Summary
रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में एक शक्तिशाली उपकरण हैं, जो रोग की आनुवंशिक और फेनोटाइपिक विषमता और व्यक्तिगत कैंसर विरोधी उपचारों की प्रतिक्रिया दोनों को दर्शाते हैं। यहां, फेनोटाइपिक विश्लेषण और दवा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन की तैयारी में मानव प्राथमिक मूत्राशय के कैंसर पीडीओ उत्पन्न करने के लिए एक समेकित प्रोटोकॉल विस्तृत है।
Abstract
वर्तमान इन विट्रो चिकित्सीय परीक्षण प्लेटफार्मों में ट्यूमर पैथोफिजियोलॉजी के लिए प्रासंगिकता की कमी है, आमतौर पर ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर दो आयामी (2 डी) संस्कृतियों के रूप में स्थापित कैंसर सेल लाइनों को नियोजित किया जाता है। ट्यूमर जटिलता के अधिक प्रतिनिधि मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो चिकित्सीय प्रतिक्रिया और संवेदनशीलता की सटीक भविष्यवाणी कर सकती है। ताजा ट्यूमर ऊतकों से व्युत्पन्न रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) के तीन आयामी (3 डी) पूर्व विवो संस्कृति के विकास का उद्देश्य इन कमियों को दूर करना है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग नियमित नैदानिक प्रबंधन के समानांतर ट्यूमर सरोगेट्स के रूप में किया जा सकता है ताकि संभावित प्रभावी हस्तक्षेपों की पहचान करके चिकित्सीय निर्णयों को सूचित किया जा सके और उन उपचारों को इंगित किया जा सके जो व्यर्थ हो सकते हैं। यहां, इस प्रक्रिया का उद्देश्य ताजा, व्यवहार्य नैदानिक ऊतक से मूत्राशय के कैंसर पीडीओ को स्थापित करने के लिए रणनीतियों और एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। हमारे अच्छी तरह से स्थापित, अनुकूलित प्रोटोकॉल रोगियों या रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) ट्यूमर सामग्री से सीधे सीमित और विविध शुरुआती सामग्री का उपयोग करके प्रयोगों के लिए 3 डी संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए व्यावहारिक हैं। इस प्रक्रिया को मानक ऊतक संस्कृति उपकरणों से सुसज्जित अधिकांश प्रयोगशालाओं द्वारा भी नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पूर्व विवो सरोगेट के रूप में किया जा सकता है ताकि यूरोलॉजिकल कैंसर पैथोलॉजी को रेखांकित करने वाले आणविक तंत्र दोनों को समझा जा सके और नैदानिक प्रबंधन को सूचित करने के लिए उपचार का मूल्यांकन किया जा सके।
Introduction
मूत्राशय का कैंसर सबसे प्रचलित मूत्र पथ का कैंसर है और दुनिया भर में दसवां सबसे आम मानव दुर्दमताहै। इसमें रोग 2 के आनुवंशिक रूप से विविध और फेनोटाइपिक रूप से जटिल स्पेक्ट्रम शामिलहैं। मूत्राशय के कैंसर (NMIBC) के यूरोथेलियल गैर-मांसपेशी-आक्रामक रूप सबसे आम मूत्राशय के कैंसर का निदान (70% -80%) हैं, और ये कैंसर काफी जैविक विषमता और परिवर्तनीय नैदानिक परिणाम 2,3,4 प्रदर्शित करते हैं। एनएमआईबीसी वाले रोगियों को आमतौर पर रोग पुनरावृत्ति (50-70%) के उच्च जोखिम का अनुभव होता है और एक तिहाई कैंसर प्रगति करेगा और काफी अधिक आक्रामक मांसपेशियों-आक्रामक मूत्राशय के कैंसर (एमआईबीसी) 2 में विकसित होगा। हालांकि NMIBC के लिए 5 साल की जीवित रहने की दर उच्च (>90%) है, इन रोगियों को दीर्घकालिक नैदानिक प्रबंधनसे गुजरना चाहिए। दूसरी ओर, स्थानीय रूप से उन्नत (अपरिवर्तनीय) या मेटास्टैटिक एमआईबीसी को आमतौर पर लाइलाज6 माना जाता है। नतीजतन, मूत्राशय के कैंसर में कैंसर की देखभाल के भीतर उच्चतम आजीवन उपचार लागतों में से एक है और यह व्यक्ति और स्वास्थ्य देखभाल प्रणालीदोनों के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ है। उन्नत बीमारी में अंतर्निहित आनुवंशिक विपथन मूत्राशय के कैंसर के चिकित्सीय प्रबंधन को एक नैदानिक चुनौती प्रदान करता है, और इनवेसिव यूरोथेलियल ट्यूमर के लिए चिकित्सीय विकल्प हाल ही में उन्नत और उच्च जोखिम वाले एनएमआईबीसी 8,9 दोनों के लिए इम्यूनोथेरेपी के अनुमोदन के बाद से सुधार हुआ है। वर्तमान में, नैदानिक निर्णय लेने को पारंपरिक नैदानिक और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं द्वारा निर्देशित किया गया है, व्यक्तिगत मूत्राशय के कैंसर के ट्यूमर के बावजूद रोग आक्रामकता और चिकित्सा10 की प्रतिक्रिया में बड़े अंतर दिखाते हैं। व्यक्तिगत रोगी के पूर्वानुमान और प्रभावी उपचारों की पहचान की भविष्यवाणी में सुधार करने के लिए नैदानिक रूप से उपयोगी मॉडल में अनुसंधान में तेजी लाने की तत्काल आवश्यकता है।
त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड्स ट्यूमर मॉडल के रूप में महान क्षमता दिखाते हैं क्योंकि विवो आर्किटेक्चर और फार्माकोजीनोमिक प्रोफाइल में मूल ट्यूमर के आंतरिक को आत्म-व्यवस्थित और पुन: व्यवस्थित करने और पुन: प्राप्त करने की उनकी क्षमता, और मूल ऊतक की मूल सेलुलर कार्यक्षमता को दर्पण करने की उनकी क्षमता जिसमें से उन्हें व्युत्पन्न किया गया था11,12,13 . यद्यपि स्थापित मूत्राशय कैंसर सेल लाइनें आसानी से उपलब्ध हैं, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी, स्केलेबल और हेरफेर करने के लिए सरल हैं, इन विट्रो सेल लाइनें काफी हद तक नैदानिक मूत्राशय के कैंसर12,14 में देखे गए विविध आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों के स्पेक्ट्रम की नकल करने में विफल रहती हैं और सभी 2 डी, अनुयायी संस्कृति स्थितियों के तहत स्थापित और बनाए रखी गई थीं। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक और मेटास्टैटिक मूत्राशय ट्यूमर से व्युत्पन्न सेल लाइनें मूल ट्यूमर सामग्री से महत्वपूर्ण आनुवंशिक विचलन को आश्रय देती हैं। 8,15.
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और कार्सिनोजेन-प्रेरित माउस मॉडल का उपयोग करना है। हालांकि, जबकि ये मॉडल मानव नियोप्लासिया में शामिल कुछ प्राकृतिक ऑन्कोजेनिक कैस्केड (संदर्भ16,17,18 में समीक्षा की गई) को दोहराते हैं, उनमें ट्यूमर विषमता की कमी है, महंगे हैं, खराब आक्रामक और मेटास्टैटिक मूत्राशय के कैंसर का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तेजी से अवधि के दवा परीक्षण के लिए व्यवहार्य नहीं हैं क्योंकि ट्यूमरको 14,19 विकसित करने में कई महीने लग सकते हैं। . कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न मॉडल (ऑर्गेनोइड्स सहित, सशर्त रूप से पुन: प्रोग्राम किए गए प्राथमिक सेल संस्कृति, और20) नैदानिक उपचार से पहले दवा उपचार के प्रभावों को समझने के लिए अमूल्य अवसर प्रदान करते हैं। इसके बावजूद, कुछ समूह नियमित रूप से ताजा प्राथमिक रोगी ऊतक तक सीमित पहुंच के कारण इन रोगी-समीपस्थ मॉडल का उपयोग करते हैं और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) संस्कृति की स्थिति को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक व्यापक अनुकूलन। एक इन विवो सेटिंग में, ऑन्कोजेनिक कोशिकाएं आसपास के घटकों की विभिन्न रचनाओं के साथ बातचीत और संवाद कर सकती हैं, जिसमें स्ट्रोमल कोशिकाएं, ऊतक घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाएं और मैट्रिक्स12 शामिल हैं। इसी तरह, 3 डी प्रारूप में उगाए गए पीडीओ के लिए, सेलुलर / मैट्रिक्स जटिलता को अन्य प्रासंगिक घटकों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। पीडीओ को तेजी से उत्पन्न किया जा सकता है और अक्सर21,22,23 परिमित जीवनकाल होने के बावजूद, बाद में उपयोग के लिए बड़े पैमाने पर पारित या क्रायोप्रिजर्व्ड किया जा सकता है। फार्माकोडायनेमिक्स (यानी, एक दवा की प्रतिक्रिया) का मूल्यांकन कई रीड-आउट का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें ऑर्गेनोइड व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लक्ष्यों या ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के लक्षण वर्णन शामिल हैं।
यहां, मूत्राशय के ट्यूमर (TURBT) के ट्रांसयूरेथ्रल लकीर या मूत्राशय (कट्टरपंथी सिस्टेक्टोमी) के सर्जिकल हटाने से एकत्र रोगी सामग्री से मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। पीडीओ उत्पन्न करने की विधि को आसानी से उपलब्ध गीली प्रयोगशाला सामग्री और उपकरणों का उपयोग करके सचित्र किया गया है। समापन बिंदु में सेल रूपात्मक विशेषताओं और व्यवहार्यता में परिवर्तन शामिल हैं। इन्हें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, इन विट्रो व्यवहार्यता (चयापचय और कोशिका झिल्ली अखंडता) assays, और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग करके मापा गया था। चित्रा 1 वैकल्पिक सर्जरी के दौरान प्राप्त नैदानिक सामग्री से मानव मूत्राशय के कैंसर पीडीओ की स्थापना के लिए वर्कफ़्लो दिखाता है।
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Protocol
ऑस्ट्रेलिया के ब्रिस्बेन के राजकुमारी एलेक्जेंड्रा अस्पताल में यूरोलॉजी टीम के तहत अपने प्रवेश के बाद रोगियों ने इस अध्ययन के लिए सहमति व्यक्त की है। यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुसार और नैतिक और संस्थागत दिशानिर्देशों के भीतर किया गया था (नैतिकता संख्या HREC / 05 / QPAH / 95, QUT 1000001165)।
नोट: पात्रता मानदंड के रूप में, रोगियों को कैंसर के साथ 18 वर्ष ≥ की आयु के थे, और समझने और सहमति प्रदान करने में सक्षम थे। जो लोग सूचित सहमति देने में सक्षम नहीं थे, उन्हें बाहर रखा गया था। अंग्रेजी के अलावा अन्य प्राथमिक भाषा रखने वालों को बाहर रखा गया था क्योंकि दुभाषियों का प्रावधान लॉजिस्टिक और बजटीय विचारों के कारण संभव नहीं था। इसके अलावा बाहर रखा गया रोगी थे जिनके ट्यूमर बायोप्सी के लिए सुलभ नहीं थे या नियमित विकृति के बाद पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध होने की संभावना नहीं थी।
1. Organoid मध्यम तैयारी
नोट: मानव मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड माध्यम के लिए विकास कारकों की आवश्यकता होती है जो अलग-अलग नैदानिक सामग्री से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के अस्तित्व, विकास और निरंतर विस्तार में सहायता करते हैं (तालिका 1)। इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पूरक के पूर्ण विवरण के लिए, कृपया सामग्री की तालिका देखें।
- बर्फ पर या 2-8 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में जमे हुए अवयवों को पिघलाएं। बार-बार फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से बचें और जमे हुए एलीकोट (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) से काम करें।
- बेसल माध्यम: उन्नत Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम / हैम के F-12 (adDMEM / F12) को HEPES (10 mM) और ग्लूटामाइन (2 mM) के साथ पूरक करके बेसल माध्यम तैयार करें। इसका उपयोग परिवहन माध्यम के रूप में भी किया जाता है, और ऑर्गेनोइड धोने के चरणों के दौरान।
नोट: उन्नत DMEM / F-12 का उपयोग सीमित सीरम की उपस्थिति में ऑर्गेनोइड्स के विस्तार में सहायता के लिए बेसल माध्यम के रूप में किया जाता है; हालांकि, इसे HEPES और L-glutamine के साथ पूरक की आवश्यकता होती है। - संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 10 (एफजीएफ -10), फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 2 (एफजीएफ -2), उपकला विकास कारक (ईजीएफ), एसबी 202190, प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 (पीजीई 2), और यह सुनिश्चित करने के लिए खोलने से पहले ए 83-01 कि घटक शीशी के तल पर हैं।
- पूर्ण ऑर्गेनोइड माध्यम: मानव नोगिन- और आर-स्पॉन्डिन 1-वातानुकूलित मीडिया के साथ पूरक बेसल माध्यम 5% वी / वी, मानव ईजीएफ (50 एनजी / एमएल), मानव एफजीएफ -2 (5 एनजी / एमएल), मानव एफजीएफ -10 (20 एनजी / एमएल), ए 83-01 (500 एनएम), एसबी 202190 (10 μM), बी 27 (1x), निकोटिनामाइड (10 μM), निकोटिनामाइड (10 mM) की अंतिम एकाग्रता पर 1-वातानुकूलित मीडिया के साथ पूरक बेसल माध्यम, 10 μM (10 μM), B27 (1x), निकोटिनामाइड (10 mM)
- अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्गेनोइड मीडिया स्टोर करें और 2 सप्ताह (अधिक से अधिक 1 महीने) के भीतर इसका उपयोग करें। फ्रीज न करें। प्रकाश स्रोतों के विस्तारित जोखिम से बचें।
नोट: ऑर्गेनोइड माध्यम सीरम-मुक्त तैयार किया जाता है; हालांकि, सीरम और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन को आवश्यकतानुसार उपयोगकर्ता-से-उपयोगकर्ता आधार पर पूरक किया जा सकता है।
2. 3 में उल्लिखित प्रक्रिया से एक दिन पहले
- 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे में उपयोग करने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए रात भर के लिए पिघलने वाले विकास कारक ने तहखाने की झिल्ली (बीएमई; सामग्री की तालिका देखें) को कम कर दिया। यदि आवश्यक हो, तो फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों से बचने के लिए 1.5 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन एकल-उपयोग ट्यूब में बीएमई को 1 एमएल एलीकोट में वितरित करें।
- फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे में रखें।
नोट: यह अनुभाग पिपेट युक्तियों को संदर्भित करता है जिनका उपयोग समय से पहले पोलीमराइजेशन को रोकने और युक्तियों की सतह पर बीएमई की कोटिंग को कम करने के लिए बीएमई को संभालते समय किया जाएगा। - प्रक्रिया के लिए आवश्यक सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
3. मूत्राशय ट्यूमर organoids की पीढ़ी
नोट:: यह प्राथमिक रोगी ट्यूमर से पीडीओ स्थापना के लिए एक प्रारंभिक कदम है। इस प्रक्रिया को Gao et al.24 द्वारा स्थापित तरीकों से मूत्राशय के कैंसर के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया है।
- नमूना तैयार करने के लिए एक वर्ग द्वितीय biohazard हुड का उपयोग करें। सूखी और गीली बर्फ पुनः प्राप्त करें और रोगी नमूना प्रसंस्करण शीट (पूरक फ़ाइल) प्रिंट करें।
- जब सर्जिकल लकीर के पास पूरा हो जाता है तो ऑपरेटिंग रूम में अनुसंधान कर्मियों को कॉल करें।
नोट:: पुष्टि करें कि रोगी पात्रता मानदंड को पूरा करता है और प्रतिभागी सहमति प्रपत्र पर हस्ताक्षर किए हैं। ऊतक केवल तभी अनुसंधान के लिए प्रदान किया जाता है जब नैदानिक हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए आवश्यकताओं के लिए अधिशेष हो। - सर्जरी से एक ताजा मैक्रोस्कोपिक रूप से व्यवहार्य ट्यूमर का नमूना इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि नमूना परिवहन माध्यम (या तो 1x adDMEM / F12 या 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS)) में एक बाँझ 50 mL शंक्वाकार ट्यूब या पारगमन के दौरान मूत्र नमूना जार में जलमग्न है।
नोट: कुछ नैदानिक केंद्रों में, ऊतक को अनुसंधान के लिए आवंटित करने के लिए पैथोलॉजी प्रयोगशाला में ले जाने की आवश्यकता हो सकती है। इन परिस्थितियों में, यह सिफारिश की जाती है कि एंटीबायोटिक्स और एंटीमाइकोटिक्स को परिवहन माध्यम में जोड़ा जाए। ऊतक को बेसल माध्यम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक की सर्जरी के बाद संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी व्यवहार्य ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को उत्पन्न करता है। - ऊतक वजन (जी या मिलीग्राम), नमूना विवरण, और रोगी नमूना प्रसंस्करण शीट (पूरक फ़ाइल) पर किसी भी रक्त और मूत्र के नमूनों के बारे में विवरण सहित नमूना विवरण रिकॉर्ड करें।
- परिवहन माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे बेसल मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें। ट्यूमर ऊतक गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने के लिए अनुमति दें।
नोट: परिवहन माध्यम को नैदानिक अपशिष्ट के रूप में माना जाता है और इसे उचित रूप से लेबल किए गए अपशिष्ट कंटेनर में उचित मात्रा में विसंदूषण समाधान में एकत्र किया जाना चाहिए। एक बार जब तरल को रासायनिक रूप से दूषित कर दिया जाता है, तो इसे खतरनाक अपशिष्ट के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार निपटाया जा सकता है। - संदंश के साथ ट्यूमर ऊतक को हटा दें और इसे एक बाँझ 90 मिमी पेट्री डिश (चित्रा 2 ए) में रखें। नैदानिक नमूना प्रसंस्करण शीट और विच्छेदन ग्रिड (चित्रा 2 बी) पर मिलीग्राम या जी में ऊतक के वजन को रिकॉर्ड करें।
- गैर-कैंसर ऊतक (वसा ऊतक सहित) और मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वाले नेक्रोटिक क्षेत्रों को बाँझ संदंश और डिस्पोजेबल स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके स्केलपेल हैंडल (चित्रा 2 सी) पर माउंट किया गया निकालें। ठंडे 1x DPBS के साथ ट्यूमर के टुकड़ों को 1-2 बार धोएं। ट्यूमर के टुकड़े ले लीजिए और उन्हें एक नई बाँझ 90 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरित करें।
नोट: जैसा कि स्केलपेल ब्लेड तेज होते हैं, मैन्युअल रूप से स्लाइसिंग करते समय सावधानी बरतें। ट्यूमर-आसन्न वसा ऊतक को दृश्य ट्यूमर परिधि के तुरंत बगल में स्पष्ट रूप से नरम, जिलेटिनस, पीला क्षेत्रों द्वारा पहचाना जा सकता है। मैक्रोस्कोपिक वसा ऊतक, और परिगलन के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले फोकल रूप से अंधेरे क्षेत्रों को एक उच्छेदन मूत्राशय ट्यूमर बायोप्सी से विच्छेदन करते समय व्यक्तिगत निर्णय की आवश्यकता होगी। - एक तस्वीर लें, ऊतक का एक आरेख बनाएं, और एक नैदानिक प्रसंस्करण ग्रिड (चित्रा 2 बी और चित्रा 2 सी) पर ऊतक विच्छेदन की योजना बनाएं।
नोट: प्रत्येक विशिष्ट मामले के लिए व्यक्तिगत मैक्रोस्कोपिक ट्यूमर विशेषताओं और विच्छेदन का एक दृश्य रिकॉर्ड और किसी न किसी स्केच को रखना महत्वपूर्ण है। - ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों को विच्छेदित करें और हिस्टोपैथोलॉजिकल (चित्रा 2 डी) और आणविक विश्लेषण (चित्रा 2 ई) के लिए आवंटित करें।
- हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए: लगभग 50 मिलीग्राम ट्यूमर ऊतक को लेबल किए गए डिस्पोजेबल प्लास्टिक हिस्टोलॉजी कैसेट (चित्रा 2 डी) में रखें। 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन (NBF) के 5x से 10x मात्रा के साथ एक कंटेनर में हिस्टोलॉजी कैसेट को डुबोएं। RT पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- 10% NBF निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए अगले दिन 70% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) इथेनॉल के साथ बदलें जब तक कि ऊतक को नियमित ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित नहीं किया जा सकता है
- आणविक विश्लेषण के लिए: स्नैप तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके कम से कम एक1-3 मिमी 3 ट्यूमर के टुकड़े को एक RNase / DNase-मुक्त 1.5 mL क्रायोवियल में फ्रीज करें और -80 °C (चित्रा 2E) पर स्टोर करें।
- शेष ट्यूमर टुकड़ा (एस) युक्त 90 मिमी पेट्री डिश में ऑर्गेनोइड माध्यम (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर वितरित करें।
- यंत्रवत् रूप से कीमा ऊतक के रूप में संभव के रूप में बारीक (0.5-1 मिमी3 टुकड़े या छोटे) एक बाँझ # 10 scalpel ब्लेड के साथ।
नोट: बड़े टुकड़े या ऊतक के पूरे टुकड़े (>3 मिमी3) को पचाने में काफी अधिक समय लगेगा और नमूने की व्यवहार्यता को कम कर देगा। उपरोक्त चरण को छोड़ दें यदि ऊतक अलग-अलग है और टुकड़े 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट टिप के साथ पिपेट करने के लिए पर्याप्त छोटे हैं। - एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए बारीक कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण और organoid माध्यम के 4 मिलीलीटर, 10x कोलेजनेज / hyaluronidase के 1 mL, और 0.1 मिलीग्राम / mL deoxyribonuclease 1 (DNase 1) सेल clumping से बचने के लिए जोड़ें।
नोट: एंजाइम समाधान हर बार ताजा तैयार किया जाना चाहिए। बड़े नमूनों के लिए ट्यूमर के टुकड़ों की दृश्यमान मात्रा लगभग 10x होने के लिए माध्यम की मात्रा में वृद्धि करें। - एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में एक कक्षीय शेकर या रोटेटर (150 आरपीएम) पर1-2 घंटे के लिए कीमा बनाया हुआ ट्यूमर ऊतक और एंजाइम समाधान इनक्यूबेट करें ताकि टुकड़े को सेल निलंबन में अलग किया जा सके और कोलेजन को तोड़ दिया जा सके। यह हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3 ए) के साथ जांचा जा सकता है।
नोट: यदि ऊतक की मात्रा बड़ी है या 1-1.5 घंटे के बाद कोई स्पष्ट पृथक्करण नहीं देखा जाता है, तो हर 30 मिनट में पृथक्करण के स्तर की जांच करने के इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं। इस चरण के लिए समय नमूने पर निर्भर करता है और हर बार अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। आंखों (या बहुत कम टुकड़े) के लिए अस्पष्ट ऊतक के टुकड़ों के साथ एक उल्लेखनीय रूप से स्पष्ट समाधान सफल पाचन को इंगित करता है। - नमूने के लिए बेसल माध्यम के 2x मात्रा (20 मिलीलीटर) के अलावा के साथ पाचन समाप्त करें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 261 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और supernatant को त्याग दें।
- लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को दूषित करने के लिए, अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) बफर के 5 मिलीलीटर में उपरोक्त चरण से प्राप्त गोली को फिर से निलंबित करें। 3 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें या जब तक आरबीसी का पूरा लाइसिस नहीं देखा जाता है (निलंबन स्पष्ट हो जाता है)।
नोट:: यदि RBCs गोली में एक छोटे से लाल clump के रूप में नहीं मनाया जाता है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है। - ट्यूब में बेसल माध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें। RT पर 5 मिनट के लिए 261 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant aspirate करें।
- इस चरण में, गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2x और 1x ऑर्गेनोइड माध्यम का 10 मिलीलीटर ऐलीकोट रखें।
- बड़े अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए एक नए 50 एमएल ट्यूब में एक पूर्व गीला प्रतिवर्ती 100 μm छलनी के माध्यम से नमूना फ़िल्टर करें।
नोट: फ़िल्टर द्वारा एकत्र की गई बड़ी अपाचित सामग्री (>100 μm) में ब्याज की कोशिकाएं हो सकती हैं और 90 मिमी पेट्री डिश या ऑर्गेनोइड माध्यम में 6-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में 2 डी संस्कृतियों (चित्रा 1 (चरण 5) और चित्रा 3 बी) को प्राप्त करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। - एकल कोशिका और प्रतिरक्षा सेल अलगाव (ट्यूब 37-1) के लिए एकल कोशिकाओं और छोटे समूहों को इकट्ठा करने के लिए एक पूर्व-गीला प्रतिवर्ती 37 μm छलनी के माध्यम से एल्यूएट को फ़िल्टर करें; चित्र 1 (चरण 6) और चित्रा 3B)।
नोट: इस चरण के दौरान ट्यूमर कोशिकाओं की उपज को फिर से छलनी के माध्यम से फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन को पारित करके बढ़ाया जा सकता है। - 37 μm छलनी रिवर्स और छोटे और मध्यम आकार के समूहों (37-100 μm) (ट्यूब 70-1) को इकट्ठा करने के लिए बेसल मीडिया के 10 मिलीलीटर का उपयोग करें; चित्रा 3B)।
- DPBS के साथ 40 mL के साथ नए 50 mL ट्यूबों (ट्यूब 70-1 और 37-1) में से प्रत्येक को ऊपर उठाएं। RT पर 5 मिनट के लिए 261 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। Aspirate और supernatant को छोड़ दें।
- 37-1 ट्यूब के लिए बेसल मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें और trypan नीले बहिष्करण डाई और एक स्वचालित सेल काउंटर (निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार) का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती। कक्ष संख्या और कक्षों की व्यवहार्यता निर्धारित करें.
- RT पर 5 मिनट के लिए 261 x g पर शेष नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे सेल फ्रीजिंग समाधान या बेसल मीडिया के साथ बदलें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) शामिल हैं।
- 1.5 एमएल क्रायोवल में नमूने रखें और उन्हें सेल-फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें। तुरंत कंटेनर को ठंडा करने की इष्टतम दर के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीजर भंडारण के बाद, क्रायोवियल्स को लंबी अवधि के भंडारण के लिए क्रायोजेनिक तरल या वायु चरण भंडारण (-196 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें।
- पूर्व गर्म 2x organoid माध्यम के 500 μL के साथ ट्यूब 70-1 से कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
नोट: सफल ऑर्गेनोइड प्रसार के लिए सीडिंग घनत्व उच्च होना चाहिए। ऑर्गेनोइड माध्यम की मात्रा और, बाद में, बीएमई को निस्पंदन चरण से अलग कोशिकाओं की संख्या पर अनुभवजन्य रूप से बदल दिया जाना चाहिए। यह चरण हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन के आधार पर एक प्रासंगिक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। - बर्फ-ठंडे P1000 बाँझ फ़िल्टर पिपेट युक्तियों के साथ कोशिकाओं में BME जोड़ें (2x ऑर्गेनोइड माध्यम के साथ 1: 1 अनुपात पर) और कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए धीरे से मिश्रण करें। जल्दी से और ध्यान से एक अल्ट्रा-कम अनुलग्नक फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट के कुओं के लिए पुनर्गठित कोशिकाओं / बीएमई मिश्रण के 100 μL पिपेट करें। 96-अच्छी तरह से प्लेट को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 20-30 मिनट के लिए ठोस करने के लिए रखें।
- बीएमई सेल निलंबन के शीर्ष पर 1x ऑर्गेनोइड माध्यम का 1: 2 अनुपात जोड़ें जो अनुभवजन्य रूप से मूल्यांकन की गई मात्रा पर निर्भर करता है। प्रासंगिक प्रारंभिक बिंदु में, पुनर्गठित कोशिकाओं / बीएमई मिश्रण के 100 μL के शीर्ष पर 1x ऑर्गेनोइड मध्यम मीडिया के 50 μL जोड़ें।
- संतुलित करने के लिए 20 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 96-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
- इनक्यूबेटर से सेल कल्चर प्लेट को बाहर निकालें और इसे माइक्रोस्कोप के चरण पर एक नमूना धारक पर इकट्ठा करें। चरण कंट्रास्ट या ब्राइटफील्ड सेटिंग्स के तहत नेत्रहीन organoids का आकलन करें।
नोट: छवियों को एक उल्टे चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप द्वारा सबसे अच्छा प्राप्त किया जाता है जो विभेदक हस्तक्षेप (डीआईसी) प्रकाशिकी, डिजिटल कैमरा और संबंधित सॉफ़्टवेयर से सुसज्जित होता है ताकि समापन बिंदु विश्लेषण की तैयारी में गोलाकार पीडीओ के गठन का निरीक्षण किया जा सके।- यदि अलग-अलग क्लस्टर दिखाई देते हैं, तो सेल कल्चर प्लेट को पहले24-72 घंटे में लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक ऑनस्टेज इलेक्ट्रॉनिक रूप से गर्म माइक्रोस्कोप चैंबर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखें।
- सुनिश्चित करें कि लचीला गर्म कॉलर थर्मल बहाव को कम करने के लिए लेंस से जुड़ा हुआ है और ह्यूमिडिफायर डीएच2ओ से भरा हुआ है।
- एक 4x या 10x उद्देश्य लेंस (N.A. 0.30, W.D. 15.2 मिमी) का उपयोग करके प्रारंभिक इमेजिंग निष्पादित करें। चरण-कंट्रास्ट सेटिंग पर हर 5-10 मिनट में टाइम-लैप्स।
- सफल अलगाव के लिए जाँच के रूप में एक 24-72 घंटे की अवधि के बाद अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से >10 स्व-आयोजन organoids की उपस्थिति की विशेषता के रूप में.
- संस्कृतियों को दो सप्ताह तक जारी रखने की अनुमति दें यदि ऑर्गेनोइड संख्या कम है (चित्रा 3 सी)।
- कम विकास कारकों और समग्र मात्रा को फिर से भरने के लिए पूर्व-गर्म ऑर्गेनोइड माध्यम के 50 μL का उपयोग करके हर 2-3 दिनों में माध्यम को ऊपर उठाएं।
- 1, 2, और 3 दिनों (समय-अंतराल श्रृंखला) पर और पासिंग से पहले (यदि लागू हो तो) दिनों 5, 7 और 10 पर छवियाँ (जैसा कि चरण 3.30 में वर्णित है) प्राप्त करें.
नोट: ऑर्गेनोइड्स (आमतौर पर गोल संरचनाओं के रूप में मनाया जाता है जहां आप व्यक्तिगत कोशिकाओं के किनारों को नहीं देख सकते हैं) आमतौर पर अलगाव की सफलता के आधार पर सेटअप के बाद 7-10 दिनों तक पारित होते हैं। passaging से पहले या बाद में, organoids साइटोटॉक्सिक्स या चिकित्सीय एजेंटों के साथ 6 दिनों तक इलाज किया जा सकता है और सेल व्यवहार्यता और cytotoxicity assays का उपयोग करके मापा दवा प्रतिक्रिया। वैकल्पिक रूप से, ऑर्गेनोइड्स को बीएमई (1 मिलीग्राम / एमएल डिस्पैज़ का उपयोग करके) और क्रायोप्रिजर्व्ड (बायो बैंक्ड) से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, आणविक परीक्षण के लिए तैयार किया जा सकता है, या हिस्टोलॉजिकल रूप से एम्बेडेड और मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 4)।
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Representative Results
मानव मूत्राशय के कैंसर के रोगी TURBT और सिस्टेक्टोमी ऊतकों से 3 डी ऑर्गेनोइड्स सफलतापूर्वक स्थापित किए गए थे। संक्षेप में, यह तकनीक 3 डी बहुकोशिकीय संरचनाओं के तेजी से गठन पर प्रकाश डालती है जो हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन, आणविक लक्षण वर्णन (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा) और दवा स्क्रीनिंग जैसे अन्य समापन बिंदु विश्लेषणों के लिए व्यवहार्य और उपयुक्त दोनों हैं। प्रक्रिया (चित्रा 1) के दौरान, हमारे निस्पंदन चरणों (चित्रा 1, चरण 1-6) के दौरान विभिन्न एलुएट्स को ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं (टीआईएल) के अलगाव और एकल सेल बायोबैंक की पीढ़ी के लिए क्रायोप्रिजर्व करने के लिए एकल कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्व करने का लाभ उठाया जा सकता है। यह प्रक्रिया एक विषम प्राथमिक ट्यूमर के कई पहलुओं को उचित रूप से और एक तरह से बायोबैंक करने की अनुमति देती है जिसे रोगियों (चित्रा 2 ए, बी) में ट्रैक किया जा सकता है, जिसमें हिस्टोलॉजी (चित्रा 2 सी, डी) और ताजा जमे हुए नमूने (चित्रा 2 ई) शामिल हैं।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेजेनेस / हाइलूरोनिडेज़ और डीएनएस 1 के साथ एक 2 एच पाचन अधिक जटिल सिस्टेक्टोमी बायोप्सी ऊतक के 0.5-1 मिमी3 टुकड़ों के पर्याप्त पाचन के लिए अनुमति देता है, जिसमें लामिना प्रोपरिया और मूत्राशय की मांसपेशियों की परतों के भीतर नियोप्लास्टिक कोशिकाएं शामिल हैं (चित्रा 3 ए)। बड़े पोस्ट-पाचन टुकड़े (>100 माइक्रोन) उपन्यास 2 डी संस्कृतियों (चित्रा 3 बी) के अलगाव के लिए किसी भी आकार के मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों में संस्कृति के लिए उपयुक्त साबित हुए हैं। हालांकि, इस तरह की सेल लाइनों के कैंसर की उत्पत्ति को मान्य करने के लिए व्यापक आणविक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ सफलतापूर्वक उत्पन्न होने वाले ऑर्गेनोइड्स गतिशील स्व-असेंबली की प्रक्रियाओं से गुजरते हैं, जिसमें एकत्रीकरण, संघनन और अंतिम गठन के चरण शामिल हैं, जिससे वे तंग सेलुलर संरचनाओं (चित्रा 3 सी) में बनते हैं जिन्हें मानक-देखभाल उपचारों की प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। चित्रा 3 सी ऑर्गेनोइड्स के कुशल स्व-असेंबली गुणों पर प्रकाश डालता है। हिस्टोलॉजिकल रूप से, ये संरचनाएं मूल रोगी ट्यूमर (चित्रा 4) को दोहराती हैं। इस प्रक्रिया में उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स उद्देश्यों की एक भीड़ के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें आगे के लक्षण वर्णन, बायोबैंकिंग और दवा प्रभावकारिता परीक्षण (चित्रा 5) शामिल हैं।
चित्रा 1: सर्जरी से अंतिम बिंदु विश्लेषण करने के लिए ट्यूमर के नमूनों के संग्रह से organoid ऊतक संस्कृति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. URN, इकाई रिकॉर्ड संख्या; टीआईएल, ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट। (1) ऊतक यंत्रवत् एक 90 मिमी पेट्री पकवान में एक बाँझ scalpel ब्लेड (0.5-1 मिमी3 टुकड़े) के साथ संभव के रूप में बारीक के रूप में कीमा बनाया जाता है। (2) ट्यूमर के टुकड़ों को एक एंजाइमेटिक पृथक्करण माध्यम में फिर से निलंबित किया जाता है जिसमें ऑर्गेनोइड माध्यम, कोलेजेनेस / हाइलूरोनिडेज़ और डीएनएस 1 शामिल होते हैं। (3) कीमा बनाया हुआ ट्यूमर ऊतक और एंजाइम समाधान एक रोटेटर इनक्यूबेटर (150 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) पर1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है और बाद में एक महीन सेल निलंबन में टुकड़ों को अलग करने के लिए पैलेट (4) किया जाता है। नमूना पूर्व गीला प्रतिवर्ती (5) 100 μm और (6) 37 μm strainers के माध्यम से निस्पंदन से गुजरता है नए 50 mL ट्यूबों में बड़े अघुलनशील सामग्री को हटाने और 37-100 μm समूहों को अलग करने के लिए। निम्नलिखित (7) 37 μm छलनी के रिवर्स से अलग अंश के centrifugation, सेल क्लस्टर (8) BME और organoid मीडिया में निलंबित कर रहे हैं (9) लाइव सेल इमेजिंग से पहले. BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: ऑर्गेनोइड स्थापना के लिए बाँझ ट्यूमर ऊतक हैंडलिंग। (ए) उच्छेदन और प्रयोगशाला में परिवहन पर, नमूने को एक बाँझ पेट्री डिश में रखा जाता है, वजन किया जाता है, और बाद में विच्छेदित किया जाता है। (बी) विभिन्न प्रक्रियाओं के लिए नमूने को चिह्नित करने के लिए एक नमूना विच्छेदन ग्रिड का उपयोग किया जाता है। विच्छेदन का एक उदाहरण (सी) में दिखाया गया है जहां केंद्रीय परिगलन के क्षेत्रों से बचने के लिए जितना संभव हो सके ट्यूमर परिधि से नमूने लिए जाते हैं और ऊतक निर्धारण से पहले (डी) ऊतक को सकल करने से पहले (डी) से पहले एनोटेट (इनसेट) किया जाता है। स्केल बार: 6 मिमी. इनसेट स्केल बार: 4 मिमी (ई) छोटे ताजा टुकड़े बाद में ठंड और बायोबैंकिंग के लिए लिए जाते हैं। स्केल बार: 5 मिमी. इस छवि के तत्वों को BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एंजाइमेटिक व्युत्पत्ति और मूत्राशय ट्यूमर organoids की गतिशील विधानसभा. (A) hematoxylin और eosin (H & E) दाग माता पिता के मूत्राशय के कैंसर ऊतक (विकृति T3bN0 के रूप में समीक्षा की गई) तत्काल निर्धारण (बाएं) पर और 1x कोलेजनेस / hyaluronidase (दाएं) के साथ 2 ज पोस्ट-पाचन के प्रतिनिधि चित्र। स्केल बार: 500 μm. इनसेट स्केल बार: 50 μm. (बी) >100 μm, 37-1 और 70-1 (दिन 2) अलगाव की प्रतिनिधि छवियां। स्केल सलाखों को छवि के भीतर इंगित किया जाता है। (सी) प्रतिनिधि छवियों को मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए 48 घंटे और दिन 7 ऑर्गेनोइड एच एंड ई स्टेनिंग से अधिक दिखाया गया है। स्केल बार: 50 μm. इनसेट में छवि के लिए स्केल बार: 20 μm. DIC: विभेदक हस्तक्षेप विपरीत। इस छवि के तत्वों को BioRender.com के साथ बनाया गया था कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: मूत्राशय के कैंसर-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियां माता-पिता के ट्यूमर की हिस्टोलॉजिकल वास्तुकला को बनाए रखती हैं। निम्न-ग्रेड मूत्राशय के कैंसर (टीए) की प्रतिनिधि एच एंड ई छवि और संस्कृति के दिन 7 पर ऑर्गेनोइड की इसी उज्ज्वल-क्षेत्र छवि। दूर-दाएं पैनल दिन 7 ऑर्गेनोइड के संबंधित एच एंड ई धुंधला दिखाता है। स्केल सलाखों को चित्र में दर्शाया गया है। एलजी: कम ग्रेड, बीसी: मूत्राशय के कैंसर, एच एंड ई: हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन, और डीआईसी: विभेदक हस्तक्षेप विपरीत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: मूत्राशय के कैंसर रोगी व्युत्पन्न organoids के साथ डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों. BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| योज्य | अंतिम Conc. | स्टॉक कॉन्क. | विलायक | |
| बेसल मीडिया | ग्लूटामैक्स | 2 mM | 1 मीटर | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 मीटर | NaCl/NaHPO4 बफ़र्ड समाधान | |
| पूर्ण मीडिया के लिए पूरक | R-spondin 1 वातानुकूलित मीडिया | 5% v/v | वातानुकूलित मीडिया | उन्नत DMEM/ |
| Noggin वातानुकूलित मीडिया | 5% v/v | वातानुकूलित मीडिया | उन्नत DMEM/ | |
| EGF | 50 ng/mL | 0.5 mg/mL | PBS/0.1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS/0.1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS/0.1% BSA | |
| निकोटिनामाइड | 10 mM | 1 मीटर | 8.2 mL ddH20 में 1 g | |
| एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन | 1.25 mM | 500 mM | 40 mL ddH20 | |
| एक 83-01 | 0.5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 additive | 1X | 50x | ||
| प्रोस्टाग्लैंडीन E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin | 100 μg/mL | 50mg/mL | ||
तालिका 1: पूरक बेसल और पूर्ण organoid मीडिया के लिए इस्तेमाल किया
पूरक फ़ाइल: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
जबकि मूत्राशय के कैंसर के ऊतकों से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल अभी भी अपने बचपन में हैं, वे सक्रिय अनुसंधान और नैदानिक जांच का एक क्षेत्र हैं। यहां, मूत्राशय के कैंसर पीडीओ को सफलतापूर्वक स्थापित करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल जो एनएमआईबीसी और एमआईबीसी नमूनों दोनों के लिए उपयुक्त है, विस्तृत है। यह वर्कफ़्लो अस्पताल-आधारित नैदानिक परीक्षणों में समानांतर रूप से एकीकृत करता है और हिस्टोलॉजिकल नमूना प्रसंस्करण और ताजा जमे हुए ऊतक बैंकिंग सहित बायोबैंक नमूना संचय पर विचार करता है, जो नैदानिक ऑर्गेनोइड पाइपलाइनों के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। यह प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों पर बनाता है और एक ऑर्गेनोइड परिशुद्धता दवा पाइपलाइन बनाने के लिए एक समेकित पद्धति प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल की वर्तमान सफलता दर - दूसरों की तरह - लगभग 70% 25 है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह अलगाव तकनीकों और मूत्राशय के कैंसर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के लक्षण वर्णन के रूप में सुधार होगा। जैसा कि अपेक्षित था, प्रारंभिक नमूने की गुणवत्ता सफलता दर को प्रभावित करती है और एक महत्वपूर्ण सीमित कदम है। कीमोथेरेपी भोले रोगियों से प्राप्त नमूने उच्चतम सफलता दर प्रदान करते हैं, जबकि जिन रोगियों ने नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी प्राप्त की है, उनमें व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या26,27 हो सकती है। आमतौर पर, मूत्राशय के कैंसर के नमूने (TURBT और cystectomies दोनों से) उच्च ट्यूमर सेलुलरता के साथ नमूनों की पर्याप्त मात्रा प्रदान करते हैं। यह 24-72 घंटे की वृद्धि अवधि के भीतर 30-100 μm के बीच ऑर्गेनोइड्स की मजबूत पीढ़ी की अनुमति देता है (कुछ <40 μm क्लस्टर को निस्पंदन चरणों में बनाए रखा जाता है)। महत्वपूर्ण रूप से, ऑर्गेनोइड नमूनों (यानी, सिस्टिक संरचनाओं और अधिक घने संरचनाओं) में देखी गई विषमता इंगित करती है कि यह प्रोटोकॉल विषम ट्यूमर सेल आबादी को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त स्थिति प्रदान करता है।
हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल को सीमित प्रारंभिक सामग्री पर किया जा सकता है (जैसा कि कुछ वैकल्पिक सर्जरी से होता है, जिसमें TURBT प्रक्रियाएं या नैदानिक परीक्षण पर रोगियों से प्राप्त नमूने शामिल हैं), नमूना मूल्य को अधिकतम करने के लिए कई विश्लेषणों को शामिल करने में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में ब्याज की बाहरी ट्यूमर कोशिकाओं से 2 डी संस्कृति को विकसित करने के चरणों का वर्णन करने के तरीके शामिल हैं जो प्रारंभिक निस्पंदन चरण के दौरान संसाधित बड़े अघुलनशील ऊतकों में रह सकते हैं। अन्य शोध समूहों की तरह जो सर्जरी के बाद24 घंटे के भीतर नमूनों को संसाधित करने का सुझाव देते हैं 28,29, यह देखा गया है कि ऊतक हाइपोक्सिया जो इस समय सीमा के भीतर होता है, व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने से नहीं रोकता है। अनुकूलन सेल (देशी समूहों) अच्छी तरह से सीडिंग के घनत्व को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। हमारे अनुभव में, समूहों की अत्यधिक संख्या के परिणामस्वरूप संस्कृतियों का खराब विकास हो सकता है, जबकि कम दृश्य घनत्व वाली संस्कृतियां कोशिका मृत्यु का कारण बन सकती हैं। यह उपयोगकर्ता द्वारा उनके वॉल्यूम के संदर्भ में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है जिसे आवश्यक रूप से एक सीमा के भीतर पतला किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, TURBT नमूनों में अक्सर लकीर प्रक्रिया के कारण जले हुए किनारे होते हैं, जो प्रमुख नेक्रोटिक क्षेत्रों के रूप में स्पष्ट होते हैं। एक महत्वपूर्ण कदम मैक्रोस्कोपिक ट्यूमर ऊतक और बाद के विच्छेदन का सावधानीपूर्वक अलगाव है। यह व्यवहार्य संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है और सर्जिकल टीम के साथ संवाद करने की आवश्यकता है। कुछ उदाहरणों में, यह प्रक्रिया के लिए एक प्रारंभिक सीमा हो सकती है।
वर्तमान तकनीक के लिए एक अतिरिक्त सीमा ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की अनुपस्थिति है जो ऑर्गेनोइड्स के समानांतर है। सेलुलर जटिलता को बढ़ाने और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (यानी, स्ट्रोमा और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) के अन्य घटकों को प्रदान करने के लिए एक आवश्यक विकास भविष्य की सह-संस्कृति प्रणाली होगी। जैसा कि ऑर्गेनोइड्स को उनके विकास को आत्म-बनाए रखने की क्षमता के साथ आत्म-आयोजन संरचनाओं के रूप में परिभाषित किया गया है, असतत कैंसर स्टेम-कोशिकाओं (जैसे सीडी 44 और सीडी 4 9) को स्पष्ट करने के लिए आगे के काम की आवश्यकता होगी, जो इन विट्रो विकास विशेषताओं में सुधार की अनुमति दे सकते हैं 31,32,33। निश्चितता के साथ स्थापित करना कि पीडीओ ट्यूमर ऊतक से उत्पन्न होते हैं, महत्वपूर्ण है, क्योंकि कार्यात्मक और आणविक विश्लेषण में सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं से योगदान दवा प्रतिरोध में जांच को भ्रमित करेगा। कभी-कभी पीडीओ में यूरोथेलियल कोशिकाओं की ट्यूमर उत्पत्ति मेटास्टैटिक ऊतक या पैपिलरी ट्यूमर के उपयोग के कारण स्पष्ट होती है (जैसा कि यहां मामला है; चित्रा 4 देखें), लेकिन जब स्रोत ऊतक मूत्राशय के म्यूकोसा से उत्पादित होता है और इस प्रकार सौम्य यूरोथेलियम के मार्जिन होते हैं, तो यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि परिणामी पीडीओ आणविक तकनीकों का उपयोग करके ट्यूमर कोशिकाओं से मिलकर बने हैं। इस प्रकार, स्थापित ऑर्गेनोइड्स और प्राथमिक ट्यूमर के बीच इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और जीनोमिक तुलना की आवश्यकता होती है, जिससे वेव्युत्पन्न हुए थे।
प्रति अच्छी तरह से ऑर्गेनोइड्स की संख्या और आकार वितरण के बारे में, साइटोटॉक्सिसिटी विश्लेषण के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड्स के समान चढ़ाना घनत्व को बनाए रखना मुश्किल है। यह फिल्टर का उपयोग करके परिभाषित श्रेणियों को अलग करके थोड़ा कम किया जाता है, लेकिन यह अभी भी एक सीमा है यदि छोटे समूहों और बड़े ऑर्गेनोइड्स को एक ही कुएं में अलग किया जाता है। बड़े कण सॉर्टर्स इस मुद्दे को कम कर सकते हैं लेकिन चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। फिर भी, उपचार से पहले और बाद में व्यवहार्यता संकेतों को मापने वाली तकनीकों का उपयोग मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स34 में सफलतापूर्वक किया गया है। जैसे-जैसे यह तकनीक आगे बढ़ती है, यह शोधकर्ताओं को अलग-अलग जीनोमिक प्रोफाइल के साथ मूत्राशय के कैंसर पीडीओ की एक लाइब्रेरी विकसित करने में सक्षम करेगा, और फार्माकोडायनेमिक प्रतिक्रियाएं जिन्हें उपन्यास उपचारों की जांच करने के लिए खोजा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित नमूना संग्रह प्रक्रिया और पृथक्करण विधि ट्यूमर स्थानिक प्रोफाइलिंग, मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए समवर्ती तैयारी की अनुमति देती है। एक साथ लिया गया, यह शक्तिशाली समापन बिंदुओं की एक विविध श्रृंखला के लिए अनुमति देता है जिसे रोगी के ट्यूमर की विषमता और इम्यूनोथेरेपी जैसी दवाओं की प्रयोज्यता का पता लगाने के लिए एक साथ लाया जा सकता है।
संक्षेप में, हम सटीक दवा समापन बिंदु के आगमन में 3 डी रोगी-व्युत्पन्न मूत्राशय कैंसर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृतियों को स्थापित करने और मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां वर्णित कदम और नोट्स हमारी प्रयोगशाला में मूत्राशय के कैंसर पीडीओ को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नियमित दृष्टिकोण हैं। हमारी प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम को मूल रूप से प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के लिए वर्णित किया गया था और अब मूत्राशय के कैंसर की संस्कृति के लिए उपयुक्त साबित हुआ है। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रोटोकॉल केंद्रीकृत है, प्रयोगशालाओं में नियमित उपयोग के लिए उपयुक्त है, और मोटे तौर पर यूरोलॉजिकल कैंसर प्रकारों में लागू होता है। उच्च निष्ठा आणविक phenotyping और दवा प्रतिक्रिया समापन बिंदु के साथ संयोजन में, यह तकनीक तेजी से मूत्राशय कैंसर रोगियों के सटीक चिकित्सीय प्रबंधन का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करेगा।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम Translational Research Institute Histology core और Biological Resource Facility की तकनीकी सहायता को स्वीकार करते हैं। इस शोध को राजकुमारी एलेक्जेंड्रा रिसर्च फाउंडेशन पुरस्कार (I.V., E.D.W.), और मेडिकल रिसर्च फ्यूचर फंड (MRFF) रैपिड एप्लाइड रिसर्च ट्रांसलेशन प्रोग्राम (कैंसर के व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए केंद्र (CPAC) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था; E.D.W., I.V.)। ट्रांसलेशनल रिसर्च इंस्टीट्यूट को ऑस्ट्रेलियाई सरकार से समर्थन प्राप्त होता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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