Summary
In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.
Abstract
De luchtwegen staan in direct contact met de externe omgeving en vereisen een nauwkeurig gereguleerd immuunsysteem om bescherming te bieden en tegelijkertijd ongewenste reacties op omgevingsantigenen te onderdrukken. Longen herbergen verschillende populaties van aangeboren en adaptieve immuuncellen die immuunsurveillance bieden, maar ook beschermende immuunresponsen bemiddelen. Deze cellen, die het gezonde pulmonale immuunsysteem in balans houden, nemen ook deel aan verschillende pathologische aandoeningen zoals astma, infecties, auto-immuunziekten en kanker. Selectieve expressie van oppervlakte- en intracellulaire eiwitten biedt unieke immunofenotypische eigenschappen aan de immuuncellen van de long. Bijgevolg speelt flowcytometrie een instrumentele rol bij de identificatie van dergelijke celpopulaties tijdens steady-state en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol dat een consistente en reproduceerbare methode beschrijft om de immuuncellen te identificeren die zich in de longen van gezonde muizen bevinden onder steady-state omstandigheden. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt om veranderingen in deze celpopulaties in verschillende ziektemodellen te identificeren om ziektespecifieke veranderingen in het longimmuunlandschap te helpen identificeren.
Introduction
De muizenweg bevat een uniek immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor het bestrijden van ziekteverwekkers en het handhaven van immuunhomeostase. Het pulmonale immuunsysteem bestaat uit cellulaire populaties met een significante heterogeniteit in hun fenotype, functie, oorsprong en locatie. Residente alveolaire macrofagen (AM's), voornamelijk afkomstig van foetale monocyten, bevinden zich in het alveolaire lumen1, terwijl van beenmerg afgeleide interstitiële macrofagen (IM's) zich in het longparenchym bevinden2. IM's kunnen verder worden gesubclassificeerd door de expressie van CD206. CD206+ IM's bevolken het peribronchiale en perivasculaire gebied, terwijl CD206-IM's zich bevinden op het alveolaire interstitium3. Onlangs zijn enkele subclassificaties van im's voorgesteld3,4,5,6. Hoewel IM's minder worden bestudeerd dan AM's, ondersteunt recent bewijs hun cruciale rol in de regulatie van het immuunsysteem van de long7. Daarnaast wordt CD206 ook uitgedrukt in alternatief geactiveerde AMs8.
Pulmonale dendritische cellen (DC's) zijn een andere heterogene groep longimmuuncellen met betrekking tot hun functionele eigenschappen, locatie en oorsprong. Vier subcategorieën van DC's zijn beschreven in de longen: conventionele CD103 + DC's (ook bekend als cDC1), conventionele CD11b + DC's (ook bekend als cDC2), monocyt-afgeleide DC's (MoDC's) en plasmacytoïde DC's9,10,11,12,13. De eerste drie subklassen kunnen worden gedefinieerd als major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoïde DC's drukken MHC II uit en zijn gemiddeld positief voor CD11c, maar drukken hoge niveaus van B220 en PDCA-19,13,16 uit. In naïeve muizenlongen bevinden CD103 DC's en CD11b DC's zich in het luchtweginterstitium, terwijl plasmacytoïde DC's zich in het alveolaire interstitium17 bevinden.
Twee belangrijke populaties van monocyten verblijven in de longen tijdens steady state: klassieke monocyten en niet-klassieke monocyten. Klassieke monocyten zijn Ly6C+ en zijn van cruciaal belang voor de initiële ontstekingsreactie. Daarentegen zijn niet-klassieke monocyten Ly6C- en worden ze algemeen beschouwd als ontstekingsremmende cellen3,16,18. Onlangs werd een extra populatie cd64+cd16,2+ monocyten beschreven, die afkomstig zijn van Ly6C-monocyten en aanleiding geven tot CD206+ IM's3.
Eosinofielen verschijnen voornamelijk in de longen tijdens worminfectie of allergische aandoeningen. Er is echter een klein aantal eosinofielen in het pulmonale parenchym tijdens steady state, bekend als resident eosinofielen. In tegenstelling tot de resident eosinofielen worden inflammatoire eosinofielen gevonden in het longinterstitium en bronchoalveolaire lavage (BAL). In muismodellen van huisstofmijt (HDM) worden inflammatoire eosinofielen in de longen gerekruteerd na antigeen-gemedieerde stimulatie. Er is voorgesteld dat resident eosinofielen een regulerende rol kunnen spelen bij allergie door T-helper 2 (Th2) sensibilisatie voor HDM19 te remmen.
In tegenstelling tot de rest van de myeloïde longcellen, drukken neutrofielen Ly6G uit, maar niet CD68 en worden gekenmerkt door een signatuur van het CD68-Ly6G+ immunofenotype16,20,21. Visualisatiestudies hebben aangetoond dat tijdens steady state de longen een pool van neutrofielen in het intravasculaire compartiment reserves en een aanzienlijk aantal extravasculaire neutrofielen host22. Net als eosinofielen worden neutrofielen niet gevonden in BAL bij steady state; verschillende vormen van immuunstimulatie, zoals LPS-uitdaging, astma of longontsteking, drijven neutrofielen echter in het alveolaire lumen, wat resulteert in hun aanwezigheid in BAL21,22,23.
Een aanzienlijk aantal CD45+ cellen van de long vertegenwoordigen natural killer (NK), T-cellen en B-cellen en zijn negatief voor de meeste myeloïde markers24. In de longen van naïeve muizen kunnen deze drie celtypen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van CD11b en MHC II18. Ongeveer 25% van de pulmonale CD45+ cellen zijn B-cellen, terwijl het percentage NK-cellen hoger is in de longen dan andere lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels24,25,26. Onder pulmonale T-cellen is een aanzienlijk deel CD4-CD8- en speelt een belangrijke rol bij luchtweginfecties26.
Omdat de long een zeer complex en uniek immuunsysteem herbergt, zijn verschillende gatingstrategieën voor de identificatie van longimmuuncellen ontwikkeld en gerapporteerd16,18,20,27. De hierin beschreven gating-strategie biedt een uitgebreide en reproduceerbare manier om tot 12 verschillende pulmonale myeloïde en niet-myeloïde immuunpopulaties te identificeren met behulp van 9 markers. Extra markers zijn gebruikt om de resultaten te valideren. Bovendien wordt een gedetailleerde methode geboden voor de bereiding van een eencellige suspensie die celdood minimaliseert en de identificatie van het meest complete profiel van het immuuncelcompartiment van de long mogelijk maakt. Opgemerkt moet worden dat de identificatie van niet-immuuncellen van de long, zoals epitheelcellen (CD45-CD326 + CD31-), endotheelcellen (CD45-CD326-CD31 +), en fibroblasten een andere aanpak vereist28,29. Identificatie van dergelijke populaties is niet opgenomen in het protocol en de methode die hier worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies en experimenten beschreven in dit protocol werden uitgevoerd volgens richtlijnen volgens de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Beth Israel Deaconess Medical Center. Zes tot tien weken oude C57BL/6 muizen van beide geslachten werden gebruikt om dit protocol te ontwikkelen.
1. Chirurgische excisie en weefselvoorbereiding
- Euthanaseer de muis door intraperitoneaal 1 ml tribroomethanol te injecteren (bereid volgens het standaardprotocol; Tabel met materialen).
OPMERKING: CO2-verstikking moet worden vermeden in longstudies omdat dit longletsel kan veroorzaken en de kenmerken en eigenschappen van longimmuuncellen kan veranderen. Cervicale dislocatie moet ook worden vermeden, omdat dit mechanisch letsel van de longen kan veroorzaken. - Breng de muis over naar een schoon en speciaal gebied voor chirurgische ingrepen.
- Stabiliseer de dorsale zijde naar beneden met behulp van naalden of tape op de vier ledematen. Gebruik 70% ethanol om de huid van het ventrale gebied te ontsmetten.
- Voer een incisie uit in de huid, van de nek tot de buik. Verwijder de huid voorzichtig uit het thoracale gebied.
- Verwijder voorzichtig het borstbeen en de ribben.
- Spoel de longen door 10 ml koude PBS rechtstreeks in de rechter ventrikel te injecteren, met behulp van een naald van 18-21 G, totdat de longen volledig wit worden.
- Verwijder voorzichtig de thymus en het hart zonder de longen aan te raken.
- Maak de longen voorzichtig los van de omliggende weefsels en breng ze over naar een buis met koude BSA-buffer (tabel 1).
OPMERKING: Er moet moeite worden gedaan om al het aangrenzende vet uit de longen te verwijderen voordat de eencellige suspensie verder wordt voorbereid, omdat dit de uitlezingen zou kunnen vertekenen.
2. Bereiding van eencellige suspensie
- Breng de longen over in een lege petrischaal en hak ze fijn met twee fijne scalpels. Breng alle stukjes van de gehakte long over in een nieuwe conische buis van 50 ml. Gebruik 5 ml verteringsbuffer om de plaat te wassen en voeg deze toe aan de buis van 50 ml met de gehakte long (tabel 1).
OPMERKING: De digestiebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden voorbereid. Gebruik 5 mg /ml collagenase28. Het combineren van 1 of 5 mg collagenase met BSA-buffer of eiwitvrije PBS verbeterde de resultaten niet (aanvullende figuur S1). - Bevestig het deksel van de buis en verteer de long gedurende 30 minuten op een orbitale shaker met een snelheid van 150 tpm bij 37 °C. Stop de reactie door 10 ml koude BSA-buffer toe te voegen.
- Gebruik na de vertering een naald van 18 G om de longstukken te mengen en op te lossen. Plaats een filterzeef van 70 μm aan de bovenkant van een nieuwe conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Het gebruik van een kleiner micronfilter kan leiden tot het verlies van grote myeloïde populaties. - Breng het verteerde longmengsel langzaam rechtstreeks op de zeef over. Gebruik de rubberen kant van een zuiger van een spuit van 10 ml om de resterende longstukken op het filter te breken. Was het verwerkte materiaal op het filter met BSA-buffer.
- Centrifugeer de eencellige suspensie bij 350 × g gedurende 8 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspend de cellen in 1 ml ACK-lysisbuffer. Meng goed met een pipet van 1 ml en incubeer gedurende 90 s bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ml koude BSA-buffer toe om de reactie te stoppen en centrifugeer bij 350 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C.Gooi het supernatant voorzichtig weg en suspend de pellet in Kleurbuffer om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
- Resuspend de cellen in een concentratie van 5 × 106 cellen/ml en gebruik ze voor oppervlaktekleuring (zie rubriek 3).
OPMERKING: Voor dit doel, plaat de cellen in een 96-well ronde-bodemplaat gevolgd door antilichaam kleuring en wasbeurten. Als er geen plaatcentrifuge beschikbaar is, gebruik dan stromingsbuizen in plaats van platen. Met dit protocol kunnen ~15-20 × 106 cellen per long worden verkregen van een 6-10 weken oude C57BL/6 muis van gemiddelde grootte.
3. Kleuring van antilichamen aan het oppervlak
- Breng 1 × 106 cellen in 200 μL per put over in een plaat met 96 putten. Centrifugeer de plaat bij 350 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Bereid in de tussentijd de Fc-blokoplossing door anti-16/32 antilichaam (1:100) in kleuringsbuffer te verdunnen (tabel 1).
- Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide Fc-blokkerende oplossing (Materiaaltafel) en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 4 °C of op ijs.
- Voeg 150 μL kleurbuffer toe en centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 350 × g . Bereid ondertussen de oppervlakte-antilichaamcocktail voor door oppervlakte-antilichamen te verdunnen (1:100; Tabel 2) in kleuringsbuffer.
OPMERKING: (i) Anti-16/32 antilichaam voor Fc-blocking kan worden gebruikt met de oppervlakteantistoffen in hetzelfde mengsel. ii) Als fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof wordt gebruikt, voeg deze dan toe aan de antilichaamcocktail aan het oppervlak met een verdunning van 1:1.000. - Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide oppervlakte-antilichaamcocktail en incubeer gedurende 30-40 minuten bij 4 °C in het donker. Was de cellen twee keer met vlekkenbuffer.
OPMERKING: Als er geen intracellulaire kleuring nodig is, resuspendeert u de cellen in 200 μL kleuringsbuffer en gaat u direct verder met het verzamelen van gegevens op de flowcytometer. Als alternatief kunnen cellen worden gefixeerd en opgeslagen bij 4 °C voor later verwerving. We raden aan om de cellen te gebruiken voor flowcytometrie binnen 24 uur.
4. Celfixatie en intracellulaire kleuring
- Bereid de fixatie-/permeabilisatiebuffer (Fix/Perm-buffer) voor door drie delen fixatie-/permeabilisatieconcentraat en 1 deel fixatie-/permeabilisatieverdunningsmiddel van de FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set te mengen (tabel 1).
- Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide Fix/Perm Buffer per put van de 96-well plaat, waar de cellen werden verguld zoals beschreven in sectie 3, en incubaleer ze gedurende 20-25 min bij 4 °C in het donker.
- Verdun de 10x permeabilisatiebuffer als 1: 10 in gezuiverd gedeïoniseerd water om 1x permeabilisatiebuffer te bereiden.
- Was de cellen eenmaal met 1x permeabilisatiebuffer. Bereid ondertussen de intracellulaire antilichaamcocktail door intracellulaire antilichamen (1:100) te verdunnen in 1 ml permeabilisatiebuffer.
- Resuspend de cellen met behulp van 50 μL van de vooraf bereide oppervlakte-antilichaamcocktail per cel van de 96-well plaat en incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was de cellen één keer met permeabilisatiebuffer en één keer met kleuringsbuffer. Na de laatste wasbeurt resuspendeert u de cellen in 200 μL kleuringsbuffer.
OPMERKING: Als er geen flowcytometer met plaatlezer beschikbaar is, breng de cellen dan over in flowcytometriebuizen. - Verkrijg minimaal 1,5 × 106 cellen per monster op de flowcytometer.
OPMERKING: Voor enkele kleuren en niet-gekleurde controlemonsters is 0,5-1 × 106 cellen per monster voldoende. Het wordt aanbevolen om de individuele antilichamen te titeren die worden gebruikt om optimale kleuring te bereiken en de kosten te verlagen. Het huidige protocol is geoptimaliseerd met behulp van Fix/Perm Buffer bereid met behulp van de FoxP3 kleuring buffer set. Omdat CD68 een cytoplasmatisch is en geen nucleaire marker, kunnen andere permeabilisatieoplossingen zoals een lage concentratie paraformaldehyde of cytofix/ cytoperm kits van verschillende leveranciers voldoende zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategie
De eerste stap van onze gatingstrategie is het uitsluiten van het puin en de doubletten (figuur 1A). Zorgvuldige uitsluiting van doubletten is van cruciaal belang om vals-positieve populaties te voorkomen (aanvullende figuur S2). Vervolgens worden immuuncellen geïdentificeerd met behulp van CD45+, een marker voor hematopoëtische cellen (figuur 1B). De levend-dode vlek kan worden toegevoegd om dode cellen uit te sluiten. Dit protocol resulteert echter in de dood van <5% van de CD45+ cellen (figuur 1C), terwijl meer CD45-cellen als dood worden geïdentificeerd (aanvullende figuur S3).
Om monocyten en neutrofielen te identificeren, in tegenstelling tot eerdere studies die specifieke antilichamen gebruikten voor elk van deze populaties16,18, geven we de voorkeur aan een anti-GR-1-antilichaam dat zowel Ly6C + - als Ly6G + -cellen identificeert. Het gebruik van het anti-GR-1-antilichaam samen met anti-CD68 maakt de scheiding van de longimmuuncellen in drie clusters mogelijk: CD68-GR-1 +, CD68 + (dat verder kan worden geïdentificeerd als GR-1 + of GR-1-), en CD68-GR-1 - / int (figuur 1D). CD68 is een marker die voornamelijk intracellulair wordt gedetecteerd. Surface CD68 werd onderzocht, maar kon niet worden gedetecteerd zonder fixatie/permeabilisatie (aanvullende figuur S4).
Polymorfonucleaire cellen (neutrofielen) werden geïdentificeerd als CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (figuur 1E). Deze resultaten werden geverifieerd met behulp van GR1 samen met een antilichaam specifiek voor Ly6G (figuur 2), een unieke marker voor polymorfonucleaire neutrofielen16,18,27. Binnen de CD45+CD68-GR-1-/int populatie bestaat ongeveer 10-20% uit MHCII- en CD11blow en vertegenwoordigt de NK-cellen (figuur 1F). NK1.1, een unieke marker voor NK-cellen, is gebruikt om dit te bevestigen (figuur 3)25,30. De CD45+CD68-GR1-/intCD11b-populatie bestaat uit MHCII-T-cellen en MHCII+ B-cellen (figuur 1F). Twee extra antilichamen werden gebruikt om T-cellen en B-cellen-CD3 en B220 respectievelijk te verifiëren (figuur 3).
Bij gezonde muizen onder steady-state omstandigheden zijn de meeste CD45+ cellen die in BAL worden gedetecteerd AM's, de belangrijkste bewoners van de luchtwegen. Daarom werd BAL uitgevoerd om de markers te beoordelen die AMs20,31 kenmerken. Deze cellen zijn CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+, maar drukken, in tegenstelling tot andere myeloïde cellen, geen hoge niveaus van CD11b uit (Figuur 4). Dezelfde combinatie van immuunmarkers identificeert ook AM's in homogenaten van de totale longen (figuur 1G,H). Naast AM's is er in de CD45+CD68+Sigle-F+ gate (Figuur 1G) een aparte celpopulatie die positief is voor CD11b maar niet voor CD11c. Deze CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- populatie van leukocyten vertegenwoordigt eosinofielen (Figuur 1G)19,32.
In de poort met de CD45+CD68+SiglecF-cellen (Figuur 1G) bevindt zich een CD11c+MHC+-populatie die pulmonale DC's vertegenwoordigt (figuur 1I). Verschillende onderzoekers identificeren pulmonale DC's als CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. CD24-expressie werd beoordeeld om de identiteit van deze populatie te bevestigen (figuur 5A). De meerderheid van de long-DC's zijn CD103+CD11b- of CD103-CD11b+ (Figuur 1J). De CD103+CD11b- DC's vertegenwoordigen de CD103+ conventionele DC's en worden geïdentificeerd als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. Cd103-CD11b+ DC's zijn daarentegen onderverdeeld in conventionele DC's en MoDC's op basis van CD64-expressie (figuur 1K). Daarom worden conventionele CD11b+ DC's geïdentificeerd als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64-, terwijl de MoDC's worden geïdentificeerd als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . In tegenstelling tot conventionele DC's zijn MoDC's laag-positief voor de DC-marker CD24 en positief voor pan-macrofaagmarkers, waaronder F4/80, CD64 en MERTK (Figuur 5A)9,10,11,13,33,34.
IM's en klassieke en niet-klassieke monocyten bevinden zich in de CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ gate (figuur 1L) en worden onderscheiden op basis van CD64- en GR-1-expressie (figuur 1M). CD64, een pan-macrofaagmarker, wordt voornamelijk uitgedrukt door IM's en AM's, evenals een subset van DC's. Klassieke monocyten zijn ook bekend als Ly6C + monocyten en niet-klassieke monocyten als Ly6C-monocyten. Zowel monocyten als IM's zijn negatief voor Ly6G; klassieke monocyten drukken echter Ly6C uit en zijn daarom positief voor GR-1. Daarentegen zijn zowel interstitiële macrofagen als niet-klassieke monocyten negatief voor GR-1 en Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Bovendien zijn niet-klassieke monocyten CD11cint, terwijl klassieke monocyten CD11c- zijn. Hoewel dit verschil in CD11c-expressie over het algemeen onbeduidend is voor het onderscheiden van de twee soorten monocyten bij baseline, kan het van cruciaal belang zijn voor pathologische aandoeningen wanneer klassieke monocyten zich ophopen. Op basis van het bovenstaande worden interstitiële macrofagen gedefinieerd als CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64 +, klassieke monocyten als CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64-, en niet-klassieke monocyten als CD45 + CD68 + CD11c-/ intCD11b + GR-1-CD64- . Zowel AM's als IM's zijn positief voor alle macrofaagmarkers, waaronder CD68, CD64, F4/80 en MERTK proto-oncogen. In tegenstelling tot IM's zijn AM's echter CX3CR1-, in tegenstelling tot IM's, wat kan worden verklaard door het verschil in oorsprong van de twee soorten longmacrofagen4,37,38,39 (figuur 5B).
Figuur 1: Gating-strategie van immuuncellen in de muizenlong. Na zorgvuldige uitsluiting van puin, doubletten, dode cellen en de niet-immuuncellen (CD45-) (A-C), werden CD45+ cellen gescheiden in 3 hoofdclusters op basis van de expressie van CD68 en GR-1 (D). Neutrofielen behoren tot de CD68-GR-1+ populatie (E), terwijl de CD68-GR-1-/int populatie bestaat uit NK-cellen, B-cellen en T-cellen (F). CD68+ cellen kunnen verder worden onderverdeeld in Siglec F+ cellen (G), die AM's en eosinofielen (H) zijn, en Siglec F-cellen (G), die bestaan uit monocyten, IM's en DC's (I-M). Afkortingen: SSC-A = piekoppervlak van zijwaarts verstrooid licht; FSC-A = piekoppervlak van voorwaarts verstrooid licht; SSC-H = piekhoogte van zijwaarts verstrooid licht; L/D = levende/dode kleuring; MHC = major histocompatibiliteitscomplex; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-gebonden myeloïde differentiatiemarker (Ly-6G); NK = natuurmoordenaar; IM's = interstitiële macrofagen; DC's = dendritische cellen; AM's = alveolaire macrofagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ly6G in de long wordt alleen uitgedrukt door CD45+CD68-GR-1+CD11b+ cellen geïdentificeerd als polymorfonucleaire neutrofielen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Verificatie van de identificatie van NK-cellen, T-cellen en B-cellen door de gating-strategie. Markers specifiek voor NK 1.1, CD3 en B220 zijn gebruikt om de identificatie van respectievelijk NK-cellen, T-cellen en B-cellen te verifiëren. Opgemerkt moet worden dat NKT-cellen, indien aanwezig, kunnen vallen in de CD3 + celpopulatie binnen de NK-celpoort, en voorzichtigheid is geboden om besmetting van NK met NKT-cellen te voorkomen. Afkortingen: NK = natural killer; MHC = major histocompatibiliteitscomplex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De meerderheid van de immuuncellen verkregen door bronchoalveolaire lavage in naïeve muizen zijn alveolaire macrofagen. Afkortingen: AMs = alveolaire macrofagen; DC's = dendritische cellen; IM = interstitiële macrofaag; SSC-A = piekoppervlak van zijdelings verstrooid licht; FSC-A = piekoppervlak van voorwaarts verstrooid licht; SSC-H = piekhoogte van zijwaarts verstrooid licht; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-gebonden myeloïde differentiatiemarker (Ly-6G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van de expressie van verschillende markers in immuuncellen. (A) Vergelijking van CD24-, CD64-, MERTK-, F4/80- en CD103-expressie in pulmonale DC's. (B) Vergelijking van CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b en CX3CR1 in pulmonale macrofagen en monocyten. Afkortingen: DC's = dendritische cellen; MoDC's = van monocyten afgeleide DC's; AM's = alveolaire macrofagen; IM's = interstitiële macrofagen; SF = Siglec F; MERTK = myeloïde-epitheliaal-reproductief tyrosinekinase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| BSA-buffer | PBS + 0,5% runderserumalbumine | ||
| Verteringsbuffer | Voorverwarmde (37 °C) BSA buffer + 5 mg/ml collagenase type 1 + 0,2 mg/ml DNase I | ||
| Kleuringsbuffer | PBS + 2,5% FBS | ||
| Fix /Perm Buffer | Drie delen fixatie/permeabilisatie verdunningsmiddel en 1 deel fixatie/permeabilisatie verdunningsmiddel van de Foxp3/Transcriptie Factor Kleuring Buffer Set | ||
| Buffer voor permeabilisatie | 10x permeabilisatiebuffer van de Foxp3/Transcriptiefactor kleurbufferset 10 keer verdund in gezuiverd gedeïoniseerd water | ||
Tabel 1: Buffers.
| Antigeen | Kloon | Fluorochroom | Verdunning | Oppervlakte/intracellulair |
| cd45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Oppervlak |
| Gr-1 | RB6-8C5 | Bv421 | 1:100 | Oppervlak |
| cd68 | Fa-11 | PerCPCy5,5 | 1:100 | Intracellulaire |
| cd11b | M1/70 | PeCy7 | 1:100 | Oppervlak |
| Siglec F | s17007l | Fitc | 1:100 | Oppervlak |
| cd11c | N418 | BV650 of BV510 | 1:100 | Oppervlak |
| cd64 | X54-5/7,1 | PE/Verblinding 594 | 1:100 | Oppervlak |
| MHC-II | M5/114.15.2 | Af700 | 1:100 | Oppervlak |
| cd103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Oppervlak |
| Live / Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | FarRed (APC) of Aqua (BV510) | 1:1000 | Oppervlak | |
| cd3 | 17a2 | PE | 1:100 | Oppervlak |
| B220 | Ra3-6B2 | Af488 | 1:100 | Oppervlak |
| NK1.1 | Pk136 | Fitc | 1:100 | Oppervlak |
| cd24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Oppervlak |
| Mertk | 2b10c42 | PE | 1:100 | Oppervlak |
| F4/80 | Bm8 | Bv605 | 1:100 | Oppervlak |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Oppervlak |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Oppervlak |
Tabel 2: Gebruik van monoklonale antilichamen.
Aanvullende figuur S1: De beste cellulaire dissociatie wordt bereikt door 5 mg / ml collagenase 1 in voorverwarmde PBS + 0,5% BSA. In alle verschillende omstandigheden werd ook 0,2 mg DNAse I opgenomen. Afkortingen: BSA = bovine serum albumin; FSC-A = piekoppervlak van voorwaarts verstrooid licht; L/D = levende/dode kleuring; SF = Siglec F. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Opname van doubletten kan resulteren in vals-positieve populaties. Afkorting: FP = false positive. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Meer CD45- dan CD45+ hebben functies die consistent zijn met dode cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Oppervlaktekleuring voor CD68 is niet voldoende om de individuele immuuncelpopulaties van de long goed te onderscheiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identificatie van pulmonale immuuncellen kan een uitdaging zijn vanwege de meerdere immuunceltypen die zich in de longen bevinden en hun unieke immunofenotypische kenmerken in vergelijking met hun tegenhangers die in andere weefsels verblijven. Bij verschillende pathologische aandoeningen verschijnen cellen met verschillende fenotypische kenmerken in de longen. Bleomycine-geïnduceerde longbeschadiging resulteert bijvoorbeeld in de rekrutering van circulerende monocyt-afgeleide macrofagen in de alveolaire ruimte, waar ze zo lang als een jaar kunnen blijven en zelfs kunnen aanhouden na bleomycine-geïnduceerde fibrose. In tegenstelling tot weefselbewonende AM's zijn de circulerende monocyt-afgeleide macrofagen Siglec FlowCD11b+. Gerichte uitputting van de van monocyten afgeleide macrofagen resulteert in de verbetering van bleomycine-gemedieerde longfibrose16,40. Cellen met vergelijkbare kenmerken worden tijdens influenza-infectie naar de longen gerekruteerd en bieden langdurige bescherming tegen streptokokkenpneumonie15.
Op basis van CD11c- en MHC II-expressie zijn IM's verder onderverdeeld in IM1, IM2 en IM3. IM1 zijn immunofenotypisch gedefinieerd als CD11c-MHC II-; IM2 worden gedefinieerd als CD11c-MHC II+; en IM3 worden gedefinieerd als MHC II+CD11c+. Er is voorgesteld dat IM1, IM2 en IM3 de fysiologische stadia van monocyten- naar macrofaagovergang vertegenwoordigen, in plaats van verschillende macrofagencategorieën, waarbij IM3 het monocytische compartiment vertegenwoordigt41. Zoals hierboven vermeld, zijn MoDC's laag-positief voor de DC-marker CD24 en positief voor pan-macrofaagmarkers, waaronder F4 /80, CD64 en MERTK9,10,11,13,33,34. Verschillende studies identificeren cd64+MERKT+-cellen echter als pulmonale macrofagen4,10. Zowel IM3 als MoDC's zijn gedefinieerd als CD64 + MERKT + MHCII + CD11C +, wat suggereert dat deze twee populaties hoogstwaarschijnlijk hetzelfde celtype vertegenwoordigen. In overeenstemming met deze hypothese identificeert de hier gepresenteerde gating-strategie geen afzonderlijke populatie die IM3-cellen vertegenwoordigt, naast MoDC's.
Kritische stappen van het hier beschreven protocol zijn onder meer: 1) het verwijderen van al het aangrenzende vet uit de longen voordat de eencellige suspensie wordt voorbereid, omdat dit de uitlezingen zou kunnen vertekenen; 2) permeabilisatie voor kleuring met het anti-CD68-antilichaam. Een beperking van het huidige protocol is dat het niet-immuuncellen van de longen, zoals epitheliale (CD45-CD326+CD31-), endotheelcellen (CD45-CD326-CD31+) en fibroblasten, niet kan identificeren. Identificatie van dergelijke populaties vereist een andere aanpak28,29. Bovendien vereist het protocol kleuring voor CD68, een intracellulaire marker, die een beperking kan vormen als de onderzoeker geen ervaring heeft met intracellulaire kleuring. Het belang van het huidige protocol en de gating-strategie ten opzichte van bestaande methoden is dat deze strategie een gestroomlijnde aanpak biedt die een lager aantal markers gebruikt en tegelijkertijd reproduceerbare identificatie van alle immuunpopulaties van de long mogelijk maakt.
Bovendien wordt een gedetailleerde methode geboden voor de bereiding van een eencellige suspensie die celdood minimaliseert en de identificatie van een volledig profiel van het immuuncelcompartiment van de long mogelijk maakt. Hoewel het hier geschetste protocol de karakterisering en identificatie van longimmuunpopulaties onder steady-state omstandigheden beschrijft, kunnen toekomstige toepassingen de beoordeling van deze populaties in verschillende ziektemodellen omvatten, waar het kan helpen bij het identificeren van ziektespecifieke veranderingen in het longimmuunlandschap. Concluderend presenteert dit artikel een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor long eencellige voorbereiding en een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel voor de identificatie van 12 verschillende immuuncelpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B. heeft patenten op de PD-1 pathway onder licentie van Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis en Dako. De auteurs verklaren geen andere concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA238263 en R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
