule Siglec F+ (G), che sono AM ed eosinofili (H), e cellule Siglec F- (G), che consistono in monociti, IM e DC (I-M). Abbreviazioni: SSC-A = area di picco della luce diffusa lateralmente; FSC-A = area di picco della luce diffusa in avanti; SSC-H = altezza di picco della luce diffusa lateralmente; L/D = colorazione viva/morta; MHC = complesso maggiore di istocompatibilità; SF = Siglec F; GR-1 = marcatore di differenziazione mieloide legato al GPI (Ly-6G); NK = natural killer; IM = macrofagi interstiziali; DC = cellule dendritiche; AM = macrofagi alveolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il Ly6G nel polmone è espresso solo da cellule CD45+CD68-GR-1+CD11b+ identificate come neutrofili polimorfonucleati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Verifica dell'identificazione di cellule NK, cellule T e cellule B mediante la strategia di gating. I marcatori specifici per NK 1.1, CD3 e B220 sono stati utilizzati per verificare l'identificazione delle cellule NK, delle cellule T e delle cellule B, rispettivamente. Va notato che le cellule NKT, se presenti, potrebbero cadere nella popolazione cellulare CD3 + all'interno del gate cellulare NK e si richiede cautela per evitare la contaminazione di NK con cellule NKT. Abbreviazioni: NK = natural killer; MHC = complesso maggiore di istocompatibilità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La maggior parte delle cellule immunitarie ottenute dal lavaggio broncoalveolare in topi naïve sono macrofagi alveolari. Abbreviazioni: AM = macrofagi alveolari; DC = cellule dendritiche; IM = macrofago interstiziale; SSC-A = area di picco della luce diffusa lateralmente; FSC-A = area di picco della luce diffusa in avanti; SSC-H = altezza di picco della luce diffusa lateralmente; SF = Siglec F; GR-1 = marcatore di differenziazione mieloide legato al GPI (Ly-6G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Confronto dell'espressione di diversi marcatori nelle cellule immunitarie. (A) Confronto dell'espressione di CD24, CD64, MERTK, F4/80 e CD103 nelle DC polmonari. (B) Confronto di CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b e CX3CR1 in macrofagi e monociti polmonari. Abbreviazioni: DC = cellule dendritiche; MoDCs = DC derivate da monociti; AM = macrofagi alveolari; IM = macrofagi interstiziali; SF = Siglec F; MERTK = mieloide-epiteliale-riproduttiva tirosina chinasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer BSA | PBS + 0,5% albumina sierica bovina | ||
| Tampone di digestione | Tampone BSA preribalizzato (37 °C) + 5 mg/mL collagenasi tipo 1 + 0,2 mg/mL DNasi I | ||
| Tampone di colorazione | PBS + 2,5% FBS | ||
| Buffer Fix/Permanente | Tre parti di diluente di fissazione/permeabilizzazione e 1 parte di diluente di fissazione/permeabilizzazione del set di buffer di colorazione Foxp3/Transcription Factor | ||
| Tampone di permeabilizzazione | Tampone di permeabilizzazione 10x dal set tampone di colorazione Foxp3/Transcription Factor diluito 10 volte in acqua deionizzata purificata | ||
Tabella 1: Buffer.
| Antigene | Clone | Fluorocromo | Diluizione | Superficie/intracellulare |
| CD45 · | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Superficie |
| Gr-1 · | RB6-8C5 · | BV421 · | 1:100 | Superficie |
| CD68 · | FA-11 · | PerCPCy5,5 | 1:100 | intracellulare |
| CD11b · | M1/70 · | PECy7 · | 1:100 | Superficie |
| Siglec F | S17007L · | FITC · | 1:100 | Superficie |
| CD11c · | N418 · | BV650 o BV510 | 1:100 | Superficie |
| CD64 · | X54-5/7,1 | PE/Abbagliante 594 | 1:100 | Superficie |
| MHC-II · | M5/114.15.2 | AF700 · | 1:100 | Superficie |
| CD103 · | 2,00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Superficie |
| Live/Dead Fixable Far Read Kit di macchie di cellule morte | FarRed (APC) o Aqua (BV510) | 1:1000 | Superficie | |
| CD3 · | 17A2 | PE | 1:100 | Superficie |
| B220 · | RA3-6B2 · | AF488 · | 1:100 | Superficie |
| NK1,1 | PK136 · | FITC · | 1:100 | Superficie |
| CD24 · | 30-F1 | PE | 1:100 | Superficie |
| MERTK · | 2B10C42 · | PE | 1:100 | Superficie |
| F4/80 · | BM8 · | BV605 · | 1:100 | Superficie |
| CX3CR1 · | SA011F11 | PE | 1:100 | Superficie |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Superficie |
Tabella 2: Uso di anticorpi monoclonali.
Figura supplementare S1: La migliore dissociazione cellulare si ottiene da 5 mg / mL di collagenasi 1 in PBS preriscaldato + 0,5% BSA. In tutte le diverse condizioni, sono stati inclusi anche 0,2 mg di DNAse I. Abbreviazioni: BSA = albumina sierica bovina; FSC-A = area di picco della luce diffusa in avanti; L/D = colorazione viva/morta; SF = Siglec F. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: L'inclusione di doppietti potrebbe causare popolazioni false positive. Abbreviazione: FP = falso positivo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Più CD45- che CD45+ hanno caratteristiche coerenti con le cellule morte. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: La colorazione superficiale per CD68 non è adeguata per distinguere correttamente le singole popolazioni di cellule immunitarie del polmone. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'identificazione delle cellule immunitarie polmonari può essere difficile a causa dei molteplici tipi di cellule immunitarie che risiedono nel polmone e delle loro caratteristiche immunofenotipiche uniche rispetto alle loro controparti che risiedono in altri tessuti. In diverse condizioni patologiche, le cellule con caratteristiche fenotipiche distinte appaiono nei polmoni. Ad esempio, la lesione polmonare indotta dalla bleomicina provoca il reclutamento di macrofagi derivati da monociti circolanti nello spazio alveolare, dove possono rimanere fino a un anno e persino persistere dopo la fibrosi indotta dalla bleomicina. A differenza degli AM residenti nei tessuti, i macrofagi derivati dai monociti circolanti sono Siglec FlowCD11b+. L'esaurimento mirato dei macrofagi derivati dai monociti provoca il miglioramento della fibrosi polmonare mediata da bleomicina16,40. Cellule con caratteristiche simili vengono reclutate nei polmoni durante l'infezione influenzale e forniscono una protezione prolungata contro la polmonite da streptococco15.
Sulla base dell'espressione CD11c e MHC II, i messaggi istantanei sono stati ulteriormente sottocategorizzati in IM1, IM2 e IM3. GLI IM1 sono immunofenotipicamente definiti come CD11c-MHC II-; GLI IM2 sono definiti come CD11c-MHC II+; e IM3 sono definiti come MHC II+CD11c+. È stato proposto che IM1, IM2 e IM3 rappresentino gli stadi fisiologici della transizione da monocita a macrofago, piuttosto che categorie distinte di macrofagi, con IM3 che rappresenta il compartimento monocitico41. Come accennato in precedenza, i MoDC sono poco positivi per il marcatore DC CD24 e positivi per i marcatori pan-macrofagi, inclusi F4/80, CD64 e MERTK9,10,11,13,33,34. Tuttavia, diversi studi identificano le cellule CD64+MERKT+ come macrofagi polmonari4,10. Sia IM3 che MoDC sono stati definiti come CD64+ MERKT + MHCII + CD11C +, suggerendo che queste due popolazioni molto probabilmente rappresentano lo stesso tipo di cellula. Coerentemente con questa ipotesi, la strategia di gating qui presentata non identifica una popolazione distinta che rappresenti le cellule IM3, oltre ai MoDC.
I passaggi critici del protocollo qui descritto includono: 1) la rimozione di tutto il grasso adiacente dai polmoni prima di preparare la sospensione unicellulare, in quanto ciò potrebbe influenzare le letture; 2) permeabilizzazione prima della colorazione con l'anticorpo anti-CD68. Una limitazione del presente protocollo è che non può identificare le cellule non immunitarie del polmone, come epiteliali (CD45-CD326 + CD31-), cellule endoteliali (CD45-CD326-CD31 +) e fibroblasti. L'identificazione di tali popolazioni richiede un approccio diverso28,29. Inoltre, il protocollo richiede la colorazione per CD68, un marcatore intracellulare, che potrebbe rappresentare una limitazione se lo sperimentatore non è esperto nella colorazione intracellulare. Il significato del presente protocollo e della strategia di gating rispetto ai metodi esistenti è che questa strategia fornisce un approccio semplificato che utilizza un numero inferiore di marcatori consentendo al contempo l'identificazione riproducibile di tutte le popolazioni immunitarie del polmone.
Inoltre, viene fornito un metodo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare che minimizza la morte cellulare e consente l'identificazione di un profilo completo del compartimento cellulare immunitario del polmone. Sebbene il protocollo qui delineato descriva la caratterizzazione e l'identificazione delle popolazioni immunitarie polmonari in condizioni di stato stazionario, le applicazioni future potrebbero includere la valutazione di queste popolazioni in vari modelli di malattia in cui può aiutare a identificare i cambiamenti specifici della malattia nel panorama immunitario polmonare. In conclusione, questo articolo presenta un protocollo semplice e riproducibile per la preparazione di singole cellule polmonari e un pannello di citometria a flusso basato su 9 colori per l'identificazione di 12 diverse popolazioni di cellule immunitarie.
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Disclosures
V.A.B. ha brevetti sul percorso PD-1 concessi in licenza da Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis e Dako. Gli autori non dichiarano altri interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01CA238263 e R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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