Summary
Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een krachtig hulpmiddel in translationeel kankeronderzoek, dat zowel de genetische als fenotypische heterogeniteit van de ziekte en de reactie op gepersonaliseerde antikankertherapieën weerspiegelt. Hier wordt een geconsolideerd protocol voor het genereren van pdo's voor primaire blaaskanker bij de mens ter voorbereiding op de evaluatie van fenotypische analyses en medicijnresponsen gedetailleerd beschreven.
Abstract
De huidige in vitro therapeutische testplatforms zijn niet relevant voor tumorpathofysiologie, waarbij meestal gebruik wordt gemaakt van kankercellijnen die zijn vastgesteld als tweedimensionale (2D) culturen op weefselkweekplastic. Er is een kritieke behoefte aan meer representatieve modellen van tumorcomplexiteit die de therapeutische respons en gevoeligheid nauwkeurig kunnen voorspellen. De ontwikkeling van driedimensionale (3D) ex vivo cultuur van patiënt-afgeleide organoïden (BOB's), afgeleid van verse tumorweefsels, heeft tot doel deze tekortkomingen aan te pakken. Organoïde culturen kunnen worden gebruikt als tumorsurrogaten parallel aan routinematig klinisch management om therapeutische beslissingen te informeren door potentiële effectieve interventies te identificeren en therapieën aan te geven die nutteloos kunnen zijn. Hier is deze procedure bedoeld om strategieën en een gedetailleerd stapsgewijs protocol te beschrijven om blaaskanker-BOB's vast te stellen uit vers, levensvatbaar klinisch weefsel. Onze gevestigde, geoptimaliseerde protocollen zijn praktisch om 3D-culturen op te zetten voor experimenten met beperkt en divers uitgangsmateriaal rechtstreeks van patiënten of patiënt-afgeleid xenograft (PDX) tumormateriaal. Deze procedure kan ook worden gebruikt door de meeste laboratoria die zijn uitgerust met standaard weefselkweekapparatuur. De organoïden die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt als ex vivo surrogaten om zowel de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan urologische kankerpathologie als om behandelingen te evalueren om klinisch management te informeren.
Introduction
Blaaskanker is de meest voorkomende urinewegkanker en de tiende meest voorkomende menselijke maligniteit wereldwijd1. Het omvat een genetisch divers en fenotypisch complex spectrum van ziekte2. Urotheliale niet-spierinvasieve vormen van blaaskanker (NMIBC) zijn de meest voorkomende blaaskankerdiagnoses (70% -80%), en deze kankers vertonen aanzienlijke biologische heterogeniteit en variabele klinische uitkomsten 2,3,4. Patiënten met NMIBC ervaren doorgaans een hoog risico op recidief van de ziekte (50-70%) en een derde van de kankers zal zich ontwikkelen en zich ontwikkelen tot aanzienlijk agressievere spierinvasieve blaaskanker (MIBC)2. Hoewel de 5-jaarsoverleving voor NMIBC hoog is (>90%), moeten deze patiënten langdurig klinisch beheer ondergaan5. Aan de andere kant wordt lokaal geavanceerde (niet-reseceerbare) of gemetastaseerde MIBC over het algemeen als ongeneeslijk beschouwd6. Bijgevolg heeft blaaskanker een van de hoogste levenslange behandelingskosten binnen de kankerzorg en is het een aanzienlijke last voor zowel het individu als het gezondheidszorgsysteem 3,7. De onderliggende genetische afwijkingen bij gevorderde ziekten maken het therapeutisch beheer van blaaskanker tot een klinische uitdaging, en de therapeutische opties voor invasieve urotheliale tumoren zijn pas onlangs verbeterd sinds de goedkeuring van immunotherapieën voor zowel geavanceerde als hoogrisico NMIBC 8,9. Momenteel wordt de klinische besluitvorming geleid door conventionele klinische en histopathologische kenmerken, ondanks individuele blaaskankertumoren die grote verschillen vertonen in ziekte-agressiviteit en respons op therapie10. Er is dringend behoefte aan een versnelling van het onderzoek naar klinisch bruikbare modellen om de voorspelling van de prognose van individuele patiënten en de identificatie van effectieve behandelingen te verbeteren.
Driedimensionale (3D) organoïden vertonen een groot potentieel als tumormodellen vanwege hun vermogen om zichzelf te organiseren en de intrinsieke in vivo architectuur en het farmacogenomische profiel van de oorspronkelijke tumor samen te vatten, en hun vermogen om de inheemse cellulaire functionaliteit van het oorspronkelijke weefsel waaruit ze zijn afgeleid te spiegelen 11,12,13 . Hoewel gevestigde blaaskankercellijnen direct beschikbaar, relatief kosteneffectief, schaalbaar en eenvoudig te manipuleren zijn, slagen de in vitro cellijnen er grotendeels niet in om het spectrum van diverse genetische en epigenetische veranderingen na te bootsen die zijn waargenomen bij klinische blaaskankers12,14 en werden ze allemaal vastgesteld en onderhouden onder 2D, adherente kweekomstandigheden. Bovendien herbergen cellijnen afgeleid van primaire en gemetastaseerde blaastumoren significante genetische divergentie van het oorspronkelijke tumormateriaal. 8,15.
Een alternatieve benadering is het gebruik van genetisch gemanipuleerde en kankerverwekkende muismodellen. Hoewel deze modellen enkele van de natuurlijke oncogene cascades die betrokken zijn bij menselijke neoplasie samenvatten (beoordeeld in refs 16,17,18), missen ze tumorheterogeniteit, zijn ze duur, vertegenwoordigen ze slecht invasieve en gemetastaseerde blaaskanker en zijn ze niet levensvatbaar voor snelle drugstests omdat tumoren vele maanden kunnen duren om zich te ontwikkelen14,19 . Patiënt-afgeleide modellen van kanker (inclusief organoïden, voorwaardelijk geherprogrammeerde primaire celcultuur en xenografts) bieden onschatbare mogelijkheden om de effecten van medicamenteuze behandeling vóór klinische behandeling te begrijpen20. Desondanks gebruiken maar weinig groepen routinematig deze patiënt-proximale modellen vanwege de beperkte toegang tot vers primair patiëntweefsel en de uitgebreide optimalisatie die nodig is om reproduceerbaar patiënt-afgeleide organoïde (PDO) kweekomstandigheden te genereren. In een in vivo setting kunnen oncogene cellen interageren en communiceren met verschillende samenstellingen van de omringende bestanddelen, waaronder stromale cellen, weefselinfiltrerende immuuncellen en matrix12. Evenzo kan voor BOB's die in een 3D-indeling worden gekweekt, cellulaire / matrixcomplexiteit worden aangepast om andere relevante componenten op te nemen. BOB's kunnen snel worden gegenereerd en kunnen vaak uitgebreid worden doorgegeven of gecryopreserveerd voor later gebruik, ondanks een eindige levensduurvan 21,22,23. Farmacodynamiek (d.w.z. respons op een geneesmiddel) kan worden geëvalueerd met behulp van meerdere uitlezingen, waaronder organoïde levensvatbaarheid en morfologie, en karakterisering van immunohistochemische doelen of transcriptionele veranderingen.
Hier worden de procedures voor de vaststelling van blaaskankerorganoïden uit patiëntmateriaal verzameld uit transurethrale resectie van blaastumor (TURBT) of chirurgische verwijdering van de blaas (radicale cystectomie) beschreven. De methode om BOB's te genereren wordt geïllustreerd met behulp van direct beschikbare natte laboratoriummaterialen en -gereedschappen. Eindpunten omvatten veranderingen in celmorfologische kenmerken en levensvatbaarheid. Deze werden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie, in vitro levensvatbaarheid (metabole en celmembraanintegriteit) assays en histopathologische analyse. Figuur 1 toont de workflow voor het vaststellen van PDO's voor blaaskanker bij de mens uit klinisch materiaal verkregen tijdens electieve chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patiënten hebben ingestemd met deze studie na hun opname onder het Urologieteam in het Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australië. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en binnen ethische en institutionele richtlijnen (ethieknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
OPMERKING: Als geschiktheidscriteria waren patiënten ≥ 18 jaar oud met kanker en in staat om te begrijpen en toestemming te geven. Degenen die niet in staat waren om geïnformeerde toestemming te geven, werden uitgesloten. Degenen met een andere primaire taal dan het Engels werden uitgesloten omdat het ter beschikking stellen van tolken niet mogelijk was vanwege logistieke en budgettaire overwegingen. Ook uitgesloten waren patiënten van wie de tumoren niet toegankelijk waren voor biopsie of waarschijnlijk niet in voldoende hoeveelheid beschikbaar waren na routinematige pathologie.
1. Voorbereiding van organoïde medium
OPMERKING: Humane blaaskanker organoïde medium vereist groeifactoren die helpen bij de overleving, groei en continue expansie van organoïden afgeleid van gedissocieerd klinisch materiaal (tabel 1). Voor volledige details van elk supplement dat in deze procedure wordt gebruikt, raadpleegt u de tabel met materialen.
- Ontdooi bevroren ingrediënten op ijs of in de koelkast bij 2-8 °C. Vermijd herhaalde vries-/dooicycli en werk met bevroren aliquots (bewaard bij -20 °C).
- Basaal medium: Bereid basaal medium door geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (adDMEM/F12) aan te vullen met HEPES (10 mM) en glutamine (2 mM). Dit wordt ook gebruikt als transportmedium en tijdens organoïde wasstappen.
OPMERKING: Geavanceerde DMEM / F-12 wordt gebruikt als het basale medium om te helpen bij de expansie van organoïden in de aanwezigheid van beperkt serum; het vereist echter suppletie met HEPES en L-glutamine. - Centrifugeer kort fibroblastgroeifactor 10 (FGF-10), fibroblastgroeifactor 2 (FGF-2), epitheliale groeifactor (EGF), SB202190, prostaglandine E2 (PGE2) en A 83-01 voordat u ze opent om ervoor te zorgen dat componenten zich aan de onderkant van de injectieflacon bevinden.
- Compleet organoïde medium: Vul basaal medium aan met humaan noggin- en R-spondin 1-geconditioneerde media in een eindconcentratie van 5% v/v, humaan EGF (50 ng/ml), humaan FGF-2 (5 ng/ml), humaan FGF-10 (20 ng/ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamide (10 mM), N-acetylcysteïne (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) en een breedspectrumantibiotische vorming bij de door de fabrikant aangegeven concentratie.
- Bewaar organoïde media bij 4 °C in het donker en gebruik het binnen 2 weken (maximaal 1 maand). Niet in de vriezer bewaren. Vermijd langdurige blootstelling aan lichtbronnen.
OPMERKING: Het organoïde medium wordt serumvrij bereid; serum en penicilline/streptomycine kunnen echter indien nodig van gebruiker tot gebruiker worden aangevuld.
2. Een dag vóór de procedure van punt 3
- Dooi groeifactor verminderd keldermembraan (BME; zie Tabel van materialen) gedurende ten minste 12 uur voor gebruik in een koelkast of koude ruimte van 4 °C. Doseer BME indien nodig in aliquots van 1 ml in een polypropyleen buis voor eenmalig gebruik van 1,5 ml om vries-dooicycli te voorkomen.
- Plaats gefilterde pipetpunten in een koelkast of koelruimte van 4 °C.
OPMERKING: Deze sectie verwijst naar pipetpunten die zullen worden gebruikt bij het hanteren van BME om voortijdige polymerisatie te voorkomen en de coating van BME op het oppervlak van de tips te verminderen. - Steriliseer alle chirurgische apparatuur die nodig is voor de procedure.
3. Generatie van blaastumor organoïden
OPMERKING: Dit is een eerste stap voor BOB-vestiging van primaire patiënttumoren. Deze procedure is aangepast voor blaaskankerweefsels op basis van methoden die zijn vastgesteld door Gao et al.24.
- Gebruik een klasse II biohazard kap om het monster voor te bereiden. Haal droog en nat ijs op en druk het verwerkingsblad van patiëntmonsters af (aanvullend dossier).
- Roep onderzoekspersoneel naar de operatiekamer wanneer de chirurgische resectie bijna voltooid is.
OPMERKING: Bevestig dat de patiënt voldoet aan de geschiktheidscriteria en het toestemmingsformulier voor de deelnemer heeft ondertekend. Weefsel wordt alleen voor onderzoek verstrekt als het overtollig is aan de vereisten voor klinische histopathologische beoordeling. - Verzamel een vers macroscopisch levensvatbaar tumormonster van een operatie. Zorg ervoor dat het monster tijdens de doorvoer wordt ondergedompeld in transportmedium (1x adDMEM/F12 of 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS)) in een steriele conische buis van 50 ml of een pot met urinemonsters.
OPMERKING: In sommige klinische centra moet weefsel mogelijk naar een pathologielaboratorium worden vervoerd om te worden toegewezen voor onderzoek. Onder deze omstandigheden wordt aanbevolen om antibiotica en antimycotica aan het transportmedium toe te voegen. Weefsel kan tot 24 uur na de operatie bij 4 °C in basaal medium worden opgeslagen en nog steeds levensvatbare organoïde culturen genereren. - Noteer monsterdetails, inclusief weefselgewicht (g of mg), monsterbeschrijving en details met betrekking tot bloed- en urinemonsters op het patiëntmonsterverwerkingsblad (aanvullend dossier).
- Verwijder het transportmedium voorzichtig en vervang het door 10 ml basale media. Laat het tumorweefsel bezinken door de zwaartekracht.
OPMERKING: Transportmedium wordt beschouwd als klinisch afval en moet worden verzameld in een op de juiste manier geëtiketteerde afvalcontainer in een geschikte hoeveelheid decontaminatieoplossing. Zodra de vloeistof chemisch is ontsmet, kan deze worden verwijderd volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval. - Verwijder het tumorweefsel met een tang en plaats het in een steriele petrischaal van 90 mm (figuur 2A). Noteer het gewicht van het weefsel in mg of g op het verwerkingsblad van het klinische monster en het dissectieraster (figuur 2B).
- Verwijder niet-kankerachtig weefsel (inclusief vetweefsel) en macroscopisch zichtbare necrotische gebieden met behulp van een steriele tang en wegwerp scalpelmes gemonteerd op scalpelhandvat (figuur 2C). Was tumorstukken 1-2 keer met koude 1x DPBS. Verzamel de stukjes tumor en breng ze over naar een nieuwe steriele petrischaal van 90 mm.
OPMERKING: Aangezien scalpelmesjes scherp zijn, moet u voorzichtig zijn bij het handmatig snijden. Tumor-aangrenzend vetweefsel kan worden geïdentificeerd door duidelijk zachte, gelatineuze, bleke gebieden direct grenzend aan de visuele tumoromtrek. Macroscopisch vetweefsel en focale donkere gebieden die gebieden van necrose vertegenwoordigen, vereisen persoonlijk oordeel bij het ontleden van een excisiebaire blaastumorbiopsie. - Maak een foto, teken een diagram van weefsel en plan weefseldissectie op een klinisch verwerkingsraster (figuur 2B en figuur 2C).
OPMERKING: Het is belangrijk om een visueel verslag en een ruwe schets bij te houden van de individuele macroscopische tumorkenmerken en dissectie voor elk specifiek geval. - Ontleed tumorweefselstukken en wijs toe voor histopathologische (figuur 2D) en moleculaire analyses (figuur 2E).
- Voor histologische analyses: Plaats ongeveer 50 mg tumorweefsel in een gelabelde plastic histologiecassette (figuur 2D). Dompel histologiecassette onder in een container met 5x tot 10x volume van 10% neutraal gebufferd formaline (NBF). Incubeer 's nachts bij RT.
- Verwijder 10% NBF en vervang de volgende dag door 70% (w/w) ethanol voor opslag bij 4 °C totdat weefsel kan worden verwerkt met behulp van een routinematig weefselverwerkingsprotocol
- Voor moleculaire analyses: Knip ten minste één 1-3 mm3 tumorstuk in een RNase/DNase-vrij cryoviaal van 1,5 ml met vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C (figuur 2E).
- Doseer 5 ml organoïde medium (tabel 1) in de petrischaal van 90 mm met het resterende tumorstuk of de resterende tumorstuk(en).
- Hak weefsel mechanisch zo fijn mogelijk (0,5-1 mm3 stuks of kleiner) met een steriel #10 scalpelmesje.
OPMERKING: Grotere fragmenten of hele stukken weefsel (>3 mm3) zullen aanzienlijk langer nodig hebben om te verteren en zullen de levensvatbaarheid van het monster verminderen. Laat de bovenstaande stap weg als het weefsel is uitgesplitst en fragmenten klein genoeg zijn om te pipetteren met een serologische pipetpunt van 5 ml. - Breng fijngehakt weefsel over naar een conische buis van 50 ml en voeg 4 ml organoïde medium, 1 ml 10x collagenase / hyaluronidase en 0,1 mg / ml desoxyribonuclease 1 (DNase 1) toe om celklontering te voorkomen.
OPMERKING: Enzymoplossing moet elke keer vers worden bereid. Verhoog het volume van het medium tot ongeveer 10x de zichtbare hoeveelheid van de tumorfragmenten voor grote monsters. - Incubeer het gehakte tumorweefsel en de enzymoplossing gedurende 1-2 uur op een orbitale shaker of rotator (150 rpm) in een incubator (37 °C, 5% CO2) om fragmenten in een celsuspensie te dissociëren en collageen af te breken. Dit kan worden gecontroleerd met histologische analyse (figuur 3A).
OPMERKING: Als de hoeveelheid weefsel groot is of als er na 1-1,5 uur geen duidelijke dissociatie wordt waargenomen, verhoog dan de incubatietijd en controleer het niveau van dissociatie elke 30 minuten. De timing voor deze stap is afhankelijk van de steekproef en moet elke keer empirisch worden bepaald. Een merkbaar duidelijkere oplossing met weefselfragmenten die niet voor het oog te onderscheiden zijn (of zeer weinig fragmenten) duidt op een succesvolle spijsvertering. - Beëindig de vertering met de toevoeging van 2x volume (20 ml) basaal medium aan het monster.
- Centrifugeer het monster bij 261 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT), aspirateer en gooi het supernatant weg.
- Om lyse contaminerende rode bloedcellen (RBC's) te lyseren, resuspendeert u de pellet verkregen uit de bovenstaande stap in 5 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) buffer. Incubeer de buis bij RT gedurende 3 minuten of totdat de volledige lysis van de RBC's is gezien (suspensie wordt duidelijk).
OPMERKING: Als RBC's niet worden waargenomen als een kleine rode klomp in de pellet, kan deze stap worden weggelaten. - Voeg 20 ml van het basale medium toe aan de buis. Centrifugeer de buis bij 261 x g gedurende 5 minuten bij RT en zuig het supernatant op.
- Plaats bij deze stap een aliquot van 10 ml van 2x en 1x organoïde medium in een waterbad van 37 °C om op te warmen.
- Filtreer het monster door een voorvochtige omkeerbare zeef van 100 μm in een nieuwe buis van 50 ml om groot onoplosbaar materiaal te verwijderen.
OPMERKING: Groot onverteerd materiaal (>100 μm) dat door het filter wordt verzameld, kan interessante cellen bevatten en kan worden gekweekt in een petrischaal van 90 mm of een 6-well celkweekplaat in organoïde medium om 2D-culturen af te leiden (figuur 1 (stap 5) en figuur 3B). - Filter het eluaat door een voorvochtige omkeerbare zeef van 37 μm om enkele cellen en kleine clusters te verzamelen voor isolatie van eencellige en immuuncellen (buis 37-1; Figuur 1 (stap 6) en figuur 3B).
OPMERKING: De opbrengst van tumorcellen tijdens deze stap kan worden verhoogd door de gefilterde celsuspensie opnieuw door de zeef te laten gaan. - Draai de zeef van 37 μm om en gebruik 10 ml basale media om kleine en middelgrote clusters (37-100 μm) te verzamelen (buis 70-1; Figuur 3B).
- Vul elk van de nieuwe buizen van 50 ml (buizen 70-1 en 37-1) met DPBS aan tot 40 ml. Centrifugeer de suspensie bij 261 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspirateer en gooi het supernatant weg.
- Voeg 10 ml basale media toe aan buis 37-1 en tel de cellen met behulp van trypan blauwe uitsluitingskleurstof en een geautomatiseerde celteller (volgens de specificaties van de fabrikant). Bepaal het celnummer en de levensvatbaarheid van cellen.
- Centrifugeer de rest van het monster bij 261 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het medium op en vervang het door celbevriezingsoplossing of basale media die 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevatten.
- Plaats monsters in cryovialen van 1,5 ml en bewaar ze in een celbevriezingscontainer. Breng de container onmiddellijk over naar een vriezer van -80 °C voor een optimale koelsnelheid. Breng na nachtelijke vriesopslag bij -80 °C de cryovialen over in cryogene vloeistof- of luchtfaseopslag (-196 °C) voor langdurige opslag.
- Resuspend cellen uit buis 70-1 met 500 μL voorverwarmd 2x organoïde medium.
OPMERKING: De zaaidichtheid moet hoog zijn voor een succesvolle organoïde vermeerdering. Het volume van het organoïde medium en vervolgens BME moet empirisch worden gewijzigd op basis van het aantal cellen dat uit de filtratiestap wordt geïsoleerd. Deze stap biedt een relevant startpunt op basis van studies in ons laboratorium. - Voeg BME toe aan cellen (in een verhouding van 1:1 met 2x organoïde medium) met ijskoude P1000 steriele filterpipetpunten en meng voorzichtig om cellen te laten zweven. Pipetteer snel en voorzichtig 100 μL gereconstitueerde cellen / BME-mengsel naar putten van een ultralaag bevestigde platte bodemplaat met 96 putten. Plaats de 96-well plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 20-30 minuten om te stollen.
- Voeg 1:2 verhouding van 1x organoïde medium toe bovenop BME-celsuspensie, afhankelijk van het empirisch beoordeelde volume. Voeg in het relevante uitgangspunt 50 μL 1x organoïde mediummedia toe bovenop 100 μL gereconstitueerde cellen/BME-mengsel.
- Plaats de 96-well plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 20 minuten om in evenwicht te brengen.
- Haal de celkweekplaat uit de couveuse en monteer deze op een monsterhouder op het podium van een microscoop. Beoordeel organoïden visueel onder fasecontrast of brightfield-instellingen.
OPMERKING: Afbeeldingen kunnen het beste worden verkregen door een omgekeerde fasecontrastmicroscoop die is uitgerust met differentiële interferentie (DIC) optica, digitale camera en bijbehorende software om de vorming van bolvormige BOB's te observeren ter voorbereiding op eindpuntanalyse.- Als verschillende clusters zichtbaar zijn, plaatst u de celkweekplaat in een elektronisch verwarmde microscoopkamer op het podium (37 °C, 5% CO2) voor live-cell imaging gedurende de eerste 24-72 uur.
- Zorg ervoor dat de flexibele verwarmde kraag aan de lens is bevestigd om thermische drift te verminderen en dat de luchtbevochtiger is gevuld met dH2O.
- Voer de eerste beelden uit met een 4x of 10x objectieflens (N.A. 0.30, B.D. 15.2 mm). Time-lapse elke 5-10 minuten op de fasecontrastinstelling.
- Controleer op de succesvolle isolatie zoals gekenmerkt door het verschijnen van >10 zelforganiserende organoïden per put na een periode van 24-72 uur.
- Laat culturen tot twee weken doorgaan als het aantal organoïden laag is (figuur 3C).
- Vul het medium elke 2-3 dagen aan met 50 μL voorverwarmd organoïde medium om uitgeputte groeifactoren en het totale volume aan te vullen.
- Verkrijg afbeeldingen (zoals beschreven in stap 3.30) op dag 1, 2 en 3 (time-lapse-series) en op dag 5, 7 en 10 voordat u passagt (indien van toepassing).
OPMERKING: Organoïden (waargenomen als over het algemeen ronde structuren waar je de randen van individuele cellen niet kunt zien) worden meestal 7-10 dagen na de installatie gepasseerd, afhankelijk van het succes van de isolatie. Vóór of na het passeren kunnen organoïden gedurende maximaal 6 dagen worden behandeld met cytotoxische of therapeutische middelen en de geneesmiddelrespons worden gemeten met behulp van cel levensvatbaarheid en cytotoxiciteitstests. Als alternatief kunnen organoïden worden opgehaald uit BME (met behulp van 1 mg / ml dispase) en gecryopreserveerd (biobanked), voorbereid voor moleculair testen, of ingebed en histologisch beoordeeld (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-organoïden werden met succes vastgesteld uit menselijke blaaskankerpatiënt TURBT en cystectomieweefsels. Kortom, deze techniek benadrukt een snelle vorming van 3D-meercellige structuren die zowel levensvatbaar als geschikt zijn voor andere eindpuntanalyses zoals histologische evaluatie, moleculaire karakterisering (door immunohistochemie of kwantitatieve real-time PCR) en screening van geneesmiddelen. Tijdens de procedure (figuur 1) kunnen de verschillende eluaten tijdens onze filtratiefasen (figuur 1, stappen 1-6) worden gebruikt om afzonderlijke cellen te cryopreserveren voor isolatie van tumorinfiltrerende immuuncellen (TILs) en generatie van een eencellige biobank. De procedure maakt het mogelijk om meerdere aspecten van een heterogene primaire tumor op de juiste manier te biobankeren en op een manier die kan worden gevolgd bij patiënten (figuur 2A, B), inclusief histologie (figuur 2C, D) en vers ingevroren monsters (figuur 2E).
Een 2 uur durende vertering met in de handel verkrijgbare collagenase/hyaluronidase en DNase 1 zorgt voor voldoende vertering van 0,5-1 mm3 stuks van het complexere cystectomiebiopsieweefsel, inclusief de neoplastische cellen in de lamina propria en spierlagen van de blaas (figuur 3A). Grotere post-digestiefragmenten (>100 micron) zijn geschikt gebleken voor kweek in standaard weefselkweekplaten van elke grootte voor de isolatie van nieuwe 2D-culturen (figuur 3B). Uitgebreide moleculaire karakterisering is echter vereist om de kankeroorsprong van dergelijke cellijnen te valideren. Organoïden die met succes met dit protocol worden gegenereerd, ondergaan processen van dynamische zelfassemblage, inclusief fasen van aggregatie, verdichting en uiteindelijke vorming, waarbij ze zich vormen tot strakke cellulaire structuren (figuur 3C) die kunnen worden beoordeeld op respons op standaardzorgtherapieën. Figuur 3C benadrukt de efficiënte zelfassemblage-eigenschappen van de organoïden. Histologisch vatten deze structuren de oorspronkelijke tumor van de patiënt samen (figuur 4). Organoïden die in deze procedure worden gegenereerd, zijn geschikt voor een groot aantal doeleinden, waaronder verdere karakterisering, biobanking en testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen (figuur 5).
Figuur 1: Schematische weergave van organoïde weefselkweek van de verzameling tumormonsters van chirurgie tot eindpuntanalyses. URN, eenheidsrecordnummer; TIL, Tumor-infiltrerende lymfocyt. (1) Weefsel wordt mechanisch fijngehakt in een petrischaaltje van 90 mm met een steriel scalpelmesje (0,5-1 mm3 stuks). (2) Tumorstukken worden geresuspendeerd in een enzymatisch dissociatiemedium bestaande uit het organoïde medium, collagenase/hyaluronidase en DNase 1. (3) Gehakt tumorweefsel en enzymoplossing worden gedurende 1-2 uur geïncubeerd op een rotatorincubator (150 rpm, 37 °C, 5% CO2) en vervolgens gepelletiseerd (4) om fragmenten te dissociëren in een fijnere celsuspensie. Het monster ondergaat filtratie door voorvochtige omkeerbare (5) 100 μm en (6) 37 μm zeven in nieuwe buizen van 50 ml om groot onoplosbaar materiaal te verwijderen en clusters van 37-100 μm te isoleren. Na (7) centrifugering van de fractie geïsoleerd uit de achterkant van de 37 μm zeef, worden de celclusters gesuspendeerd in (8) BME en organoïde media vóór (9) live-cell imaging. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Steriele behandeling van tumorweefsel voor organoïde-vestiging. (A) Na excisie en transport naar het laboratorium wordt het monster in een steriel petrischaaltje geplaatst, gewogen en vervolgens ontleed. (B) Een monsterdissectieraster wordt gebruikt om het monster voor verschillende processen te markeren. Een voorbeeld van dissectie wordt getoond in (C) waar monsters zoveel mogelijk uit de tumorrand worden genomen om gebieden van centrale necrose te vermijden en geannoteerd (inzet) voordat (D) het weefsel wordt gegradeerd voorafgaand aan weefselfixatie. Schaalbalk: 6 mm. Inzetschaalbalk: 4 mm. (E) Kleine verse fragmenten worden genomen voor latere bevriezing en biobanking. Schaalbalk: 5 mm. Elementen van dit beeld zijn gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Enzymatische afleiding en dynamische assemblage van blaastumororganoïden. (A) Representatieve foto's van hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd ouderlijk blaaskankerweefsel (pathologie beoordeeld als T3bN0) bij onmiddellijke fixatie (links) en 2 uur na de spijsvertering met 1x collagenase / hyaluronidase (rechts). Schaalbalk: 500 μm. Inzetschaalbalk: 50 μm. (B) Representatieve beelden van de isolaties >100 μm, 37-1 en 70-1 (dag 2). Schaalbalken worden in de afbeelding aangegeven. (C) Representatieve beelden worden getoond voor blaaskanker organoïde isolatie gedurende 48 uur en dag 7 organoïde H & E-kleuring. Schaalbalk: 50 μm. Schaalbalk voor de afbeelding in de inzet: 20 μm. DIC: differentieel interferentiecontrast. Elementen van deze afbeelding zijn gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Van blaaskanker afgeleide organoïde culturen handhaven de histologische architectuur van ouderlijke tumoren. Representatief H&E-beeld van laaggradige blaaskanker (Ta) en overeenkomstig helderveldbeeld van organoïde op dag 7 van de cultuur. Het uiterst rechtse paneel toont de bijbehorende H & E-kleuring van de organoïde van dag 7. Schaalbalken zijn aangegeven in de figuur. LG: laaggradig, BC: blaaskanker, H&E: haematoxyline en eosine, en DIC: differentieel interferentiecontrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Downstream toepassingen met van blaaskanker patiënten afgeleide organoïden. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Toevoeging | Laatste Conc. | Voorraad Conc. | Oplosmiddel | |
| Basale media | Glutamax | 2 meter | 1 miljoen | NaCl |
| Hepes | 10 meter | 1 miljoen | NaCl/NaHPO4 gebufferde oplossing | |
| Supplementen voor complete media | R-spondin 1 geconditioneerde media | 5% v/v | Geconditioneerde media | Geavanceerde DMEM/F-12 |
| Noggin geconditioneerde media | 5% v/v | Geconditioneerde media | Geavanceerde DMEM/F-12 | |
| EFG | 50 ng/ml | 0,5 mg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/ml | 50 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| Nicotinamide | 10 meter | 1 miljoen | 1 g in 8,2 ml ddH20 | |
| N-acetyl-L-cysteïne | 1,25 mM | 500 meter | 40 ml ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 meter | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 meter | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100m | DDH20 | |
| B-27 additief | 1x | 50x | ||
| Prostaglandine E2 | 1 μM | 10 meter | DMSO | |
| Primocine | 100 μg/ml | 50mg/ml | ||
Tabel 1: Supplementen gebruikt voor basale en complete organoïde media
Aanvullend bestand: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel 3D-organoïdeprotocollen afgeleid van blaaskankerweefsel nog in de kinderschoenen staan, zijn ze een gebied van actief onderzoek en klinisch onderzoek. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven om met succes blaaskanker-BOB's vast te stellen die geschikt zijn voor zowel NMIBC- als MIBC-monsters. Deze workflow integreert parallel in ziekenhuisgebaseerde klinische onderzoeken en houdt rekening met de opbouw van biobankmonsters, inclusief histologische monsterverwerking en vers ingevroren weefselbankieren, wat een belangrijke overweging is voor klinische organoïde pijplijnen. Dit protocol bouwt voort op bestaande methoden en biedt een geconsolideerde methodologie om een pijplijn voor organoïde precisiegeneeskunde te bouwen.
Het huidige slagingspercentage van dit protocol is - net als andere - ongeveer 70%25. Verwacht wordt dat dit zal verbeteren naarmate isolatietechnieken en karakterisering van de micro-omgeving van blaaskankertumoren evolueren. Zoals verwacht beïnvloedt de kwaliteit van het eerste exemplaar het slagingspercentage en is het een belangrijke beperkende stap. Monsters verkregen van chemotherapie naïeve patiënten bieden het hoogste slagingspercentage, terwijl die van patiënten die neoadjuvante chemotherapie hebben gekregen een verminderd aantal levensvatbare cellen kunnen hebben26,27. Typisch, blaaskanker monsters (van zowel TURBT en cystectomieën) bieden een ruime hoeveelheid monsters met een hoge tumor cellulariteit. Dit maakt een robuuste generatie van organoïden mogelijk, variërend van 30-100 μm binnen een groeiperiode van 24-72 uur (gezien het feit dat er ongeveer <40 μm clusters worden vastgehouden in de filtratiestappen). Belangrijk is dat de heterogeniteit die wordt waargenomen in organoïdemonsters (d.w.z. cystische formaties en dichtere structuren) aangeeft dat dit protocol omstandigheden biedt die geschikt zijn om heterogene tumorcelpopulaties af te leiden.
Ons geoptimaliseerde protocol kan worden uitgevoerd op beperkt uitgangsmateriaal (zoals het geval is bij sommige electieve operaties, waaronder TURBT-procedures of monsters die zijn verkregen van patiënten in een klinische proef), waardoor meerdere analyses kunnen worden opgenomen om de waarde van het monster te maximaliseren. Dit protocol bevat methoden om stappen te beschrijven om 2D-cultuur te laten groeien uit externe tumorcellen van belang die zich kunnen bevinden in grote onoplosbare weefsels die tijdens de eerste filtratiestap zijn verwerkt. Net als andere onderzoeksgroepen die suggereren monsters binnen 24 uur na de operatie te verwerken28,29, wordt waargenomen dat weefselhypoxie die binnen dit tijdsbestek optreedt, het genereren van levensvatbare organoïden niet uitsluit. Optimalisatie is nodig om de dichtheid van cel (native clusters) seeding per put te bepalen. In onze ervaring kunnen overmatige aantallen clusters resulteren in een slechte groei van de culturen, terwijl culturen met een lage visuele dichtheid kunnen leiden tot celdood. Dit kan door de gebruiker empirisch worden bepaald in de context van hun volumes die indien nodig binnen een bereik kunnen worden verdund. Bovendien bevatten TURBT-monsters vaak verbrande randen als gevolg van het resectieproces, die zichtbaar zijn als prominente necrotische gebieden. Een cruciale stap is de zorgvuldige isolatie van macroscopisch tumorweefsel en daaropvolgende dissectie. Dit is van het grootste belang voor het afleiden van levensvatbare culturen en moet worden gecommuniceerd met het chirurgische team. In sommige gevallen kan dit een eerste beperking van de procedure zijn.
Een bijkomende beperking van de huidige techniek is de afwezigheid van de tumormicro-omgeving parallel aan de organoïden. Een noodzakelijke ontwikkeling zullen toekomstige co-kweeksystemen zijn om de cellulaire complexiteit te vergroten en andere componenten van de tumormicro-omgeving (d.w.z. stroma en immuuncellen) te leveren. Aangezien organoïden worden gedefinieerd als zelforganiserende structuren met het vermogen om hun groei zelf te bestendigen, zal verder werk nodig zijn om de discrete kankerstamcellen (zoals CD44 en CD49) op te helderen, wat kan zorgen voor verbeterde in vitro groeikenmerken 31,32,33. Het is van cruciaal belang om met zekerheid vast te stellen dat de BOB's afkomstig zijn van tumorweefsel, omdat de bijdrage van normale urotheelcellen in functionele en moleculaire analyses het onderzoek naar medicijnresistentie zal verstoren. Soms is de tumoroorsprong van de urotheelcellen in de BOB's duidelijk door het gebruik van gemetastaseerd weefsel of papillaire tumoren (zoals hier het geval is; zie figuur 4), maar wanneer het bronweefsel uit het blaasslijmvlies wordt verwijderd en dus marges van het goedaardige urotheel bevat, is het van cruciaal belang om te bevestigen dat de resulterende BOB's bestaan uit tumorcellen met behulp van moleculaire technieken. Immunohistochemische en genomische vergelijkingen zijn dus vereist tussen de gevestigde organoïden en de primaire tumor waaruit ze zijn afgeleid30.
Met betrekking tot het aantal en de grootteverdelingen van de organoïden per put, is het moeilijk om een uniforme platingdichtheid van 3D-organoïden te handhaven voor cytotoxiciteitsanalyse. Dit wordt enigszins verzacht door gedefinieerde bereiken te isoleren met behulp van de filters, maar het is nog steeds een beperking als kleine clusters en grotere organoïden in dezelfde put worden geïsoleerd. Grote deeltjessorteerders kunnen dit probleem verminderen, maar zijn niet op grote schaal beschikbaar in medische onderzoekslaboratoria. Niettemin zijn technieken die levensvatbaarheidssignalen voor en na de behandeling meten met succes gebruikt bij organoïden van blaaskanker34. Naarmate deze technologie vordert, zal dit onderzoekers in staat stellen een bibliotheek van blaaskanker-BOB's te ontwikkelen met verschillende genomische profielen en farmacodynamische reacties die kunnen worden onderzocht om nieuwe therapieën te onderzoeken. Bovendien maken de hierin beschreven monsterverzamelingsprocedure en dissociatiemethode gelijktijdige voorbereidingen mogelijk voor tumor ruimtelijke profilering, multiparametrische flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing. Alles bij elkaar zorgt dit voor een breed scala aan krachtige eindpunten die kunnen worden samengebracht om de tumorheterogeniteit van een patiënt en de toepasbaarheid van geneesmiddelen zoals immunotherapieën te onderzoeken.
Samenvattend beschrijven we een protocol om culturen van 3D-patiënt-afgeleide blaaskankerorganoïden vast te stellen en te evalueren bij de komst van precisiegeneeskunde-eindpunten. Het is belangrijk op te merken dat de stappen en opmerkingen die hier worden beschreven routinematige benaderingen zijn die worden gebruikt om BDO's voor blaaskanker in ons laboratorium te isoleren. Het kweekmedium dat in onze procedure werd gebruikt, werd oorspronkelijk beschreven voor prostaatkankercellen en is nu bewezen geschikt te zijn voor de kweek van blaaskanker. Belangrijk is dat dit protocol gecentraliseerd is, geschikt voor routinematig gebruik in laboratoria en breed toepasbaar is op urologische kankertypen. In combinatie met high fidelity moleculaire fenotypering en geneesmiddelresponseindpunten, zal deze techniek een nuttig hulpmiddel bieden om snel de precieze therapeutische behandeling van blaaskankerpatiënten te verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We erkennen de technische bijstand van het Translational Research Institute Histology core en Biological Resource Facility. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van een Princess Alexandra Research Foundation award (I.V., E.D.W.), en het Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Het Translational Research Institute krijgt steun van de Australische overheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
