Summary
Det funksjonelle genomiske verktøysettet for de parasittiske nematodene Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti inkluderer transgenese, CRISPR/Cas9-mediert mutagenese og RNAi. Denne protokollen vil demonstrere hvordan man bruker intragonadal mikroinjeksjon for å introdusere transgenes og CRISPR-komponenter i S. stercoralis og S. ratti.
Abstract
Slekten Strongyloides består av flere arter av hudgjennomtrengende nematoder med forskjellige vertsområder, inkludert Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti. S. stercoralis er en menneske-parasittisk, hudgjennomtrengende nematode som infiserer ca 610 millioner mennesker, mens rotteparasitten S. ratti er nært beslektet med S. stercoralis og brukes ofte som laboratoriemodell for S. stercoralis. Både S. stercoralis og S. ratti er lett mottagelige for genereringen av transgener og knockouts gjennom den eksogene nukleinsyreleveringsteknikken for intragonadal mikroinjeksjon, og som sådan har dukket opp som modellsystemer for andre parasittiske helminter som ennå ikke er mottagelige for denne teknikken.
Parasittiske Strongyloides voksne bor i tynntarmen til verten og frigjør avkom i miljøet via avføringen. En gang i miljøet utvikler larvene seg til frittlevende voksne, som lever i avføring og produserer avkom som må finne og invadere en ny vert. Denne miljøgenerasjonen er unik for Strongyloides-artene og ligner nok i morfologi til modellen frittlevende nematode Caenorhabditis elegans som teknikker utviklet for C. elegans kan tilpasses for bruk med disse parasittiske nematodene, inkludert intragonadal mikroinjeksjon. Ved hjelp av intragonadal mikroinjeksjon kan et bredt utvalg av transgenes innføres i Strongyloides. CRISPR/Cas9-komponenter kan også mikroinjiseres for å skape mutante Strongyloides larver. Her beskrives teknikken for intragonadal mikroinjeksjon i Strongyloides, inkludert fremstilling av frittlevende voksne, injeksjonsprosedyren og valg av transgen avkom. Bilder av transgene Strongyloides larver laget ved hjelp av CRISPR / Cas9 mutagenesis er inkludert. Målet med denne artikkelen er å gjøre det mulig for andre forskere å bruke mikroinjeksjon for å skape transgene og mutante Strongyloides.
Introduction
Strongyloides stercoralis har lenge blitt oversett som et viktig menneskelig patogen sammenlignet med de mer anerkjente krokormene og rundorm Ascaris lumbricoides1. Tidligere studier av ormbyrde undervurderte ofte utbredelsen av S. stercoralis på grunn av den lave følsomheten til vanlige diagnostiske metoder for S. stercoralis2. De siste årene har epidemiologiske studier basert på forbedrede diagnostiske verktøy anslått at den sanne forekomsten av S. stercoralis-infeksjoner er mye høyere enn tidligere rapportert, omtrent 610 millioner mennesker over hele verden2.
Både S. stercoralis og andre Strongyloides-arter, inkludert den nært beslektede rotteparasitten og den vanlige laboratoriemodellen S. ratti, har en uvanlig livssyklus som er fordelaktig for eksperimentelle genomiske studier fordi den består av både parasittiske og frittlevende (miljømessige) generasjoner3 (figur 1). Spesielt kan både S. stercoralis og S. ratti sykle gjennom en enkelt frittlevende generasjon. Den frittlevende generasjonen består av post-parasittiske larver som utvikler seg til frittlevende voksne menn og kvinner; alle avkom av de frittlevende voksne utvikler seg til smittende larver, som må infisere en vert for å fortsette livssyklusen. Videre kan denne miljømessige eller frittlevende generasjonen eksperimentelt manipuleres i laboratoriet. Fordi frittlevende Strongyloides voksne og C. elegans voksne deler lignende morfologi, kan teknikker som intragonadal mikroinjeksjon som opprinnelig ble utviklet for C. elegans tilpasses for bruk med frittlevende voksen Strongyloides 4,5. Mens DNA generelt introduseres til frittlevende voksne kvinner, kan både menn og kvinner av Strongyloides mikroinjiseres6. Dermed er funksjonelle genomiske verktøy tilgjengelige for å forhøre mange aspekter av Strongyloides biologi. Andre parasittiske nematoder mangler en frittlevende generasjon, og som et resultat er det ikke så lett egnet til funksjonelle genomiske teknikker3.
Figur 1: Strongyloides stercoralis livssyklus. S. stercoralis parasittiske kvinner bor i tynntarmen til sine pattedyrverter (mennesker, ikke-menneskelige primater, hunder). De parasittiske hunnene reproduserer ved parthenogenese og legger egg i tynntarmen. Eggene klekkes mens de fortsatt er inne i verten i postparasittiske larver, som deretter overføres inn i miljøet med avføring. Hvis de postparasittiske larver er mannlige, utvikler de seg til frittlevende voksne menn. Hvis de postparasittiske larver er kvinnelige, kan de enten utvikle seg til frittlevende voksne kvinner (indirekte utvikling) eller tredjetrinns infektive larver (iL3s; direkte utvikling). De frittlevende hannene og hunnene reproduserer seksuelt for å skape avkom som er begrenset til å bli iL3s. Under visse forhold kan S. stercoralis også gjennomgå autoinfeksjon, der noen av de postparasittiske larver forblir inne i vertstarmen i stedet for å passere inn i miljøet i avføring. Disse larvene kan utvikle seg til autoinfektive larver (L3a) inne i verten, trenge gjennom tarmveggen, migrere gjennom kroppen og til slutt gå tilbake til tarmen for å bli reproduktive voksne. Livssyklusen til S. ratti er lik, bortsett fra at S. ratti infiserer rotter og ikke har en autoinfective syklus. Miljøgenerasjonen er nøkkelen til å bruke Strongyloides arter til genetiske studier. De frittlevende voksne hunnene (P0) kan mikroinjiseres; deres avkom, som alle vil bli iL3s, er potensielle F1 transgenics. Denne figuren er endret fra Castelletto et al. 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
S. stercoralis deler mange aspekter av sin biologi med andre gastrointestinale menneske-parasittiske nematoder, inkludert vertsinvasjon og vertsimmunmodulering. For eksempel smitter human-parasittiske krokorm i slekten Necator og Ancylostoma også ved hudpenetrasjon, navigerer på samme måte gjennom kroppen, og til slutt bor som parasittiske voksne i tynntarmen7. Dermed bruker mange gastrointestinale nematoder sannsynligvis vanlig sensorisk oppførsel og immununndragelsesteknikker. Som et resultat vil kunnskapen fra Strongyloides utfylle funn i andre mindre genetisk gjennomførbare nematoder og føre til en mer fullstendig forståelse av disse komplekse og viktige parasittene.
Denne mikroinjeksjonsprotokollen skisserer metoden for å introdusere DNA i Strongyloides frittlevende voksne kvinner for å lage transgene og mutante avkom. Belastningsvedlikeholdskravene, inkludert utviklingstid for voksne ormer for mikroinjeksjoner og innsamling av transgent avkom, er beskrevet. Protokoller og en demonstrasjon av den komplette mikroinjeksjonsteknikken, sammen med protokoller for dyrking og screening av transgent avkom, er inkludert, sammen med en liste over alt nødvendig utstyr og forbruksvarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Gerbils ble brukt til å passere S. stercoralis, og rotter ble brukt til å passere S. ratti. Alle prosedyrer ble godkjent av UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokoll nr. 2011-060-21A), som overholder AAALAC-standarder og guide for pleie og bruk av laboratoriedyr. Følgende oppgaver må fullføres minst en dag før mikroinjektivering: ormkulturering, klargjøring av mikroinjeksjonsputer, opprette konstruksjoner for mikroinjeksjonsblandingen og spre bakterier (E. coli HB101) på 6 cm Nematode Growth Media (NGM) plater8. De frittlevende hunnene krever minimum 24 timers post-fekal samling ved 25 °C for å utvikle seg til unge voksne før de kan mikroinjiseres. Mikroinjeksjonsputer må være helt tørre. Bakterieplater må tørke og etablere en liten plen.
1. Fremstilling av mikroinjeksjonsskred: minst en dag før injeksjon
MERK: Ormer er montert på mikroinjeksjonsdeksler med tørre agarputer til injeksjon.
- Sett en varmeblokk til 90 °C.
- Tilsett 5 ml ddH2O, deretter 100 mg agarose til et borosilikatglassrør.
- Varm opp agaroseblandingen i røret over en flamme til agarose er oppløst.
- Plasser røret i en varmeblokk satt til 90 °C for å opprettholde agarose i flytende tilstand.
- Slipp ~180 μL av agaroseoppløsningen på en dekslerlip ved hjelp av en pasteurpipet i glass eller en pipet med plastspiss. Slipp umiddelbart en andre deksle på toppen for å flate ut agarose i en tynn pute.
- Etter 5-10 s, fjern toppdekslene ved å skyve de to fra hverandre. Bestem hvilket lysbilde agarputen er på, og legg den med forsiden opp.
- Velg et lite stykke glassskår fra en ødelagt deksleslip og trykk den forsiktig inn i agaren nær toppkanten av puten ved hjelp av tang (Tilleggsfigur S1).
- Fortsett å lage mikroinjeksjonsputer med agaroseoppløsningen.
- Tørk agaroseputene over natten på benken eller i en ovn. Oppbevares i coverlip-boksen.
MERK: Agaroseputene kan brukes i opptil 2 måneder, men brukes kun til én injeksjonskjøring.
2. Culturing Strongyloides å oppnå ormer for mikroinjeksjon: 1 - 2 dager før injeksjon
MERK: En belastningsvedlikeholdsprotokoll finnes i tilleggsmaterialet, som inkluderer en detaljert beskrivelse av hvordan man infiserer gerbils og rotter med nematoder og høster nematoder fra avføring av infiserte dyr.
- To dager før injeksjonsdagen, plasser de infiserte dyrene 9,10 i oppsamlingsbur over natten.
- Neste morgen samler du infisert avføring og lager fekale kullplater 9,10.
- Plasser en tallerken ved 25 °C i 24 timer slik at de frittlevende ormene kan utvikle seg til unge voksne.
- Natten før injeksjonsdagen, plasser uinferte vertsdyr i samlingsbur.
- På injeksjonsdagen, samle ubefengte avføring for etterinjeksjon dyrking.
3. Lage mikroinjeksjonsblandingen: før eller på injeksjonsdagen
MERK: Mikroinjeksjonsblandingen består av plasmidene av interesse fortynnet til ønsket konsentrasjon i ormbufret saltvann (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Bestem konsentrasjonen av plasmidlagrene og ønsket konsentrasjon i mikroinjeksjonsblandingen (tabell 1).
| Mikroinjeksjonsblanding: reporterkonstruksjon | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | Na | 8,3 μL | Na |
| total | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Mikroinjeksjonsblanding: CRISPR/Cas9 mutagenese | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| pMLC47 avgift-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-avgift-4 HDR plasmid | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 plasmid | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 4,2 μL | Na |
| total | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mikroinjeksjonsblanding: piggyBac-integrasjon | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 transposase plasmid | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 7,1 μL | Na |
| total | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabell 1: Eksempler på mikroinjeksjonsblandinger. Plasmidene og konsentrasjonene for tre eksempel mikroinjeksjonsblandinger: en for en gpa-3::GFP-reporter konstruerer 10, en for CRISPR/Cas9-mediert forstyrrelse av Ss-tax-4 locus 14,15, og en for piggyBac-mediert integrasjon av en Ss-gpa-3::GFP-konstruksjon 13,17,18. strCas9 betegner Strongyloides codon-optimalisert Cas9 gen. De endelige konsentrasjonene som er oppført, brukes ofte i Strongyloides mikroinjeksjonsblandinger.
- Fortynn plasmidene i BU til et totalt volum på 10-20 μL.
- Snurr blandingen gjennom en filterkolonne på 5000 × g i 1-2 min.
- Bruk mikroinjeksjonsblandingen umiddelbart eller oppbevar den ved -20 °C for fremtidig bruk.
4. Samle ung voksen Strongyloides for mikroinjeksjon: morgen på injeksjonsdagen
- Sett opp Baermann-apparatet med 1 fekal-kullplate av ung voksen Strongyloides (figur 2).
MERK: Fekal-kullplaten kan inneholde noen infektive larver. Personlig verneutstyr består av labfrakk, hansker og øyebeskyttelse. Ingen hud skal eksponeres mellom hansken og hylsen på labfrakken.
Figur 2: Baermannapparatet brukes til å samle parasittiske ormer fra kulturer10. Innholdet i en fekal-kullplate er plassert på toppen av en kolonne med varmt vann. Ormene migrerer i vannet og samler seg på bunnen av trakten. (A) For å sette opp Baermann-apparatet klemmes stativet for Baermann-trakten til benken med en C-klemme. Et gummirør festet til enden av trakten er lukket med klemmeklemmer, og en fangstbøtte er plassert under røret for drypp. Varmt vann legges til glasstrakten. (B) Plastringholderen for fekal-kullblandingen er deretter foret med 3 stykker laboratorievev (venstre). En trepinne eller tungedepressor (midten) brukes til å overføre innholdet i en fekal-kullplate (høyre) inn i plastringholderen. (C) Et nærbilde av bunnen av plastringholderen for fekal-trekullblandingen, som viser det doble laget av nylon tyll som fôrer bunnen av holderen. (D) Fekalullholderen plasseres deretter på toppen av glasstrakten. (E) Laboratorievevet fuktes med vann og lukkes over fekal-trekullblandingen. Mer varmt vann tilsettes for det meste å nedsenke fekal-trekullet. (F) Det komplette Baermann-oppsettet, med fekal-trekullkulturen nedsenket under varmt vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Monter en glasstrakt med gummioppsamlingsrør på et ringstativ ved hjelp av en O-ring og fest den med en klemme. Lukk oppsamlingsslangen med 2 klemmeklemmer (figur 2A).
- Plasser en fangstbøtte under trakten for å fange drypp.
- Tilsett varmt (ca. 40 °C) vann i trakten til 5 cm under kanten. Kontroller at systemet ikke lekker.
- Line Baermann holderen, en sil laget av 2 plastringer med 2 lag nylon tyll netting sikret mellom dem, med 3 overlappende stykker lab vev. Tilsett fekal-kullblandingen i Baermann-holderen (figur 2B, C).
- Plasser Baermann-holderen med fekal-trekullblandingen i trakten. Brett vevet rundt fekal-trekullblandingen og tilsett nok vann til å nedsenke det meste av fekalullet. Ikke fyll over 2 cm fra kanten på trakten (figur 2D,E).
- Topp trakten med et 15 cm plast Petri parabolen lokk for å inneholde lukten. Merk trakten etter behov (figur 2F).
- Vent i 30 min til 1 time for å samle ormene fra Baermann-apparatet.
- Hold et 50 ml sentrifugerør under gummislangen nederst på trakten. Åpne klemmene forsiktig i bunnen for å dispensere 30-40 ml vann som inneholder ormer i 50 ml-røret.
- Overfør 15 ml baermannvann som inneholder ormene til et 15 ml sentrifugerør. Snurr 15 ml sentrifugerøret i 1 min ved ~750 × g (sakte). Alternativt kan du la ormene til tyngdekraften bosette seg i 10-15 min.
- Fjern supernatanten til ~ 2 ml og kast supernatanten i en avfallsvæskebeholder med jod for å drepe ormer.
- Tilsett mer Baermann vann til 15 ml oppsamlingsrøret og gjenta spinnet. Fjern supernatanten til ~2 ml og kast den som i trinn 4.11.
- Gjenta trinn 4.11 og 4.12 til alle ormene er samlet inn i 15 ml sentrifugerøret. Etter det siste spinnet, fjern så mye vann som mulig.
- Inspiser pellets av ormer (40-100 μL) nederst på røret. Hvis ingen ormer er synlige, vent på en annen 1-2 timer og prøv å samle flere ormer fra Baermann-apparatet.
- Overfør ormene i så lite vann som mulig til en 6 cm 2% NGM-plate med en plen av E. coli HB101. Bruk denne platen som kildeplate for mikroinjeksjonen.
- Kast fekal-kullblandingen ved å behandle den med fortynnet jod (en 50% fortynning av Lugols jod i vann), pakk den inn i plastfilm for å fange drypp og plassere den i en biofarlig avfallsbeholder.
- Tilsett 10 ml fortynnet jod til fangstbøtten og tøm overflødig vann fra Baermann i den.
- Vask de gjenbrukbare komponentene (trakten, fangstbøtten, plastholderen med tyll, plastlokket og klemmene) med 10% blekemiddel og skyll grundig.
5. Trekke og laste mikroinjeksjon nåler: like før injeksjon
- Forbered mikroinjeksjonsnåler ved å trekke glasskapillære rør ved hjelp av en nåletrekker.
MERK: Eksempelinnstillinger for en kommersiell nåletrekker utstyrt med en 3 mm platina/iridiumfilament er Varme = 810-820, Trekk = 800-820, mikrometer = 2,5. - Se tipsene under et dissekeringsmikroskop. Hvis kanylene har ønsket form (figur 3A-F), trekk 4-6 nåler (2-3 kapillærrør). For å oppnå riktig nålform, endre innstillingene etter behov: juster varme- eller trekkinnstillingene med 10 og trekk nye nåler til formen på konen og akselen er mer hensiktsmessig.
Figur 3: Mikroinjeksjonsnåler og en Strongyloides stercoralis voksen kvinne med optimale steder for mikroinjeksjon identifisert. (A-F) Bilder av mikroinjeksjonsnåler. (A-B) Akselkonen (A) og spissen (B) på en nål som er riktig formet for mikroinjeksjon. Spissen er skarp nok til å gjennombore kutiklet og smalt nok til ikke å forårsake overdreven skade. (CD) Skaftet taper (C) og spissen (D) på en mikroinjeksjonsnål som er feil formet for mikroinjektivering. Spissen er for stump og bred, og vil forårsake overdreven skade på ormen. (E-F) Skaftet taper (E) og spissen (F) på en nål som sannsynligvis vil være for lang og slank til å fungere for mikroinjeksjon. Spissen i F ligner veldig på spissen i D. Akselen er imidlertid smalere og for fleksibel til å effektivt gjennombore kutikalen. I tillegg tetter svært slanke nåler lett. (G) Et bilde av hele ormen riktig plassert for mikroinjeksjon, forutsatt at nålen kommer inn fra høyre. Fremre er nede og til venstre; vulvaen er indikert av pilspissen. Gonad er synlig langs høyre side av kvinnen. Denne kvinnen har bare ett egg i livmoren (indikert av stjernen). (H, I) Forstørret utsikt over mikroinjeksjonsstedene. Vinkelen på pilen tilnærmer seg vinkelen på injeksjonsnålen. Vulvaen kan brukes som et landemerke; Det er på motsatt side av ormen fra gonadens armer. Armene på gonadkurven rundt tarmen, og endene med de delte kjernene er motsatt vulvaen. (H) Den bakre armen på gonad; (I) den fremre armen. Enten eller begge armene kan injiseres. For H, jeg, konvensjoner er som i G. Skalastenger = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Oppbevar de trukket nålene i en 15 cm plast Petri-tallerken med et stykke rullet tape for å feste nålene og for å unngå støvakkumulering på spissene.
- Plasser en 0,7 μL dråpe av mikroinjeksjonsblandingen på den åpne enden av akselen. Heng nålen vinkelrett på en hylle ved hjelp av et rullet stykke tape for å fylle den koniske akselen med blandingen innen 10 minutter. Forbered 2 nåler om gangen i tilfelle den første ikke virker.
6. Klargjøring av mikroskopet og brudd på nålen
MERK: Mikroinjeksjon bruker et invertert mikroskop med 5x og 40x mål utstyrt med et mikroinjektoroppsett for å kontrollere bevegelsen av nålen. Det inverterte mikroskopet bør plasseres på et tungt bord eller et luftbord mot vibrasjon for å redusere vibrasjonsstøy. Mikroinjektornålholderen er koblet til nitrogengass som legger trykket som trengs for å levere mikroinjeksjonsblandingen. Et mindre dissekeringsmikroskop i nærheten brukes til å overføre ormene.
- Sett gasstanktrykket til ~ 40-60 psi for å bryte nålen og til ~ 30-50 psi for mikroinjektiv, avhengig av væskestrøm.
- På dissekeringsmikroskopet dekker du glassbiten på mikroinjeksjonsputedekslene med halokarbonolje ved hjelp av et standard platina ormplukk.
- Plasser mikroinjeksjonsputedekslene på mikroinjeksjonsområdet og finn glassbiten dekket av olje. Juster glassskår slik at en kant er vinkelrett på nålens retning for å fungere som overflaten som brukes til å bryte nålen.
- Kontroller at nålen ikke har bobler eller rusk i den koniske akselen ved hjelp av dissekeringsmikroskopet. Fest deretter nålen 1-1,5 cm inn i den trykksatte holderen.
- Plasser spissen av nålen i midten av mikroskopets synsfelt for øye. Deretter under lav forstørrelse, plasser spissen av nålen i synsfeltet, vinkelrett på siden av glassskåren.
- Bytt til høy effekt og juster spissen av nålen med kanten av glasset, nær, men ikke berører den.
MERK: Når de trekkes, smeltes nålene sammen. - For å bryte spissen av nålen for å tillate væskestrøm, trykk den forsiktig på siden av glassstykket mens du påfører kontinuerlig trykk fra gassen (Supplerende figur S1). Når væsken begynner å strømme, kontroller formen på spissen og sørg for at den er skarp med lett flytende væske.
MERK: Hvis væsken strømmer for fort eller enden er for stump, vil ormene bli skadet under mikroinjeksjon (video 1 og figur 3A-F). - Når væsken strømmer godt fra nålen, flytt mikroinjeksjonssklien til dissekeringsområdet og legg dråper på 1-2 μL halokarbonolje på agarputen for plassering av ormene.
- Overfør 20-30 ung voksen Strongyloides til en 2% NGM-plate uten bakterier i minst 5 min for å fjerne overflødige overflatebakterier og velg enkelt ormer for mikroinjeksjon. Legg til flere ormer på NGM-platen etter behov under injisering.
7. Mikroinjektiv strongyloides
- Bruk en liten mengde halokarbonolje på en ormplukk for å velge en Strongyloides ung voksen kvinne med 1-4 egg i gonad fra 2% NGM-platen uten bakterier.
- Overfør ormen til en liten dråpe olje på agarputen. Bruk ormplukkingen til å plassere ormen forsiktig slik at den ikke er spolet og gonad er synlig og lett tilgjengelig. Legg merke til retningen på gonad (figur 3G).
- Plasser ormen i mikroinjeksjonsmikroskopets synsfelt. Pass på at gonaden er på samme side som nålen og plassert slik at nålen kommer i kontakt med gonaden i en liten vinkel (figur 3H,I).
- Ta spissen av nålen til siden av ormen i samme brennplan. Sikt på gonadarmen nær midten av ormen. Bruk mikroinjektoren til å sette kanylen forsiktig inn i gonadet (video 2).
- Påfør straks trykk på nålen for å forsiktig fylle hele gonadarmen med DNA-løsningen. Bestem med øyet når nok væske er injisert (video 2).
MERK: Det kan ta opptil 2 s å fylle gonad. - Fjern kanylen og kontroller at såret lukkes.
MERK: Ormen er for skadet til å produsere avkom hvis gonaden stikker ut gjennom kroppsveggen (Ekstra video S1). - Gjenta med den andre armen på gonad hvis den er synlig.
- Når du er ferdig med å injisere, må du raskt kontrollere at nålen ikke er tilstoppet ved å påføre trykk med nålens spiss på agarputen. Overfør lysbildet med den injiserte ormen til dissekeringsmikroskopet.
- For å gjenopprette den injiserte ormen, legg først noen dråper BU på ormen for å flyte den av agarputen.
- Samle en liten mengde HB101 bakterier på en orm plukke. Berør ormen med de tilhengerbakteriene på ormen plukke for å fjerne den fra væsken.
- Overfør ormen forsiktig til gjenopprettingsplaten , en 2% NGM-plate som inneholder en HB101 plen.
MERK: Ormen skal begynne å krype i løpet av få minutter. - Etter at noen få kvinner er injisert, legg til noen uinjiserte menn fra kildeplaten.
MERK: Minimum en mann for fem kvinner er en god basislinje; Et overskudd av menn er foretrukket. - Gjenta alle trinn til nok kvinner har blitt injisert for eksperimentet.
- La de voksne stå på gjenopprettingsplaten i minst 1 time etter injeksjonen slik at ormene kan gjenopprette og mate.
8. Gjenoppretting og dyrking av injiserte Strongyloides
- Samle avføring over natten fra uinfiserte vertsdyr, ved hjelp av samme protokoll som for smittede dyr.
- Bland de ubefengte avføringene med en liten mengde trekull (avføring til trekullforhold på ca. 2 til 1 for disse platene).
- Hell en liten mengde av fekal-trekullblandingen i en 6 cm Petri-tallerken foret med fuktig filterpapir. Pass på at blandingen ikke berører lokket på parabolen.
- Oversvømme utvinningsplaten med BU. Bruk en pipet satt til 3 μL, overfør ormene til avføringen i fekal-kullplaten. Plasser ormene direkte på avføringen, ikke på kullet.
- Kontroller at de voksne er på kullplaten ved hjelp av et dissekeringsomfang.
- For å dyrke ormene, plasser platen i et fuktet kammer, det vil si en plastboks med et tettsittende lokk foret med fuktige papirhåndklær.
MERK: Etter 2 dager vil det være en blanding av larvestadier. Etter 5 dager vil de fleste larver ha utviklet seg til iL3s; noen yngre larver vil forbli. Etter 7 dager skal alle larver være iL3s.
9. Innsamling og screening F 1 larver for å gjenopprette transgenics / knockouts
- Bruk et Baermann-oppsett, samle larver fra post-injeksjon småskala fecal-charcoal culturing plater. For å få så mange larver som mulig, vent i minst 2 timer før du gjenoppretter ormene fra Baermann-apparatet.
- Konsentrer larvene i et 15 ml sentrifugerør som i trinn 4,10-4,14 og overfør larvene til et lite klokkeglass med BU.
- Hvis larvene skal brukes til atferdseksperimenter, bruk 2% NGM-plater med en tykk plen hb101 for screening.
- Overfør 20-30 larver til HB101 plenen.
MERK: Bakteriene vil bremse larvenes bevegelse. - Under et fluorescens dissekering av mikroskop, identifiser larvene som uttrykker transgene av interesse. Bruk en ormplukk for å velge de transgene larver og flytte dem til et lite klokkeglass med BU.
- Bruk en ny HB101-plate for å screene en annen liten gruppe larver. Når nok larver er samlet inn for eksperimentell bruk, behandle HB101-platene og overflødige ormer med fortynnet jod (50% Lugols jod fortynnet i vann) og kast dem som biofarlig avfall. Alternativt kan du drepe overflødige ormer ved hjelp av konsentrert kennelrenser som inneholder alkylbenyl ammoniumklorider.
- Bruk ormene umiddelbart eller la dem stå i et grunt klokkeglass i en liten mengde BU over natten.
MERK: Ormer kan bli hypoksiske hvis væsken er for dyp. Det er mulig at å forlate larver i BU over natten kan påvirke visse atferd; Bruk derfor larver til atferdseksperimenter innen 6 timer.
- Overfør 20-30 larver til HB101 plenen.
- Hvis larvene skal brukes til mikroskopi og ikke atferdsanalyser, må du immobilisere ormene ved nikotinlammelse reversibelt for screening.
- Bruk et barberblad til å score et rutenett på plastbunnen på en 10 cm chemotaxis plate12 for å gjøre det lettere å holde rede på plasseringen av ormene på platen.
- Slipp ~ 3 μL larver i BU inn i en firkant på rutenettet. Fyll så mange firkanter som nødvendig. Ikke bruk de nær kantene på platen, da larvene kan krype til sidene av platen.
- Tilsett 15-20 μL dråper 1% nikotin i vann til ormdråpene.
MERK: Etter 4 min vil ormene bli lammet. - Screen ormene ved hjelp av et fluorescens dissekerende mikroskop.
- Bruk en ormplukk for å overføre de transgene larver til et lite klokkeglass med 1-2 ml BU.
MERK: Larvene vil bli lammet i flere timer og kan enkelt monteres på mikroskopsklier for mikroskopkopi. Hvis de blir liggende over natten i BU, vil iL3-ene komme seg og kan brukes til noen analyser eller pattedyrinfeksjon. Nikotinlammelse og inkubering over natten i BU kan imidlertid påvirke visse atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis eksperimentet var vellykket, vil F1 larver uttrykke transgene og / eller mutant fenotype av interesse (figur 4). Transformasjonsratene er imidlertid svært variable og avhenger av konstruksjonene, ormenes helse, etterinjeksjonskulturerende forhold og eksperimentets dyktighet. Generelt vil et vellykket eksperiment gi > 15 F1 larver per injisert kvinne og en transformasjonshastighet på >3% for fluorescerende markører. Hvis det totale antall levende avkom er i gjennomsnitt til færre enn 10 larver / kvinner, er det mulig at konstruksjonen er giftig, og de transformerte larver overlever ikke. Å finne et stort antall fluorescerende egg, men ikke fluorescerende larver, er en annen indikasjon på at injeksjonsblandingen kan være giftig. Når du først lærer teknikken, anbefales det å bruke en konstruksjon som uttrykker seg godt, for eksempel act-2::mRFPmars, som driver robust uttrykk i kroppsveggmuskel13 (figur 4).
Ved generering av mutanter ved CRISPR/Cas9-mediert målrettet mutagenese anbefales bruk av en reparasjonsmal som inneholder en handling-2::mRFPmars eller act-2::GFP transgene13 slik at potensielle mutanter kan identifiseres basert på fluorescens 9,14,15. Det er viktig å merke seg at fordi Strongyloides uttrykker transgenes fra ekstrakromosomale arrayer, kan fluorescerende F1-avkom uttrykke mRFPmars eller GFP fra matrisen alene eller uttrykke mRFPmars eller GFP fra både matrisen og en integrert transgene 3,9,16. Det er mulig å identifisere larver som er mer sannsynlig å ha integrerte transgenes basert på mønsteret av fluorescerende uttrykk: "patchy" uttrykk i kroppsveggmuskelen (figur 4A) er mer vanlig når transgene ikke er integrert i genomet, mens konsistent uttrykk gjennom hele kroppsveggmuskelen (figur 4B) er mer vanlig når transgene ikke er integrert i genomet, mens konsistent uttrykk gjennom hele kroppsveggmuskelen (figur 4B) er ) ofte, men ikke alltid, indikerer at transgene har integrert seg i genomet. Uttrykksmønstre alene kan imidlertid ikke brukes til å identifisere mutanter - noen ormer med konsistent uttrykk gjennom hele kroppsveggmuskelen har kanskje ikke integrasjonshendelser. Videre kan uttrykksmønstre ikke skille mutanter som er homozygote fra de som er heterozygote eller mosaikk. Dermed må hver orm være PCR-genotypet 9,14,15. Når du forstyrrer gener som gir lett synlige fenotyper, er det kanskje ikke nødvendig å bruke en reparasjonsmal. For eksempel resulterer forstyrrelse av Strongyloides unc-22 genet i en dominerende "twitcher" fenotype, med frekvensen av heterozygote eller homozygote forstyrrelser over 10%9.
Figur 4: Transgene Strongyloides stercoralis larver. (A, B) S. stercoralis larver uttrykker en handling-2::mRFPmars transgene, som uttrykker i kroppsveggmuskelen13. Transgene ble innlemmet i en reparasjonsmal for CRISPR/Cas9-mediert forstyrrelse av Ss-unc-22 locus9. (A) En S. stercoralis larve med ufullstendig, eller "patchy", act-2::mRFPmars uttrykksmønster som kan indikere uttrykk fra en ekstrakroosomal matrise. (B) En S. stercoralis iL3 som uttrykker den mer komplette act-2::mRFPmars uttrykksmønster som kan indikere genforstyrrelser og integrasjon av reparasjonsmalen. For A, B, viser paneler differensialinterferenskontrast (venstre), fluorescerende (midten) og sammenslåtte (høyre) bilder. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Demonstrasjon av nålebruddsprosessen for å lage en brukbar nål. Spissen av nålen er tappet mot kanten av et glassskår (objekt lengst til venstre). Når væske kommer frem, trekkes nålen tilbake og flyttes ned på agaren. Nålespissen kommer til et skarpt punkt, og væsken strømmer moderat fort. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Demonstrasjon av en vellykket injeksjon. Den bakre armen på gonad er synlig som en lysegrå struktur til høyre. Spissen av nålen og gonaden må være i samme fokusplan. Hvis nålen glir over eller under ormen eller langs kroppen uten å fange, juster posisjonen. Spissen av nålen vil litt rykke inn kroppsveggen. Et raskt trykk på nåleholderen festet til mikromanipulatoren vil forsiktig skyve spissen gjennom kroppsveggen og inn i gonad. Når nålen er inne i gonad, påfør trykk og injiser DNA-løsningen. Væsken skal synlig oversvømme gonaden. Hvis såret lukkes når spissen av nålen fjernes, vil ormen sannsynligvis overleve. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsmateriale: Strongyloides belastningsvedlikehold. Denne protokollen skisserer vedlikeholdsprosedyren for S. stercoralis hos gerbils og S. ratti hos rotter. Det inkluderer infeksjonsdosen som brukes for hver nematode og vert. Verter er smittet via subkutane injeksjoner under anestesi. Progresjonen av infeksjoner fra patency til peak larval output til tap av patency er beskrevet for hver nematode-vert kombinasjon. Protokollen som brukes til å samle infisert avføring og lage fekal-trekull dyrking plater er også beskrevet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S1: Et bilde av en mikroinjeksjonssklie som består av en tørket agarpute på en coverlip med et lite glassskår for å bryte mikroinjeksjonsnålen. Agaromrisset og shardomrisset er lagt til her for klarhet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende film S1: Demonstrasjon av en injeksjon som resulterer i en skadet gonad. Den fremre armen på gonad er i fokus. Påføring av lite trykk viser at løsningen i nålen fortsatt strømmer ut fritt. Spissen av nålen er i samme fokusplan som gonaden og er rettet mot en liten vinkel. Når spissen av nålen er satt inn, injiseres løsningen i ormen og fyller gonad. Men når nålen er fjernet, stikker et stykke av gonaden ut gjennom såret i kutikylen. Materialet flyter synlig ut. Denne ormen er usannsynlig å overleve. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne mikroinjeksjonsprotokollen beskriver metodene for innføring av konstruksjoner for transgenese og CRISPR/Cas9-mediert mutagenese i S. stercoralis og S. ratti. For både S. stercoralis og S. ratti er overlevelse etter injeksjon og graden av transgenese eller mutagenese underlagt flere variabler som kan finjusteres.
Det første kritiske hensynet for vellykket transgenese er hvordan plasmidtransgenes er konstruert. Tidligere studier har funnet at uttrykk for eksogene transgenes i Strongyloides krever bruk av Strongyloides 5' promotører og 3' UTR-elementer 3,13,19. I likhet med C. elegans konstruksjoner, bruker Strongyloides konstruksjoner generelt en genspesifikk promotor og en vanlig 3' UTR, for eksempel den fra Ss-era-1 gen 13. Codon-optimalisering av kodeområdet kan også være viktig for uttrykk i Strongyloides. Nylig ble Wild Worm Codon Adaptor, en nettbasert app som codon-optimaliserer kodingssekvenser for Strongyloides og andre nematoder, utviklet20. Til slutt, selv om de ikke er grundig testet i Strongyloides, har introner vist seg å øke uttrykket for eksogene transgenes i både C. elegans21 og insekt-assosierte nematode Pristionchus pacificus22 og antas å øke uttrykket i Strongyloides også. Wild Worm Codon Adapter har alternativer for å inkludere opptil tre introner i den modifiserte sekvensen20.
Sammensetningen og leveringen av mikroinjeksjonsblandingen påvirker transgenesehastigheten og overlevelsen til F 1-avkom. BU saltvann brukes rutinemessig som fortynningsmiddel for blandinger, selv om bruk av ddH2O også er et alternativ. Konsentrasjonene og/eller forholdet mellom komponentene i blandingen kan justeres for å forbedre transformasjonshastigheten. Høyere konsentrasjoner av plasmidene av renter kan øke hastigheten på transgenese, men resulterer ofte i færre totale avkom. Hvis det ikke observeres noe transgene uttrykk eller bare døde transgene egg blir funnet, er det mulig at transgenene er giftige, eller at noe i plasmidbestandene forårsaker transgenes død. I sistnevnte tilfelle kan det være tilstrekkelig å lage nye plasmidlagre ved hjelp av en annen metode (for eksempel ved hjelp av et annet miniprepsett) for å oppnå transgener. Tilsetning av lipofektamin til mikroinjeksjonsblandingen kan også forbedre hastigheten på transgenese23.
Formen på mikroinjeksjonsnålen som leverer blandingen påvirker også overlevelses- og transgenesehastighetene (figur 3A-F, video 1, video 2 og ekstra video S1). Nålen må være skarp nok til å trenge inn i kutikylen og smal nok til ikke å resultere i overdreven skade. Det anbefales å trekke nåler like før bruk, da nåler som er lagret i mer enn en dag, kan samle rusk og bli tilstoppet under mikroinjeksjoner. Gjenoppretting av injiserte kvinner fra mikroinjeksjonsputen uten å skade dem kan oppnås med noen få forskjellige metoder. En teknikk er å flyte ormene av injeksjonsputen i en dråpe BU, og deretter bruke HB101 på en ormplukk for å samle ormene. Andre teknikker for utvinning inkluderer å flyte ormene i BU og samle dem ved hjelp av en pipettespiss eller en liten pensel eller bare bruke en ormplukk alene for å flytte ormene til en gjenopprettingsplate.
Hvis det ikke ble oppnådd avkom fra de mikroinjiserte hunnene, tyder dette på at enten de injiserte hunnene ble skadet i mikroinjeksjonsprosessen eller etterinjeksjonskulturforholdene var suboptimale. Det er en rekke forskjellige etterinjeksjonskulturerende forhold som kan prøves. De småskala fekale kullkulturene beskrevet ovenfor støtter generelt bedre ormoverlevelse enn NGM-plater med HB101. Det kan imidlertid være vanskelig å følge overlevelsen til de injiserte ormene og utviklingen av F1 larver på fekal-kullplater, og egg er ikke synlige på disse platene. En fordel med å dyrke ormer på NGM-plater med HB101 i stedet for fekale kullplater er å tillate nøye observasjon av egglegging og larveutvikling, noe som kan være nyttig for feilsøking. V12-plater med HB101 kan også brukes til å økeoverlevelsen 24. Til slutt kan en chemotaxis plate12 med en enkelt rotte fekal pellets brukes til S. ratti etter injeksjonskultur. Hannene og injiserte hunnene overføres direkte til rotte fekal pellets. I 5-7 dager samles ormer fra agar og avføring ved hjelp av et Baermann-apparat, som beskrevet ovenfor.
For å oppnå Strongyloides voksne for mikroinjeksjon, kan nylagde fekale kullplater inkuberes ved 25 °C i 24 timer eller 20 °C i 48 timer. Men hvis hunnene er for unge, kan de ikke overleve mikroinjeksjonsprosessen. Voksne samlet fra fekale kullplater som har blitt inkubert ved 20 °C i ca. 48 timer, har større sannsynlighet for å tolerere mikroinjeksjonsprosessen. Men fordi disse voksne er eldre enn voksne oppnådd fra en 24 h inkubasjon ved 25 °C, er de ikke så fecund og kan ha en lavere transformasjonshastighet. Nybegynnere foretrekker kanskje å starte med eldre voksne og deretter bytte til litt yngre voksne etter hvert som ferdighetene forbedres.
I likhet med C. elegans kan Strongyloides-arter uttrykke transgenes fra ekstrakroosomale arrayer og genomintegrerte konstruksjoner i F1-generasjonen . I motsetning til C. elegans, vil Strongyloides arter bare uttrykke genomintegrerte transgenes i F2 og påfølgende generasjoner, selv om de ekstrakroosomale matrisene fortsatt kan påvises av PCR13. F1 transgene larver som uttrykker ekstrakromosomale matriser, kan brukes til eksperimenter som ikke krever genomintegrasjon eller et stort antall transgene ormer. Genomintegrasjon kan være nødvendig for eksperimenter som krever merking av endogene gener eller testing av et stort antall ormer i populasjonsbaserte analyser. Det finnes to metoder for genomintegrasjon av transgenes i Strongyloides: piggyBac transposonmediert integrasjon17 og CRISPR/Cas9-mediert integrasjon9. piggyBac transposonmediert integrasjon bruker piggyBac transposase for å målrette last til TTAA nettsteder i genomet26. Fordi TTAA-motivet er ganske vanlig i det AT-rike genomet til Strongyloides-arter , er integrasjon ofte på mer enn ett sted i genomet. Crispr/Cas9-mediert integrasjon kan derimot brukes til å integrere transgenes på et bestemt mål locus9.
CRISPR/Cas9-systemet kan også brukes til å generere målrettede gen knockouts 9,27. På grunn av AT-rikdommen til Strongyloides-genomet er det en utfordring å finne brukbare Cas9-målsteder som inneholder den optimale 5'-N18GGNGG-3'-sekvensen for nematoder28. Ofte er det bare ett eller to steder i et gen for målretting. Den foretrukne metoden innebærer integrering av en reparasjonsmal som inneholder en transgene med en fluorescerende markør ved homologistyrt reparasjon i det genomiske locus, noe som resulterer i fullstendig forstyrrelse av genet. Potensielle knockouts kan identifiseres ved uttrykk for transgene 9,14,15,29. Transgene uttrykk alene er imidlertid ikke en indikasjon på genotype, da uttrykk fra matriser vs. integrerte transgenes ofte ikke skiller seg ut. Dermed krever F1 transgene larver post-hoc genotyping for å identifisere homozygote knockouts9. I mangel av en reparasjonsmal oppstår mutagenese av mållocus ved høy frekvens, men kan føre til store slettinger9.
Selv om det er relativt enkelt å generere transgene eller mutante F1 larver i S. stercoralis, er det ekstremt vanskelig å generere stabile linjer på grunn av behovet for vertspassasje. I laboratoriet er den mongolske gerbil en tillatt vert for S. stercoralis, men krever en høy dose ormer for å etablere en infeksjon som er i stand til å produsere nok F2 larver til å etablere linjen30. Bare ca 6% av smittende larver blir parasittiske kvinner30. Videre, hvis de transgene larver har matriseuttrykk uten genomintegrasjon, vil de ikke produsere det transgene uttrykksfulle avkom som kreves for å infisere en annen gerbilvert. For å øke sjansene for at tilstrekkelig antall genomintegrerte larver blir reproduktive parasittiske voksne, anbefales minst 400-500 transgene larver i det første inokulumet. Det kan være mulig å redusere antall larver som kreves for å etablere en patentinfeksjon ved å behandle gerbils med prednisolon30. Likevel er det sannsynlig å være vanskelig å samle nok integrerte transgene eller mutante ormer for å lykkes med å etablere en stabil linje med S. stercoralis. Det er imidlertid vanligvis mulig å samle tilstrekkelig antall transgene S. stercoralis F1 larver for enkeltormanalyser14,15.
Strongyloides ratti har den klare fordelen av større gjennomførbarhet av å generere stabile transgene eller knockout linjer17,31. S. ratti frittlevende voksne kvinner er mindre tolerante for mikroinjeksjonsprosessen enn S. stercoralis frittlevende voksne kvinner; S. ratti kvinner produserer generelt færre generelle larver enn S. stercoralis kvinner, og transformasjonsraten er også lavere31. Imidlertid er det bare noen få transgene eller knockout F1 larver som kreves for å etablere en stabil linje med S. ratti. Siden S. ratti er en naturlig parasitt av rotter, er bare noen få S. ratti-infektive larver tilstrekkelig til å etablere en patentinfeksjon32. Dermed er det generelt mulig å samle tilstrekkelig antall transgene eller mutante larver for å etablere en stabil linje. Fordi Strongyloides arter ikke vil uttrykke ekstrakromosomale matriser forbi F1-generasjonen, kan bare genomintegrerte F1 larver produsere en stabil transgen linje13. Det er generelt umulig å identifisere ormer med integrerte transgenes før genotyping, så protokollen er å samle alle transgene F1 larver og injisere dem i en rotte. Noen liten prosentandel av disse larvene vil ha ønsket integrasjonshendelse; disse larvene vil danne grunnlaget for den stabile linjen. Ettersom piggyBac-metoden ofte resulterer i mer enn en integrasjonshendelse i en hvilken som helst individuell orm, kan nesten 100% overføring av transgene oppnås etter noen runder med passerende transgene larver gjennom en rotte17.
Oppsummert kan teknikken som er beskrevet her brukes til å generere transgene eller knockout S. stercoralis og S. ratti. Dette muliggjør et bredt spekter av potensielle eksperimenter, inkludert, men ikke begrenset til, det cellespesifikke uttrykket av transgenes, generering av mutanter og endogen merking av proteiner for å bestemme romlige og tidsmessige funksjoner 14,15,29,33,34,35. På lang sikt kan kunnskap oppnådd ved bruk av transgene Strongyloides brukes til å utvikle nye strategier for å bekjempe menneskelige infeksjoner med S. stercoralis og andre intestinale parasittiske nematoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
pPV540 og pPV402 var snille gaver fra Dr. James Lok ved University of Pennsylvania. Vi takker Astra Bryant for nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av en Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, en Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award og National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
