Summary
Den funktionella genomiska verktygslådan för parasitiska nematoder Strongyloides stercoralis och Strongyloides ratti inkluderar transgenes, CRISPR/ Cas9-medierad mutagenes och RNAi. Detta protokoll kommer att visa hur man använder intragonad mikroinjektion för att införa transgener och CRISPR-komponenter i S. stercoralis och S. ratti.
Abstract
Släktet Strongyloides består av flera arter av hudgenomträngande nematoder med olika värdområden, inklusive Strongyloides stercoralis och Strongyloides ratti. S. stercoralis är en människoparasitär, hudgenomträngande nematod som infekterar cirka 610 miljoner människor, medan råttparasiten S. ratti är nära besläktad med S. stercoralis och ofta används som laboratoriemodell för S. stercoralis. Både S. stercoralis och S. ratti är lätt mottagliga för generering av transgenik och knockouts genom den exogena nukleinsyraleveranstekniken för intragonnadal mikroinjektion, och som sådan har de framträtt som modellsystem för andra parasitiska helminter som ännu inte är mottagliga för denna teknik.
Parasitiska Strongyloides vuxna bor i tunntarmen hos sin värd och släpper avkomma i miljön via avföring. En gång i miljön utvecklas larverna till fritt levande vuxna, som lever i avföring och producerar avkomma som måste hitta och invadera en ny värd. Denna miljögeneration är unik för Strongyloides-arten och tillräckligt lik i morfologin till modellen frilevande nematode Caenorhabditis elegans att tekniker som utvecklats för C. elegans kan anpassas för användning med dessa parasitiska nematoder, inklusive intragonad mikroinjektion. Med hjälp av intragonad mikroinjektion kan en mängd olika transgener införas i Strongyloides. CRISPR/Cas9-komponenter kan också mikroinsprutas för att skapa mutanta Strongyloides-larver . Här beskrivs tekniken för intragonnadal mikroinjektion i Strongyloides, inklusive beredning av fritt levande vuxna, injektionsförfarandet och valet av transgen avkomma. Bilder av transgena Strongyloides-larver skapade med CRISPR/Cas9-mutagenes ingår. Syftet med denna uppsats är att göra det möjligt för andra forskare att använda mikroinjektion för att skapa transgena och mutanta Strongyloides.
Introduction
Strongyloides stercoralis har länge förbisetts som en viktig mänsklig patogen jämfört med de mer allmänt erkända hakmaskarna och rundmasken Ascaris lumbricoides1. Tidigare studier av maskbördan underskattade ofta allvarligt prevalensen av S. stercoralis på grund av den låga känsligheten hos vanliga diagnostiska metoder för S. stercoralis2. Under de senaste åren har epidemiologiska studier baserade på förbättrade diagnostiska verktyg uppskattat att den verkliga förekomsten av S. stercoralis-infektioner är mycket högre än vad som tidigare rapporterats, cirka 610 miljoner människor över hela världen2.
Både S. stercoralis och andra Strongyloides-arter, inklusive den närbesläktade råttparasiten och den vanliga laboratoriemodellen S. ratti, har en ovanlig livscykel som är fördelaktig för experimentella genomiska studier eftersom den består av både parasitiska och fritt levande (miljö) generationer3 (figur 1). Specifikt kan både S. stercoralis och S. ratti cykla genom en enda fritt levande generation. Den fritt levande generationen består av post-parasitiska larver som utvecklas till fritt levande vuxna män och kvinnor; all avkomma till de fritt levande vuxna utvecklas till infektiösa larver, som måste infektera en värd för att fortsätta livscykeln. Dessutom kan denna miljö- eller frilevande generation manipuleras experimentellt i laboratoriet. Eftersom fritt levande Strongyloides vuxna och C. elegans vuxna delar liknande morfologi, kan tekniker som intragonnadal mikroinjektion som ursprungligen utvecklades för C. elegans anpassas för användning med fritt levande vuxna Strongyloides 4,5. Medan DNA i allmänhet introduceras i fritt levande vuxna kvinnor, kan både män och kvinnor av Strongyloides mikroinsprutas6. Således finns funktionella genomiska verktyg tillgängliga för att förhöra många aspekter av Strongyloides biologi. Andra parasitiska nematoder saknar en fritt levande generation, och är därför inte lika lätt mottagliga för funktionella genomiska tekniker3.
Figur 1: Strongyloides stercoralis livscykel. S. stercoralis parasitiska kvinnor bor i tunntarmen hos sina däggdjursvärdar (människor, icke-mänskliga primater, hundar). Parasitkvinnorna reproducerar genom partenogenes och lägger ägg i tunntarmen. Äggen kläcks medan de fortfarande är inne i värden till postparasitära larver, som sedan överförs till miljön med avföring. Om de post-parasitiska larverna är manliga, utvecklas de till fritt levande vuxna män. Om de postparasitära larverna är kvinnliga kan de antingen utvecklas till fritt levande vuxna honor (indirekt utveckling) eller infektionslarver i tredje etappen (iL3s; direkt utveckling). De fritt levande männen och kvinnorna reproducerar sexuellt för att skapa avkomma som är begränsade till att bli iL3s. Under vissa förhållanden kan S. stercoralis också genomgå autoinfektion, där några av de post-parasitiska larverna förblir inuti värdtarmen snarare än att passera in i miljön i avföring. Dessa larver kan utvecklas till autoinfektiva larver (L3a) inuti värden, tränga igenom tarmväggen, migrera genom kroppen och så småningom återvända till tarmen för att bli reproduktiva vuxna. Livscykeln för S. ratti är liknande, förutom att S. ratti infekterar råttor och inte har en autoinfektiv cykel. Miljögenerationen är nyckeln till att använda Strongyloides-arter för genetiska studier. De fritt levande vuxna honorna (P0) kan mikroinsprutas; deras avkomma, som alla kommer att bli iL3s, är den potentiella F 1-transgeniken. Denna siffra har modifierats från Castelletto et al. 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
S. stercoralis delar många aspekter av sin biologi med andra gastrointestinala human-parasitiska nematoder, inklusive värdinvasion och värdimmunmodulering. Till exempel infekterar människo-parasitiska hakmaskar i släktena Necator och Ancylostoma också genom hudpenetration, navigerar på samma sätt genom kroppen och bor slutligen som parasitiska vuxna i tunntarmen7. Således använder många gastrointestinala nematoder sannolikt vanliga sensoriska beteenden och immunundvikande tekniker. Som ett resultat kommer kunskapen från Strongyloides att komplettera fynd i andra mindre genetiskt lättrörliga nematoder och leda till en mer fullständig förståelse av dessa komplexa och viktiga parasiter.
Detta mikroinjektionsprotokoll beskriver metoden för att införa DNA i Strongyloides fritt levande vuxna kvinnor för att göra transgen och mutant avkomma. Kraven på stamunderhåll, inklusive utvecklingstidpunkten för vuxna maskar för mikroinjektioner och insamling av transgen avkomma, beskrivs. Protokoll och en demonstration av den kompletta mikroinjektionstekniken, tillsammans med protokoll för odling och screening av transgen avkomma, ingår, tillsammans med en lista över all nödvändig utrustning och förbrukningsvaror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTERA: Gerbiler användes för att passera S. stercoralis, och råttor användes för att passera S. ratti. Alla förfaranden godkändes av UCLA Office of Animal Research Oversight (protokoll nr 2011-060-21A), som följer AAALAC-standarder och guide för vård och användning av laboratoriedjur. Följande uppgifter måste utföras minst en dag före mikroinjicering: maskodling, beredning av mikroinjektionskuddar, skapande av konstruktioner för mikroinjektionsblandningen och spridning av bakterier (E. coli HB101) på 6 cm Nematodtillväxtmedia (NGM) plattor8. De fritt levande honorna kräver minst 24 timmar efter fekal insamling vid 25 °C för att utvecklas till unga vuxna innan de kan injiceras via mikroinjektion. Mikroinjektionskuddar måste vara helt torra. Bakterieplattor måste torka och etablera en liten gräsmatta.
1. Beredning av mikroinjektionsglas: minst en dag före injektion
OBS: Maskar är monterade på mikroinjektionsöverdrag med torra agarkuddar för injektion.
- Ställ in ett värmeblock på 90 °C.
- Tillsätt 5 mlddH2O, sedan 100 mg agaros till ett borosilikatglasrör.
- Värm agarosblandningen i röret över en låga tills agarosen är upplöst.
- Placera röret i ett värmeblock inställt på 90 °C för att hålla agarosen i flytande tillstånd.
- Släpp ~ 180 μL av agaroslösningen på ett täckglas med en Pasteur-pipett av glas eller en pipett med en plastspets. Släpp omedelbart en andra täckglas ovanpå för att platta ut agarosen till en tunn dyna.
- Efter 5-10 s, ta bort det övre täckglaset genom att skjuta isär de två. Bestäm vilken glida agardynan är på och lägg den med framsidan uppåt.
- Välj en liten bit glasskärva från ett trasigt täckglas och tryck försiktigt in det i agar nära dynans övre kant med pincett (kompletterande figur S1).
- Fortsätt att göra mikroinjektionskuddar med agaroslösningen.
- Torka agaroskuddarna över natten på bänken eller i en ugn. Förvara i täckglaslådan.
OBS: Agaroskuddarna kan användas i upp till 2 månader men används endast för en injektionskörning.
2. Odling av Strongyloides för att erhålla maskar för mikroinjektion: 1 - 2 dagar före injektion
OBS: Ett stamunderhållsprotokoll finns i tilläggsmaterialet, som innehåller en detaljerad beskrivning av hur man infekterar gerbiler och råttor med nematoder och skördar nematoder från avföring från infekterade djur.
- Två dagar före injektionsdagen, placera de smittade djuren 9,10 i insamlingsburar över natten.
- Nästa morgon, samla infekterad avföring och gör fekalkolplattor 9,10.
- Placera en platta vid 25 °C i 24 timmar så att de fritt levande maskarna kan utvecklas till unga vuxna.
- Natten före injektionsdagen, placera oinfekterade värddjur i uppsamlingsburar.
- På injektionsdagen, samla oinfekterad avföring för odling efter injektion.
3. Mikroinjektionsblandning: före eller på injektionsdagen
ANMÄRKNING: Mikroinjektionsblandningen består av plasmider av intresse utspädda till önskad koncentration i maskbuffrad saltlösning (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Bestäm koncentrationen av plasmidbestånden och den önskade koncentrationen i mikroinjektionsblandningen (tabell 1).
| Mikroinjektionsmix: reporterkonstruktion | |||
| Komponent | Lager koncentration | Belopp | Slutlig koncentration |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μl | 1,7 μl | 50 ng/μl |
| Bu | Na | 8,3 μl | Na |
| total | 10 μl | 50 ng/μl | |
| Mikroinjektionsblandning: CRISPR/Cas9-mutagenes | |||
| Komponent | Lager koncentration | Belopp | Slutlig koncentration |
| pMLC47 skatt-4 sgRNA | 300 ng/μl | 2,7 μl | 80 ng/μl |
| pEY11 Ss-skatt-4 HDR-plasmid | 400 ng/μl | 2,0 μl | 80 ng/μl |
| pPV540 strCas9 plasmid | 350 ng/μl | 1,1 μl | 40 ng/μl |
| Bu | Na | 4,2 μl | Na |
| total | 10 μl | 200 ng/μl | |
| Mikroinjektionsmix: piggyBac-integration | |||
| Komponent | Lager koncentration | Belopp | Slutlig koncentration |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μl | 2,0 μl | 60 ng/μl |
| pPV402 transposasplasmid | 450 ng/μl | 0,9 μl | 40 ng/μl |
| Bu | Na | 7,1 μl | Na |
| total | 10 μl | 100 ng/μl | |
Tabell 1: Exempel på mikroinjektionsblandningar. Plasmiderna och koncentrationerna för tre exempelmikroinjektionsblandningar: en för en gpa-3::GFP-reporterkonstruktion 10, en för CRISPR/Cas9-medierad störning av Ss-tax-4-locus 14,15 och en för piggyBac-medierad integration av en Ss-gpa-3::GFP-konstruktion 13,17,18. strCas9 betecknar Strongyloides kodonoptimerade Cas9-gen. De slutliga koncentrationerna som anges används ofta i Strongyloides mikroinjektionsblandningar.
- Späd plasmiderna i BU till en total volym av 10-20 μl.
- Snurra blandningen genom en filterkolonn vid 5 000 × g i 1-2 min.
- Använd mikroinjektionsblandningen omedelbart eller förvara den vid -20 °C för framtida användning.
4. Samla unga vuxna Strongyloides för mikroinjektion: morgon på injektionsdagen
- Ställ in Baermann-apparaten med 1 fekalkolplatta av unga vuxna Strongyloides (figur 2).
OBS: Fekalkolplattan kan innehålla några infektiösa larver. Personlig skyddsutrustning består av labbrock, handskar och ögonskydd. Ingen hud ska exponeras mellan handsken och labbrockens ärm.
Figur 2: Baermannapparaten som används för att samla parasitiska maskar från kulturer10. Innehållet i en fekalkolplatta placeras högst upp på en kolonn med varmt vatten. Maskarna migrerar i vattnet och samlas i botten av tratten. (A) För att ställa in Baermann-apparaten kläms stativet för Baermann-tratten fast i bänken med en C-klämma. Ett gummirör fäst vid trattens ände stängs med klämklämmor och en fångsthink placeras under röret för droppar. Varmt vatten läggs till glastratten. (B) Plastringhållaren för fekalkolblandningen är sedan fodrad med 3 bitar laboratorievävnader (vänster). En träpinne eller tungtryckare (mitten) används för att överföra innehållet i en fekalkolplatta (höger) till plastringhållaren. (C) En närbild av botten av plastringhållaren för fekalkolblandningen, som visar det dubbla lagret av nylontyll som kantar hållarens botten. (D) Fekalkolhållaren placeras sedan på toppen av glastratten. (E) Laboratorievävnaden fuktas med vatten och stängs över fekalkolblandningen. Mer varmt vatten tillsätts för att mestadels sänka ner fekalkolet. (F) Den kompletta Baermann-installationen, med fekalkolkulturen nedsänkt under varmt vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Installera en glastratt med gummiuppsamlingsslang på ett ringstativ med en O-ring och säkra den med en klämma. Stäng uppsamlingsslangen med 2 klämklämmor (bild 2A).
- Placera en fångsthink under tratten för att fånga droppar.
- Tillsätt varmt (ca 40 °C) vatten i tratten till 5 cm under kanten. Kontrollera att systemet inte läcker.
- Linja Baermannhållaren, en sil gjord av 2 plastringar med 2 lager tyllnät i nylon säkrat mellan dem, med 3 överlappande bitar av labbvävnad. Tillsätt fekalkolblandningen till Baermannhållaren (figur 2B,C).
- Placera Baermann-hållaren med fekalkolblandningen i tratten. Vik vävnaderna runt fekalkolblandningen och tillsätt tillräckligt med vatten för att sänka ner det mesta av fekalkolet. Fyll inte över 2 cm från trattens kant (figur 2D,E).
- Toppa tratten med ett 15 cm petriskålslock i plast för att innehålla lukten. Märk tratten efter behov (bild 2F).
- Vänta 30 min till 1 timme för att samla maskarna från Baermann-apparaten.
- Håll ett 50 ml centrifugrör under gummislangen längst ner i tratten. Öppna försiktigt klämmorna i botten för att dosera 30-40 ml vatten som innehåller maskar i 50 ml röret.
- Överför 15 ml av Baermann-vattnet som innehåller maskarna till ett 15 ml centrifugrör. Snurra 15 ml centrifugröret i 1 min vid ~ 750 × g (långsamt). Alternativt kan du låta maskarna lägga sig i 10-15 min.
- Ta bort supernatanten till ~ 2 ml och kassera supernatanten i en flytande behållare med jod för att döda eventuella maskar.
- Tillsätt mer Baermann-vatten i 15 ml uppsamlingsröret och upprepa snurret. Ta bort supernatanten till ~ 2 ml och kassera som i steg 4.11.
- Upprepa steg 4.11 och 4.12 tills alla maskar har samlats upp i 15 ml centrifugröret. Efter den sista snurrningen, ta bort så mycket vatten som möjligt.
- Inspektera pelleten av maskar (40-100 μL) längst ner på röret. Om inga maskar är synliga, vänta på ytterligare 1-2 timmar och försök samla fler maskar från Baermann-apparaten.
- Överför maskarna i så lite vatten som möjligt till en 6 cm 2% NGM-platta med en gräsmatta av E. coli HB101. Använd denna platta som källplatta för mikroinjektionen.
- Kassera fekalkolblandningen genom att behandla den med utspädd jod (en 50% utspädning av Lugols jod i vatten), förpacka den i plastfilm för att fånga droppar och placera den i en biofarlig avfallsbehållare.
- Tillsätt 10 ml utspädd jod till fångsthinken och töm överflödigt vatten från Baermann in i den.
- Tvätta de återanvändbara komponenterna (tratten, fångsthinken, plasthållaren med tyll, plastlocket och klämmorna) med 10% blekmedel och skölj noggrant.
5. Dra och ladda mikroinjektionsnålar: strax före injektion
- Förbered mikroinjektionsnålar genom att dra glaskapillärrör med en nåldragare.
OBS: Exempelinställningar för en kommersiell nåldragare utrustad med en 3 mm platina / iridiumfilament är Värme = 810-820, Pull = 800-820, mikrometer = 2,5. - Visa spetsarna under ett dissekerande mikroskop. Om nålarna har önskad form (figur 3A-F), dra 4-6 nålar (2-3 kapillärrör). För att uppnå rätt nålform, ändra inställningarna efter behov: justera värme- eller draginställningarna med 10 och dra i nya nålar tills formen på avsmalningen och axeln är mer lämplig.
Figur 3: Mikroinjektionsnålar och en vuxen kvinna med starkayloides stercoralis med optimala platser för mikroinjektion identifierade. (A-B) Skaftavsmalnar (A) och spetsen (B) på en nål som är korrekt formad för mikroinjektion. Spetsen är tillräckligt skarp för att genomborra nagelbandet och tillräckligt smal för att inte orsaka överdriven skada. (C-D) Skaftavsmalnar (C) och spetsen (D) på en mikroinjektionsnål som är felaktigt formad för mikroinjektion. Spetsen är för trubbig och bred och kommer att orsaka överdriven skada på masken. (E-F) Skaftavsmalnar (E) och spetsen (F) på en nål som sannolikt är för lång och smal för att fungera för mikroinjektion. Spetsen i F är mycket lik spetsen i D. Axeln är dock smalare och för flexibel för att effektivt genomborra nagelbandet. Dessutom täpps mycket smala nålar lätt. (G) En bild av hela masken korrekt placerad för mikroinjektion, förutsatt att nålen kommer in från höger. Främre är ner och till vänster; vulva indikeras av pilspetsen. Gonaden är synlig längs kvinnans högra sida. Denna kvinna har bara ett ägg i livmodern (indikeras av asterisken). (H, I) Förstorade vyer av mikroinjektionsställena. Pilens vinkel approximerar injektionsnålens vinkel. Vulva kan användas som ett landmärke; det är på motsatt sida av masken från gonadens armar. Gonadkurvans armar runt tarmen och ändarna med de delande kärnorna ligger mittemot vulva. (H) Gonadens bakre arm; (I) den främre armen. Endera eller båda armarna kan injiceras. För H, I är konventioner som i G. Skalstänger = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förvara de dragna nålarna i en 15 cm petriskål i plast med en bit rullad tejp för att säkra nålarna och för att undvika dammansamling på spetsarna.
- Placera en droppe på 0,7 μl av mikroinjektionsblandningen på axelns öppna ände. Häng nålen vinkelrätt mot en hylla med en rullad tejpbit för att fylla den avsmalnande axeln med blandningen inom 10 minuter. Förbered 2 nålar åt gången om den första inte fungerar.
6. Förbereda mikroskopet och bryta nålen
OBS: Mikroinjektion använder ett inverterat mikroskop med 5x och 40x mål utrustade med en mikroinjektorinställning för att styra nålens rörelse. Det inverterade mikroskopet ska placeras på ett tungt bord eller antivibrationsluftbord för att minska vibrationsbuller. Mikroinjektornålhållaren är ansluten till kvävgas som applicerar det tryck som behövs för att leverera mikroinjektionsblandningen. Ett mindre dissekeringsmikroskop i närheten används för att överföra maskarna.
- Ställ in bensintankens tryck på ~ 40-60 psi för att bryta nålen och till ~ 30-50 psi för mikroinjektering, beroende på vätskeflöde.
- På dissekeringsmikroskopet täcker du glasskärvan på mikroinjektionsplattans täckglas med halokarbonolja med en vanlig platinamaskplockning.
- Placera mikroinjektionsplattans överdrag på mikroinjektionsomfånget och leta reda på glasskärvan täckt av olja. Rikta in glasskärvan så att en kant är vinkelrät mot nålens riktning för att fungera som ytan som används för att bryta nålen.
- Kontrollera att nålen inte har några bubblor eller skräp i den avsmalnande axeln med hjälp av dissekeringsmikroskopet. Fäst sedan nålen 1-1,5 cm i tryckhållaren.
- Placera nålspetsen i mitten av mikroskopets synfält med ögat. Placera sedan nålens spets under låg förstoring i synfältet, vinkelrätt mot sidan av glasskärvan.
- Byt till hög effekt och rikta in nålspetsen med glasets kant, nära men inte vidröra den.
OBS: När de dras smälts nålarna stängda. - För att bryta nålspetsen för att tillåta vätskeflöde, knacka försiktigt på den på sidan av glasbiten medan du applicerar kontinuerligt tryck från gasen (kompletterande figur S1). När vätskan börjar flöda, kontrollera spetsens form och se till att den är skarp med lättflytande vätska.
OBS: Om vätskan flyter för snabbt eller änden är för trubbig kommer maskarna att skadas under mikroinjektion (Video 1 och figur 3A-F). - När vätskan flyter väl från nålen, flytta mikroinjektionsglaset till dissekeringsomfånget och placera droppar av 1-2 μL halokarbonolja på agardynan för placering av maskarna.
- Överför 20-30 unga vuxna Strongyloides till en 2% NGM-platta utan bakterier i minst 5 minuter för att ta bort överflödiga ytbakterier och välj enstaka maskar för mikroinjektion. Tillsätt fler maskar på NGM-plattan efter behov under injektion.
7. Mikroinjektion av Strongyloides
- Använd en liten mängd halokarbonolja på en maskplockning för att välja en Strongyloides ung vuxen hona med 1-4 ägg i sin gonad från 2% NGM-plattan utan bakterier.
- Överför masken till en liten droppe olja på agardynan. Använd maskplockningen och placera försiktigt masken så att den inte lindas och gonaden är synlig och lätt att komma åt. Notera gonadens riktning (figur 3G).
- Placera masken i mikroinjektionsmikroskopets synfält. Se till att gonaden är på samma sida som nålen och placerad så att nålen kommer i kontakt med gonaden i en liten vinkel (figur 3H, I).
- För nålspetsen till sidan av masken i samma fokalplan. Sikta på gonadarmen nära mitten av masken. Använd mikroinjektorn för att försiktigt föra in nålen i gonaden (Video 2).
- Tryck omedelbart på nålen för att försiktigt fylla hela gonadarmen med DNA-lösningen. Bestäm med ögat när tillräckligt med vätska har injicerats (Video 2).
OBS: Det kan ta upp till 2 s att fylla gonaden. - Ta bort nålen och kontrollera att såret stängs.
OBS: Masken är för skadad för att producera avkomma om gonaden sticker ut genom kroppsväggen (Kompletterande video S1). - Upprepa med den andra armen på gonaden om den är synlig.
- När du är klar med injektionen, kontrollera snabbt att nålen inte är igensatt genom att trycka på nålspetsen på agardynan. Överför bilden med den injicerade masken till dissekeringsmikroskopet.
- För att återställa den injicerade masken, placera först några droppar BU på masken för att flyta den från agarkudden.
- Samla en liten mängd HB101-bakterier på en maskplockning. Rör vid masken med de vidhäftande bakterierna på maskplockningen för att ta bort den från vätskan.
- Överför försiktigt masken till återvinningsplattan , en 2% NGM-platta som innehåller en HB101-gräsmatta.
OBS: Masken bör börja krypa inom några minuter. - Efter att några honor har injicerats, lägg till några oinsprutade hanar från källplattan.
OBS: Minst en hane för fem honor är en bra baslinje; ett överskott av män föredras. - Upprepa alla steg tills tillräckligt många honor har injicerats för experimentet.
- Lämna de vuxna på återhämtningsplattan i minst 1 timme efter injektionen så att maskarna kan återhämta sig och para sig.
8. Återhämtning och odling av injicerade Strongyloides
- Samla avföring över natten från oinfekterade värddjur, med samma protokoll som för infekterade djur.
- Blanda den oinfekterade avföringen med en liten mängd kol (avföring till kolförhållande på cirka 2 till 1 för dessa plattor).
- Häll en liten mängd fekalkolblandning i en 6 cm petriskål fodrad med fuktigt filterpapper. Se till att blandningen inte vidrör locket på skålen.
- Använd en pipett inställd på 3 μl och överför maskarna till avföringen i fekalkolplattan. Placera maskarna direkt på avföringen, inte på kolet.
- Kontrollera att de vuxna är på fekalkolplattan med ett dissekeringsomfång.
- För att odla maskarna, placera plattan i en fuktad kammare, dvs en plastlåda med ett tätt passande lock fodrat med fuktiga pappershanddukar.
OBS: Efter 2 dagar kommer det att finnas en blandning av larvstadier. Efter 5 dagar kommer de flesta larverna att ha utvecklats till iL3s; några yngre larver kommer att finnas kvar. Efter 7 dagar ska alla larver vara iL3s.
9. Samla in och screena F 1-larver för att återställa transgena/knockouts
- Använd en Baermann-installation och samla larverna från de småskaliga fekalkolodlingsplattorna efter injektionen. För att få så många larver som möjligt, vänta i minst 2 timmar innan du återställer maskarna från Baermann-apparaten.
- Koncentrera larverna i ett 15 ml centrifugrör som i steg 4.10-4.14 och överför larverna till ett litet klockglas med BU.
- Om larverna kommer att användas för beteendeexperiment, använd 2% NGM-plattor med en tjock gräsmatta av HB101 för screening.
- Överför 20-30 larver till HB101 gräsmattan.
OBS: Bakterierna kommer att bromsa larvernas rörelse. - Under ett fluorescensdissekerande mikroskop, identifiera larverna som uttrycker transgenen av intresse. Använd en maskplockning för att välja de transgena larverna och flytta dem till ett litet klockglas med BU.
- Använd en ny HB101-platta för att screena ytterligare en liten sats larver. När tillräckligt många larver har samlats in för experimentell användning, behandla HB101-plattorna och överskottsmaskarna med utspädd jod (50% Lugols jod utspädd i vatten) och kassera dem som biofarligt avfall. Alternativt kan du döda överflödiga maskar med koncentrerad kennelrengörare som innehåller alkylbensylammoniumklorider.
- Använd maskarna omedelbart eller lämna dem i ett grunt klockglas i en liten mängd BU över natten.
OBS: Maskar kan bli hypoxiska om vätskan är för djup. Det är möjligt att lämna larver i BU över natten kan påverka vissa beteenden; Använd därför larver för beteendeexperiment inom 6 timmar.
- Överför 20-30 larver till HB101 gräsmattan.
- Om larverna kommer att användas för mikroskopi och inte beteendeanalyser, immobilisera sedan maskarna genom nikotinförlamning reversibelt för screening.
- Använd ett rakblad och placera ett galler på plastbotten på en 10 cm kemotaxiplatta12 för att göra det lättare att hålla reda på maskarnas placering på plattan.
- Släpp ~ 3 μl larver i BU i en fyrkant på gallret. Fyll så många rutor som behövs. Använd inte de nära plattans kanter, eftersom larverna kan krypa till sidorna av plattan.
- Tillsätt 15-20 μl droppar 1% nikotin i vatten till maskdropparna.
OBS: Efter 4 min kommer maskarna att förlamas. - Skärma maskarna med ett fluorescensdissekerande mikroskop.
- Använd en maskplockning för att överföra de transgena larverna till ett litet klockglas med 1-2 ml BU.
OBS: Larverna kommer att förlamas i flera timmar och kan enkelt monteras på mikroskopglas för mikroskopi. Om de lämnas över natten i BU kommer iL3s att återhämta sig och kan användas för vissa analyser eller däggdjursvärdinfektion. Nikotinförlamning och inkubation över natten i BU kan dock påverka vissa beteenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om experimentet lyckades kommer F1-larverna att uttrycka transgen- och / eller mutantfenotypen av intresse (figur 4). Transformationshastigheterna är emellertid mycket varierande och beror på konstruktionerna, maskarnas hälsa, odlingsförhållandena efter injektionen och experimentens skicklighet. I allmänhet kommer ett framgångsrikt experiment att ge >15 F1 larver per injicerad kvinna och en transformationshastighet på >3% för fluorescerande markörer. Om det totala antalet levande avkommor är i genomsnitt färre än 10 larver/honor, är det möjligt att konstruktionen är giftig och att de transformerade larverna inte överlever. Att hitta ett stort antal fluorescerande ägg men inte fluorescerande larver är en annan indikation på att injektionsblandningen kan vara giftig. När du först lär dig tekniken rekommenderas att du använder en konstruktion som uttrycker sig väl, till exempel act-2::mRFPmars, som driver robust uttryck i kroppsväggsmuskel13 (figur 4).
Vid generering av mutanter genom CRISPR/Cas9-medierad riktad mutagenes rekommenderas användning av en reparationsmall som innehåller en akt-2::mRFPmars eller act-2::GFP-transgen 13 så att potentiella mutanter kan identifieras baserat på fluorescens 9,14,15. Det är viktigt att notera att eftersom Strongyloides uttrycker transgener från extrakromosomala arrays, kan fluorescerande F1-avkomma uttrycka mRFPmars eller GFP från arrayen ensam eller uttrycka mRFPmars eller GFP från både arrayen och en integrerad transgen 3,9,16. Det är möjligt att identifiera larver som är mer benägna att ha integrerade transgener baserat på mönstret för fluorescerande uttryck: "fläckigt" uttryck i kroppsväggsmuskeln (figur 4A) är vanligare när transgenen inte är integrerad i genomet, medan konsekvent uttryck i hela kroppsväggsmuskeln (Figur 4B ) indikerar ofta, men inte alltid, att transgenen har integrerats i genomet. Uttrycksmönster ensamma kan dock inte användas för att slutgiltigt identifiera mutanter - vissa maskar med konsekvent uttryck i hela kroppsväggsmuskeln kanske inte har integrationshändelser. Dessutom kan uttrycksmönster inte skilja mutanter som är homozygota från de som är heterozygota eller mosaik. Således måste varje mask vara PCR-genotypad 9,14,15. När man stör gener som ger lätt synliga fenotyper kanske det inte är nödvändigt att använda en reparationsmall. Till exempel resulterar störning av Strongyloides unc-22-genen i en dominerande "twitcher" fenotyp, med hastigheter av heterozygota eller homozygota störningar över 10%9.
Figur 4: Transgena Strongyloides stercoralis larver (A, B) S. stercoralis larver som uttrycker en akt-2::mRFPmars transgen, som uttrycker i kroppsväggsmuskeln13. Transgenen införlivades i en reparationsmall för CRISPR/Cas9-medierad störning av Ss-unc-22 locus9. (A) En S. stercoralis-larv med ett ofullständigt eller "fläckigt" handling-2::mRFPmars uttrycksmönster som kan indikera uttryck från en extrakromosomaal array. (B) En S. stercoralis iL3 som uttrycker det mer fullständiga handlingsmönstret 2::mRFPmars som kan indikera genavbrott och integration av reparationsmallen. För A, B visar paneler differentiell interferenskontrast (vänster), fluorescerande (mitten) och sammanfogade (höger) bilder. Skalstänger = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Demonstration av nålbrytningsprocessen för att göra en användbar nål. Nålspetsen trycks mot kanten på en glasskärva (föremål längst till vänster). När vätska kommer fram dras nålen tillbaka och flyttas ner på agar. Nålspetsen kommer till en skarp punkt och vätskan flyter måttligt snabbt. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Demonstration av en lyckad injektion. Gonadens bakre arm är synlig som en ljusgrå struktur till höger. Nålens spets och gonaden måste vara i samma fokalplan. Om nålen glider över eller under masken eller längs kroppen utan att fånga, justera positionen. Nålens spets kommer något att dra in kroppsväggen. Ett snabbt tryck på nålhållaren som är fäst vid mikromanipulatorn kommer försiktigt att trycka spetsen genom kroppsväggen och in i gonaden. När nålen är inne i gonaden, applicera tryck och injicera DNA-lösningen. Vätskan ska synligt översvämma gonaden. Om såret stängs när nålspetsen tas bort, kommer masken sannolikt att överleva. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande material: Strongyloides stamunderhåll. Detta protokoll beskriver underhållsförfarandet för S. stercoralis hos gerbiler och S. ratti hos råttor. Den innehåller den infektionsdos som används för varje nematod och värd. Värdar smittas via subkutana injektioner under anestesi. Utvecklingen av infektioner från patency till topp larvproduktion till förlust av patency beskrivs för varje kombination av nematod-värd. Protokollet som används för att samla infekterad avföring och göra odlingsplattorna för fekalkol beskrivs också. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: En bild av en mikroinjektionsglas bestående av en torkad agarkudde på ett täckglas med en liten glasskärva för att bryta mikroinjektionsnålen. Agarskissen och skärvskissen läggs till här för tydlighetens skull. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande film S1: Demonstration av en injektion som resulterar i en skadad gonad. Gonadens främre arm är i fokus. Att applicera ett litet tryck visar att lösningen i nålen fortfarande flyter ut fritt. Nålens spets ligger i samma fokalplan som gonaden och är riktad mot en liten vinkel. När nålspetsen har satts in injiceras lösningen i masken och fyller gonaden. Men när nålen tas bort sticker en bit av gonaden ut genom såret i nagelbandet. Materialet flyter synligt ut. Denna mask är osannolikt att överleva. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta mikroinjektionsprotokoll beskriver metoderna för att införa konstruktioner för transgenes och CRISPR/ Cas9-medierad mutagenes i S. stercoralis och S. ratti. För både S. stercoralis och S. ratti är överlevnad efter injektion och graden av transgenes eller mutagenes föremål för flera variabler som kan finjusteras.
Det första kritiska övervägandet för framgångsrik transgenes är hur plasmidtransgener konstrueras. Tidigare studier har visat att uttryck av exogena transgener i Strongyloides kräver användning av Strongyloides 5'-promotorer och 3'UTR-element 3,13,19. I likhet med C. elegans-konstruktioner använder Strongyloides-konstruktioner i allmänhet en genspecifik promotor och en vanlig 3 'UTR, såsom den från Ss-era-1-genen 13. Kodonoptimering av kodningsregionen kan också vara viktigt för uttryck i Strongyloides. Nyligen utvecklades Wild Worm Codon Adaptor, en webbaserad app som kodonoptimerar kodningssekvenser för Strongyloides och andra nematoder,20. Slutligen, även om de inte testats noggrant i Strongyloides, har introner visat sig öka uttrycket av exogena transgener i både C. elegans21 och den insektsassocierade nematoden Pristionchus pacificus22 och antas också öka uttrycket i Strongyloides. Wild Worm Codon Adapter har alternativ för att inkludera upp till tre introner i den modifierade sekvensen20.
Sammansättningen och leveransen av mikroinjektionsblandningen påverkar transgeneshastigheten och överlevnaden av F1-avkomman. BU saltlösning används rutinmässigt som utspädningsmedel för blandningar, även om användning av ddH2O också är ett alternativ. Koncentrationerna och/eller förhållandet mellan komponenterna i blandningen kan justeras för att förbättra transformationshastigheten. Högre koncentrationer av plasmiderna av intresse kan öka graden av transgenes men resulterar ofta i färre totala avkommor. Om inget transgent uttryck observeras eller bara döda transgena ägg hittas är det möjligt att transgenerna är giftiga, eller att något i plasmidbestånden orsakar transgenikens död. I det senare fallet kan det vara tillräckligt att göra nya plasmidbestånd med en annan metod (till exempel med ett annat miniprep-kit) för att erhålla transgenik. Att lägga lipofectamin till mikroinjektionsblandningen kan också förbättra transgeneshastigheten23.
Formen på mikroinjektionsnålen som levererar blandningen påverkar också överlevnads- och transgeneshastigheterna (figur 3A-F, video 1, video 2 och kompletterande video S1). Nålen måste vara tillräckligt skarp för att tränga in i nagelbandet och tillräckligt smal för att inte leda till överdriven skada. Det rekommenderas att dra nålar strax före användning eftersom nålar som lagras i mer än en dag kan ackumulera skräp och bli igensatta under mikroinjektioner. Att återställa injicerade honor från mikroinjektionsplattan utan att skada dem kan åstadkommas med några olika metoder. En teknik är att flyta maskarna från injektionsdynan i en droppe BU och sedan använda HB101 på en maskplockning för att samla maskarna. Andra tekniker för återhämtning inkluderar att flyta maskarna i BU och samla dem med en pipettspets eller en liten pensel eller helt enkelt använda en maskplockning ensam för att flytta maskarna till en återhämtningsplatta.
Om ingen avkomma erhölls från de mikroinsprutade honorna tyder detta på att antingen de injicerade honorna skadades i mikroinjektionsprocessen eller att odlingsförhållandena efter injektionen var suboptimala. Det finns ett antal olika odlingsförhållanden efter injektion som kan provas. De småskaliga fekala kolkulturerna som beskrivs ovan stöder i allmänhet bättre masköverlevnad än NGM-plattor med HB101. Det kan dock vara svårt att följa överlevnaden av de injicerade maskarna och utvecklingen av F1-larverna på fekalkolplattor, och ägg är inte synliga på dessa plattor. En fördel med att odla maskar på NGM-plattor med HB101 istället för fekalkolplattor är att möjliggöra noggrann observation av äggläggning och larvutveckling, vilket kan vara användbart för felsökning. V12-plattor med HB101 kan också användas för att ökaöverlevnaden 24. Slutligen kan en kemotaxiplatta12 med en enda råttfekal pellet användas för S. ratti-odling efter injektion. Hanarna och injicerade honor överförs direkt till råttans fekala pellet. På 5-7 dagar samlas maskar från agar och avföring med användning av en Baermann-apparat, som beskrivits ovan.
För att erhålla Strongyloides vuxna för mikroinjektion kan nyberedda fekalkolplattor inkuberas vid 25 °C i 24 timmar eller 20 °C i 48 timmar. Men om honorna är för unga kanske de inte överlever mikroinjektionsprocessen. Vuxna som samlats in från fekalkolplattor som har inkuberats vid 20 °C i ~48 timmar är mer benägna att tolerera mikroinjektionsprocessen. Men eftersom dessa vuxna är äldre än vuxna erhållna från en 24-timmars inkubation vid 25 ° C, är de inte lika fecund och kan ha en lägre transformationshastighet. Nybörjare kanske föredrar att börja med äldre vuxna och sedan byta till lite yngre vuxna när färdigheterna förbättras.
Liksom C. elegans kan Strongyloides-arter uttrycka transgener från extrakromosomala arrayer och genomintegrerade konstruktioner i F1-generationen. Till skillnad från C. elegans kommer Strongyloides-arter endast att uttrycka genomintegrerade transgener i F2 och efterföljande generationer även om de extrakromosomala arrayerna fortfarande kan detekteras av PCR13. F 1-transgena larver som uttrycker extrakromosomala arrays kan användas för experiment som inte kräver genomintegration eller ett stort antal transgena maskar. Genomintegration kan krävas för experiment som kräver märkning av endogena gener eller testning av ett stort antal maskar i populationsbaserade analyser. Det finns två metoder för genomintegration av transgener i Strongyloides: piggyBac transposonmedierad integration17 och CRISPR/Cas9-medierad integration9. piggyBac transposon-medierad integration använder piggyBac-transposaset för att rikta last till TTAA-platser i genomet26. Eftersom TTAA-motivet är ganska vanligt i det AT-rika genomet hos Strongyloides-arter, är integrationen ofta på mer än en plats i genomet. Däremot kan CRISPR/Cas9-medierad integration användas för att integrera transgener vid ett specifikt mållokus9.
CRISPR/Cas9-systemet kan också användas för att generera riktade genknackningar 9,27. På grund av STRONGyloides-genomets AT-rikedom är det en utmaning att hitta användbara Cas9-målplatser som innehåller den optimala 5'-N18GGNGG-3'-sekvensen för nematoder28. Ofta finns det bara en eller två platser i en gen för inriktning. Den föredragna metoden innefattar integration av en reparationsmall som innehåller en transgen med en fluorescerande markör genom homologistyrd reparation i det genomiska locuset, vilket resulterar i fullständig störning av genen. Potentiella knockouts kan identifieras genom uttryck av transgenen 9,14,15,29. Transgenuttryck ensamt är dock inte ett tecken på genotyp eftersom uttryck från arrayer kontra integrerade transgener ofta inte kan skiljas åt. Således kräver F 1-transgena larver post-hoc genotypning för att identifiera homozygota knockouts9. I avsaknad av en reparationsmall sker mutagenes av mållokusen vid hög frekvens men kan resultera i stora raderingar9.
Även om det är relativt enkelt att generera transgena eller mutanta F1-larver i S. stercoralis, är det extremt svårt att generera stabila linjer på grund av behovet av värdpassage. I laboratoriet är den mongoliska gerbilen en tillåtande värd för S. stercoralis men kräver en hög dos maskar för att upprätta en infektion som kan producera tillräckligt medF2-larver för att etablera linjen30. Endast cirka 6% av infektionslarverna blir parasitiska honor30. Dessutom, om de transgena larverna har arrayuttryck utan genomintegration, kommer de inte att producera den transgenuttryckande avkomma som krävs för att infektera en andra gerbilvärd. För att öka chanserna för att tillräckligt många genomintegrerade larver blir reproduktiva parasitiska vuxna rekommenderas minst 400-500 transgena larver i den initiala inokulatet. Det kan vara möjligt att minska antalet larver som krävs för att etablera en patentinfektion genom att behandla gerbilerna med prednison30. Ändå är det troligt att det är svårt att samla tillräckligt med integrerade transgena eller mutanta maskar för att framgångsrikt etablera en stabil linje av S. stercoralis. Det är emellertid vanligtvis möjligt att samla tillräckligt många transgena S. stercoralis F1-larver för enmaskanalyser14,15.
Strongyloides ratti har den tydliga fördelen av den större möjligheten att generera stabila transgena eller knockoutlinjer17,31. S. ratti fritt levande vuxna honor är mindre toleranta mot mikroinjektionsprocessen än S. stercoralis fritt levande vuxna honor; S. ratti-honor producerar i allmänhet färre totala larver än S. stercoralis-honor, och omvandlingshastigheten är också lägre31. Men endast ett fåtal transgena eller knockout F1 larver krävs för att upprätta en stabil linje av S. ratti. Eftersom S. ratti är en naturlig parasit hos råttor är endast ett fåtal S. ratti-infektiösa larver tillräckliga för att fastställa en patentinfektion32. Således är det i allmänhet möjligt att samla tillräckligt många transgena eller mutanta larver för att upprätta en stabil linje. Eftersom Strongyloides-arter inte kommer att uttrycka extrakromosomala arrays förbi F1-generationen, kan endast genomintegrerade F1-larver producera en stabil transgen linje13. Det är i allmänhet omöjligt att identifiera maskar med integrerade transgener före genotypning, så protokollet är att samla alla transgena F1-larver och injicera dem i en råtta. En liten andel av dessa larver kommer att ha den önskade integrationshändelsen; dessa larver kommer att ligga till grund för stalllinjen. Eftersom piggyBac-metoden ofta resulterar i mer än en integrationshändelse i en enskild mask, kan nästan 100% överföring av transgenen uppnås efter några omgångar av förbipasserande transgena larver genom en råtta17.
Sammanfattningsvis kan tekniken som beskrivs här användas för att generera transgena eller knockout S. stercoralis och S. ratti. Detta möjliggör ett brett spektrum av potentiella experiment, inklusive men inte begränsat till det cellspecifika uttrycket av transgener, generering av mutanter och endogen märkning av proteiner för att bestämma rumsliga och temporala funktioner 14,15,29,33,34,35. På lång sikt kan kunskap från användning av transgena Strongyloides användas för att utveckla nya strategier för att bekämpa mänskliga infektioner med S. stercoralis och andra intestinala parasitiska nematoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
pPV540 och pPV402 var vänliga gåvor från Dr James Lok vid University of Pennsylvania. Vi tackar Astra Bryant för hjälpsamma kommentarer om manuskriptet. Detta arbete finansierades av en Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, en Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award och National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
